PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MỐC APERGILLUSS NIGER CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PECTINASE CAO ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.95 MB, 68 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

Quảng Nam, tháng 4 năm 2015

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

LỜI CẢM ƠN

Trên thực tế khơng có sự thành cơng nào mà khơng gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ của người khác. Để hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến:

- Giáo viên hướng dẫn tôi, Th.S Phan Thị Thanh Diễm, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền niềm đam mê nghiên cứu khoa học để tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.

- Ban giám hiệu, các thầy cô trường Đại học Quảng Nam, đặc biệt là các thầy cô trong Khoa Lý – Hóa – Sinh đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm của mình cho chúng tơi trong suốt thời gian học tập và q trình làm khóa luận.

- Xin cảm ơn những lời động viên, khích lệ của bạn bè, đặc biệt là các bạn trong lớp DT122SSH01 đã góp ý, chia sẻ giúp tơi rất nhiều trong q trình thực hiện khóa luận.

Do trình độ cịn hạn chế về kiến thức cũng như kinh nghiệm nên trong q trình làm khóa luận tốt nghiệp khó tránh những thiếu sót, tơi rất mong được sự góp ý kiến của thầy cơ giáo để bài khóa luận của tơi được hồn chỉnh hơn.

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn và kính chúc q thầy cơ dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau.

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Thu Hà

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và chƣa đƣợc cơng bố trong

bất kì cơng trình nào khác.

Tác giả khóa luận

Lê Thị Thu Hà

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

DANH MỤC BẢNG

1.1 Hàm lượng pectin trong các loại trái cây 6

3.3 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

DANH MỤC VIẾT TẮT

PE : Pectinesterase PG : Polygalacturonase VSV : Vi sinh vật

Exo-PG : exo-poly 1,4-D-galacturonide PDA : Potato dextrose agar

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

DANH MỤC HÌNH Số hiệu

Số trang

1.1 Cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo của

3.1 Các đặc điểm hình thái của chủng Aspergillus niger 31 3.2 Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm mốc A. niger 33 3.3 Tốc độ sinh trưởng của chủng H5(A. Sau 36h, B. Sau 48h) 33

3.5 Sự phát triển của nấm mốc trong mơi trường có cơ chất là

3.13 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ của enzyme

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

MỤC LỤC

Phần 1. MỞ ĐẦU ... 1

1.1. Lí do chọn đề tài ... 1

1.2. Mục tiêu của đề tài ... 2

1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ... 2

1.4. Phương pháp nghiên cứu ... 2

Phần 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ... 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 3

1.1. Tổng quan về enzyme pectinase ... 3

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu ... 3

1.1.1.1. Các nghiên cứu trên thế giới ... 3

1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ... 4

1.1.2. Cơ chất của enzyme pectinase ... 5

1.1.3. Khái niệm enzyme pectinase ... 7

1.1.4. Cấu tạo enzyme pectinase ... 7

1.1.5. Đặc điểm của enzyme pectinase ... 7

1.1.5.1. Enzyme pectinase từ nguồn thực vật: ... 7

1.1.5.2. Enzyme pectinase từ vi sinh vật ... 9

1.1.6. Phân loại enzyme pectinase ... 12

1.1.7. Cơ chế tác động của enzyme pectinase ... 15

1.1.7.1. Pectinesterase (PE) ... 15

1.1.7.2. Protopectinase ... 15

1.1.7.3. Các enzyme khử mạch polymer ... 15

1.1.8. Các ứng dụng cơ bản của enzyme pectinase ... 16

1.1.8.1. Ứng dụng trong công nghiệp rượu vang ... 16

1.1.8.2. Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) và cô lập protoplast ... 19

1.4. Tổng quan về nấm Aspergillus niger ... 20

1.4.1. Giới thiệu chung ... 20

1.4.2. Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger ... 21

1.4.3. Cấu tạo cơ quan sinh sản ... 21

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 23

2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ... 23

2.1.1. Địa điểm, thời gian ... 23

2.1.2. Vật liệu nghiên cứu ... 23

2.1.3. Thiết bị, hoá chất ... 23

2.2. Phương pháp nghiên cứu ... 24

2.2.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu ... 24

2.2.2. Phương pháp phân lập ... 24

2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc ... 25

2.2.4. Phương pháp giữ giống ... 25

2.2.5. Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của các chủng nấm mốc thu được ... 25

2.2.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến sinh tổng hợp enzyme pectinase ... 25

2.2.7. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợp enzyme pectinase ... 26

2.2.8. Phương pháp xác định độ pH ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase ... 26

2.2.9. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase ... 26

2.2.10. Phương pháp xác định độ ẩm. ... 27

2.2.11. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase... 27

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 28

3.1. Phân lập nấm từ vỏ quả bưởi, cam và đất. ... 28

3.2. Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng nấm mốc Aspergillus niger phân lập được. ... 32

3.3. Khả năng sinh tổng hợp pectinase của các chủng nấm phân lập được. ... 33

3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp enzyme pectinase .... 34

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

3.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

DANH MỤC BẢNG

1.1 Hàm lượng pectin trong các loại trái cây 6

3.3 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

DANH MỤC VIẾT TẮT

PE : Pectinesterase PG : Polygalacturonase VSV : Vi sinh vật

Exo-PG : exo-poly 1,4-D-galacturonide PDA : Potato dextrose agar

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

DANH MỤC HÌNH Số hiệu

Số trang

1.1 Cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo của

3.5 Sự phát triển của nấm mốc trong mơi trường có cơ chất là

3.13 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ của enzyme

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

1

Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Lí do chọn đề tài

Enzyme là một trong những chế phẩm sinh học được quan tâm nhất hiện nay, bởi vai trò của nó hết sức quan trọng. Hiện nay enzyme đã được thu nhận và ứng dụng trong hầu hết các lĩnh vực mang lại hiệu quả thiết thực. Đặc biệt trong chế biến thực phẩm, chế phẩm enzyme đã được áp dụng để tạo ra sản phẩm có năng suất và chất lượng, rút ngắn thời gian sản xuất hạ được giá thành sản phẩm. Đối với nước ta ngành công nghệ thực phẩm rất phát triển, do vậy nhu cầu về enzyme phục vụ trong sản xuất rất lớn. Tuy nhiên, ở Việt Nam xưởng sản xuất chế phẩm enzyme rất ít, hàng năm nước ta vẫn phải nhập ngoại một khối lượng lớn những loại enzyme này (Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009b) [12]. Pectinase là nhóm enzyme xúc tác cho sự thủy phân các polymer pectin đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm cũng như xử lý chất thải và nhiều lĩnh vực khác. Ở Việt Nam, chế phẩm pectinase đã được sử dụng khá phổ biến và được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu (Lê Văn Nhương et al., 1978; Phí Quyết Tiến, 1999; Huỳnh Ngọc Oanh và Trần Ngọc Hùng, 2008) [12]. Tuy nhiên việc nghiên cứu thu nhận enzyme pectinase còn rất hạn chế. Trong khi đó enzyme pectinase được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến trái cây nhằm mục đích gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng dịch quả và có tác dụng làm trong nước trái cây cũng như làm trong rượu vang.

Vì vậy việc nghiên cứu đặc điểm và thu nhận nguồn enzyme ở Việt Nam là vấn đề cần thiết, mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Bên cạnh việc thu nhận enzyme từ thực vật, thì enzyme pectinase được thu nhận từ vi sinh vật là nguồn thu chủ yếu và được sử dụng rộng rãi. Nấm mốc được biết đến như nguồn phổ biến nhất cho sản xuất enzyme này. Mặc dù vậy, không phải tất cả nấm mốc đều có khả năng sinh enzyme như nhau và ngay cả những dòng cùng một giống cũng khơng có khả năng sinh tổng hợp enzyme với hoạt tính tương đồng (Nguyễn Đức Lượng, 2004; Parenicova, 2000). Ở Việt Nam, nghiên cứu tổng

hợp các chế phẩm từ dịng Aspergillus nói chung cũng như Aspergillus niger nói

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

2

riêng mới dừng lại ở nghiên cứu thăm dò. Hoạt động của enzyme pectinase được biết đến chủ yếu nhờ vào tác động của enzyme này trên pectin có độ methoxyl hóa cao. Chính vì thế, các nguồn phụ phẩm giàu pectin không chỉ được sử dụng như cơ chất cảm ứng cho quá trình lên men sinh tổng hợp, mà các chủng vi sinh vật được phân lập từ nguyên liệu giàu pectin cũng cho thấy tiềm năng của chúng trong việc thu nhận enzyme này [3]. Với những ưu điểm mà enzyme pectinase mang lại cho ngành công nghiệp chế biến rượu vang, thì phân lập và tuyển chọn

các dịng Aspergillus niger có khả năng sinh enzyme là hết sức quan trọng và cấp

thiết. Vì lí do đó tơi chọn đề tài nghiên cứu là “Phân lập và tuyển chọn chủng

nấm mốc Apergilluss niger có khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase cao ứng dụng trong sản xuất rượu vang”.

1.2. Mục tiêu của đề tài

- Phân lập được một số chủng nấm mốc từ vỏ bưởi, vỏ cam, đất.

- Tuyển chọn được chủng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng sinh tổng

hợp enzyme .

- Xác định nguồn cơ chất cảm ứng thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp

cao nhất của chủng Aspergillus niger.

- Xác định được nhiệt độ tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzyme của

chủng Aspergillus niger.

- Xác định được độ pH tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzyme của

chủng Aspergillus niger.

1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Các dịng Aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợp

enzyme hoạt tính cao

- Phạm vi nghiên cứu: Các dòng Aspergillus niger bản địa được phân lập từ

các nguồn nguyên liệu giàu pectin ở thành phố Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam.

1.4. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp xử lí số liệu

- Phương pháp nghiên cứu tổng hợp, so sánh - Phương pháp thực nghiệm

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

3

Phần 2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về enzyme pectinase

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu

1.1.1.1. Các nghiên cứu trên thế giới

Pectinase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới với nhiều khía cạnh rất đa dạng, trong đó điều hồ sinh tổng hợp enzyme pectinase cũng được nghiên cứu và đựơc đăng trên nhiều tạp chí. Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng

enzyme pectinase được tiến hành nhiều trên đối tượng khác nhau như: Fusarium

oxysporum (Guevara, 1997), Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea (Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001), Penicillium viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993;

Taragano, 1997; Caltisho, 2000).[8, 11]

Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase đều là những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004). Nhiều cơng trình nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzyme pectinase của các chủng vi sinh vật như: Couri và công sự (1995) đã nghiên cứu “ Sự thao tác

gen trên chủng Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzyme phân

giải pectin “hay Solis (1997) đã “Cải thiện việc sản xuất pectinase dùng các thể

lai giữa các chủng Aspergillus”. [12]

Qua nghiên cứu các tác giả đều nhận thấy rằng các nguồn cacbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzyme pectinas. Enzyme pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên mơi trường có bổ sung pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu acid galacturonic hoặc glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997). [10]

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

4

Theo thời gian nguồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng enzyme pectinase cũng thay đổi. Vào những năm 90 các tác giả chủ yếu sử dụng các nguồn cacbon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987). Năm 2000, trong cơng trình nghiên cứu “Ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp

pectinase của Aspergillus japonicus 586”, Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều

nguồn cacbon vào cùng một môi trường nuôi cấy như: pectin và glucose, pectin và glycerol,...gần đây các nghiên cứu đều hướng tới sử dụng các phế liệu, các chất thải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzyme pectinase (Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002). [8,10]

1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Đã có nhiều đề tài nghiên cứu trong nước về enzyme pectinase, các hướng nghiên cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định, và ứng dụng enzyme pectinase trên đối tượng chủ yếu là vi nấm, đặc biệt từ

Aspergillus.

Có các cơng trình nghiên cứu như:

- Phân lập và sàng lọc một số chủng Aspergillus niger sinh pectinase từ một

số vỏ củ, quả ở thành phố Huế của thầy giáo Trần Quốc Dung, Nguyễn Thị Kim Cơ, Nguyễn Thị Sương, Nguyễn Thị Thu Chung - Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế - Phan Thị Thanh Diễm, Nguyễn Hoàng Lan Anh-Trường Đại học Quảng Nam.

- Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng pectinase ở một số chủng Bacillus- Đặng Thị Mai Phương.

- Nghiên cứu khả năng sinh pectin methylesterase từ một số dòng

Aspergillus niger được phân lập và tuyển chọn của Trần Thanh Trúc, Nguyễn

Văn Mười, Nguyễn Văn Thành, Dương Đỗ Thành Lân, Nguyễn Thị Kiều Linh, Lê Vương Hải Nguyệt, Lê Thị Ngọc Hiếu, Nguyễn Tấn Đạt, Võ Thị Kiên Hảo, Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân, Vương Tố Trinh 2012.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

5

1.1.2. Cơ chất của enzyme pectinase

Pectin là cơ chất của enzyme pectinase. Pectinase rất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt trong giới thực vật. Về phương diện hoá học, pectin là polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết α- 1,4 glucosid tạo nên. Các mạch bên của phân tử pectin gồm có rhamnose, arabinose, galactose và xylose. Các nhóm carboxyl* của acid galacturonic có thể được ester hố một phần bằng các nhóm methyl và được trung hịa một phần hay hồn toàn bằng các ion Na+ , K+hoặc NH4+, hay bị decacboxyl hố …

Cơng thức ngun của acid galacturonic: C6H10O7

Cơng thức cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo phân tử pectin được giới thiệu ở hình 1.1.

Hình 1.1. Cấu tạo của acid α-galacturonic và khung cấu tạo của pectin

Dựa vào loại biến đổi của khung sườn chính mà pectin được phân loại thành protopectin, acid pectic, acid pectinic, và pectin (Be Miller, 1986). [10] * Protopectin

Đây là dạng pectin nguyên thuỷ. Khi thuỷ phân giới hạn protopectin sẽ tạo ra pectin hay acid pectinic. Đơi khi, protopectin cịn là một thuật ngữ dùng để mô tả các hợp chất không tan trong nước được tìm thấy trong các mô thực vật (Kilara, 1982). Protopectin là thành phần quan trọng của các chất gian bào, làm

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

6

nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào thực vật với nhau. Dưới tác dụng của acid (dung dịch HCl 0.03%), enzyme protopectinase hay khi đun sôi, protopectin chuyển hố thành pectin hồ tan. [2, 10]

* Acid pectic ( acid polygalacturonic)

Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl không đáng kể. Dạng muối của acid pectic gọi là pectat.

* Acid pectinic

Acid pectinic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl cao. Dạng muối của acid pectinic gọi là pectinat (Kilara, 1982). Acid pectinic khi tồn tại riêng lẻ có một đặc tính rất độc đáo là hình thành dạng gel với đường và acid, hoặc với một số hợp chất khác như muối canxi (nếu hàm lượng methyl vừa đủ thấp). [2, 10]

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

7

1.1.3. Khái niệm enzyme pectinase

Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic,- galactose, metanol. Enzyme pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua dứa, cỏ ba lá. Trong các loại khác chỉ có enzyme pectinesterase. Chúng cũng có thể được chiết xuất từ nấm mốc. Couri và cộng sự (1995) đã

nghiên cứu “thao tác trên gen trên chủng Aspergillus nhằm tăng khả năng tổng

hợp các enzyme phân giải pectine. [11]

1.1.4. Cấu tạo enzyme pectinase

Pectin là polysaccharide dị thể, chủ yếu là một mạch chính gồm các gốc acid –α–D–1,4 galacturonic, liên kết với nhau bằng liên kết 1,4–O glucozic còn gọi là acid polygalacturonic hay acid pectic. Pectine hòa tan trong tự nhiên là ester metylic của acid pectic.

Trong thực tế không phải tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đường galactose cũng bị metyl hóa (tạo ester metylic), mà đơi khi một số nhóm –COOH bị decacboxyl hóa (khử CO2), một số nhóm –COOH thay thế -H bằng kim loại, cũng có lúc giữ nguyên dạng –COO. Người ta cho rằng protopectine là hợp chất giữa pectine và araban, galactose hay tinh bột. Trọng lượng phân tử từ 20.000 – 200.000 đvC.

1.1.5. Đặc điểm của enzyme pectinase

1.1.5.1. Enzyme pectinase từ nguồn thực vật:

* Pectinesterase:

- Trong thực vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enzyme PE. Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme.

- Cà chua chứa ít nhất hai loại PE. Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của q trình chín. Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

- Trong thịt quả chuối có hai isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lƣợng phân tử là 30kD, nhƣng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3. Các enzyme này hoạt động ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đƣa pH của dung dịch về 6,0. Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loại.

- Polyol có khối lƣợng phân tử thấp, nhƣ glycerol, sucrose, glucose, maltose và galactose.PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối lƣợng phân tử 36,kD, nhƣng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và 11,0, theo thứ tự. pH tối ƣu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0. [10]

- Trong thành phần của nhiều thịt quả khác cũng chứa hai isoenzyme, một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn, cịn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi bị tác động của protease. Độ ổn định của enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân tử enzyme. Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lƣợng là 51kD và 36kD, theo thứ tự.[10]

Hình 1.2. Cấu trúc của pectinesterase từ carrot

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

9

- Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi có cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3. Tuy nhiên, chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt.

* Polygalacturonase:

Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV. PG thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi khuẩn gây

bệnh, chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus

plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài Ascomycete, Phizopus arrchizus, và Fusarium osyporum. Tuy nhiên, trong thực tế, PG của

thực vật bậc cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín. [8]

Các enzyme PG trong cà chua chín tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là endo-enzyme.PG1 có khối lượng phân tử 84kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở nhiệt độ 78oC.PG2 có khối lượng phân tử 44kD và có khoảng 50% bị bất hoạt ở 57oC. PG1 có độ ổn định tối đa ở pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa ở pH 5,6.

Exo-PG thủy phân các đầu không khử của chuỗi polygalacturonic, tạo ra galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế. Sự thủy phân polymer này bị gián đoạn của sự tồn tại của các mạch nhánh trong cơ chất. Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với các exo-PG ở cà rốt và đào. Hoạt động của các exo-enzyme làm tăng nhanh sự tạo thành các nhóm khử và làm tăng chậm độ nhớt của dung dịch cơ chất. Sự phân hủy polyuronide trong q trình chín khơng gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme PG là có liên quan. [15]

1.1.5.2. Enzyme pectinase từ vi sinh vật

Nguồn giàu enzyme pectinase là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn.

Nấm mốc: Penicillium glaucum, P.ehrlichii, P.chrysogenum, P.expanam,

P.cilrimim, Aspergillus awamori, A.foetidus, A.niger, A.terrus, A.saitoi, A.aureus, A.oryzae, A.wentii, Fusarium moniliforme,…

Nấm men: Saccharomyces fragilis

Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella

aerogenes…

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

10

Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác của thực vật. khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ cùng các loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh quả và các bộ phận của thực vật. Người ta thường thu pectinase từ canh trường bề mặt hoặc từ canh trường bề sâu của nấm mốc. [8]

Các vi khuẩn và nấm men cũng tổng hợp được enzime này A.niger chủ yếu tổng hợp ra pectinnesterase.

Nấm men Sacch.fragilis dường như chỉ tạo ra endopectintraseliminase. Vi khuẩn Bac.polymyxa, Bac.species lại chủ yếu tạo ra transeliminase.

* Pectinesterase:

Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau: pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzyme polygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2,0 đến 6,5. Trái

lại ph tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6 đến 7,5 – 8.

Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 450C. Từ 55 đến 620C thì enzyme bị vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinesterase từ thực vật thượng đẳng cao hơn: từ 55 – 600C. [10]

Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có nhiệt

độ tối ưu là 30 – 45oC, PHopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62oC và từ thực vật (phopt=7,5-8, toopt= 55-60oC). Khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin. Ion natri và đặc biệt là ion canxi, cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ nấm mốc

cCnithyrium diplodiella và từ A.niger, trái lại các cation hóa trị 3 và 4 (thủy ngân

nitrat, chì nitrat, nhơm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase.

Ngoài ra, người ta đã thu được enzyme pectinesterase ở trạng thái đông thể và người ta cũng đã xác lập được rằng n-axit cuối trong phân tử enzyme là enylalanin.[11]

Pectinesterase của nấm mốc sẽ thủy phân trước nhất là nhóm methylester nằm ở giữa hai nhóm carboxyl tự do và enzyme sẽ thủy phân lần lượt cắt liên kết

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

11

ester dọc theo phân tử pectin. Hoạt động của pectinesterase phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hóa của pectin và tỷ lệ thuận vào mức độ ester hóa. Chẳng hạn, đối

với tác động của pectinesterase từ nấm mốc A.niger, cần thiết phải có pectin ester

hóa ở mức độ cao khơng ít hơn 70%.

* Polygalacturonase:

Hầu hết các nghiên cứu về polygalacturonase đều trên cơ sở các nguồn Vi sinh vật. Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào

của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: Saccharomyces fragilis,

Asperigillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochlibolus carbonum, Neurosrora crassa, các loài Ascomycete, Rhizopus arrchizus và Fusarium oxysrorum.

pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào nguồn thu và cơ chất. Chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa (endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ưu nằm trong khoảng từ 4,0 – 5,5. Cũng enzyme đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì lại có pH tối ưu trong khoảng 5,5 – 6. Còn polygalacturonase đường hóa khi tác dụng trên pectin thì pH tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6. [7, 12]

Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6

Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa bằng

thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5.

Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40 -450C. Trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vơ hoạt hóa khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 650C.

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

12

1.1.6. Phân loại enzyme pectinase

Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng: [7]

Bảng 1.2. Phân loại enzyme pectinase Stt Enzyme (tên gọi

Endopoly galacturonase (endo-PG)

Thủy phân liên kết galacturonid trong

1,4-D-galacturonid không theo một trật tự nào

Poly-1,4-D-galacturonidgalacturon-hydrolase

Exopoly galacturonase (exo-PG)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectat, trong galacturonic với sự đứt mạch của acid galacturonic

1,4-D-4

Poly-1,4-D-galacturonidmetilester-glycanohydrolase

galacturonase (Endo-PMG)

Endopolymetil-Thủy phân liên kết galacturonid trong pectin không theo một trật tự nhất định.

1,4-D-5

galacturonid digalacturonoliase

Poly-1,4-D-Exo-pectatliase (exo-PKTE)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectat với sự tạo thành 4,5

1,4-D-aciddegalacturonic không theo một trật tự nhất định.

galacturonid glicanoliase

Poly-1,4-D-Endopectatliase (PETE)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectat, trong alacturonic với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

-1,4-D-13

galacturonid metylester glicanoliase

Poly-1,4-D-Endopectinliase (Endo-PTE)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectin với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định

1,4-D-7

galacturonid metylester glicanoliase

Poly-1,4-D-Endopectinliase (Endo-PTE)

Thủy phân liên kết galacturonid trong pectin với sự tạo thành nối đôi không theo một trật tự nhất định

1,4-D-» Pectinesterase (PE)

Xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester. Enzyme thường tấn cơng vào các nhóm ester methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị ester hố, phân cắt các nhóm methoxy (COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau. Nếu thu từ nguồn VSV thì pH tối ưu từ 4,5-5,5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5. Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-40oC và bị vô hoạt ở 55-62oC. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion Ca2+ và Mg2+.

» Polygalacturonase

Cịn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết 1,4-glycosid. Các exo-PG (exo-poly 1,4-D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không khử, và endo-PG (endo-poly1,4-D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và vi khuẩn. Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng với cơ chất, enzyme polygalacturonase được chia làm bốn loại:

» Polymethylgalacturonase:

Còn gọi là 1,4-gaclacturonite methylesglucanohydrolase tác dụng trên polygalactorunic acid đã được ethoxyl hoá (tức là pectin). Enzyme này lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

thường bị giảm. Enzyme này rất phổ biến trong các VSV, đặc biệt là nấm mốc A.

niger, A. awamori.

» Pectate lyase (PEL)

Xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hoá. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4--D-galac turonide) lyase) và endo-PEL (endo-poly(1,4--D-galacturonic lyase) đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động. Pectate lyase khơng được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm. Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trị rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật. [1, 7]

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

1.1.7.1. Pectinesterase (PE)

Pectinesterase còn đƣợc gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử ester hoá nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic. Enzyme này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá. [14]

a. Enzyme thủy phân liên kết glycoside (Hydrolase)

* Polymethylgalacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao. Polymethylgalacturonase gồm 2 loại:

- Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin - Exo-PMG: phân cắt lần lƣợt liên kết α-1-4-glycosid của pectin từ đầu không khử của mạch pectin. [4, 10]

* Polygalacturonase(PG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic (acid polygalacturonic), gồm 2 loại:

- Endo-PG: còn gọi là poly (1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid trong phân tử acid pectic.

- Exo-PG: còn gọi là poly (1,4-α-D-galacturonide) glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử.

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

16

b. Enzyme cắt (Lyase):

Năm 1960, P.Abersheim, lần đầu tiên đưa ra thông báo về phân hủy phân tử pectin không bằng con đường thủy phân. Enzyme tham gia vào q trình đó gọi là pectate lyase. Cơ chế hoạt động của các enzyme lyase phân cắt pectin (pectate lyase) được đưa ra như sau: các pectate lyase sẽ đóng góp tối thiểu ba nhóm cấu trúc xúc tác: P+: vơ hiệu hóa lực hút của nhóm cacboxylic; B: là một căn cứ tách các proton từ C-5, và A: thực hiện công việc cuối cùng là chuyển giao các proton đến các oxy glycosidic, đểlại một liên kết đôi giữa C-4 và C-5. [3, 4]

Các enzyme lyase phân cắt pectin bao gồm:

* Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): Xúc tác phá vỡ liên kết glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hố cao, có hai loại:

α-1-4-- Endoα-1-4--PMGL: cịn gọi là poly (methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin.

- Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin.

* Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic. Có 2 loại:

- Endo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide)lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic.

- Exo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) exolyase, xúc tác phân cắt lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử.

1.1.8. Các ứng dụng cơ bản của enzyme pectinase 1.1.8.1. Ứng dụng trong công nghiệp rượu vang

Rượu vang được sản xuất chủ yếu từ nước ép nho, quá trình sản xuất rượu vang gồm 3 giai đoạn chủ yếu:

- Thu hoạch quả - Lên men dịch quả - Xử lí và tàng trữ

Bình thường để thu được dịch quả người ta phải nghiền nát quả. Khi nghiền sẽ thu được dịch quả và bã nghiền. Bã nghiền sau khi tách dịch được đem vào ép. Dịch chảy ra trước khi ép gọi là dịch tự chảy. Dịch tách ra sau khi ép gọi là dịch

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

17

ép. Thu được dịch quả đem làm trong rồi lên men.

Trong sản xuất rượu vang người ta cũng dùng chế phẩm pecinase để tăng

hiệu quả cũng như để làm trong rượu.

Các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất phải có những yêu cầu sau:

- Chế phẩm không được làm giảm chất lượng của vang, không được gây ảnh hưởng xấu đến hương vị và màu sắc của sản phẩm. Nghĩa là chế phẩm phải được làm sạch tới mức tối đa khỏi các tạp chất có ảnh hưởng xấu đến chất lượng vang.

- Chế phẩm được đưa vào dịch hay bã nghiền để tăng cường quá trình sơ chế quả, tăng nhanh và làm trong dịch, nâng cao tốc độ lọc, tăng hiệu quả chung và đặc biệt là hiệu suất củ phần tự chảy, có chất lượng cao. Để tăng nhanh và tốt quá trình làm trong dịch thì tương quan hoạt độ của các enzyme chính như endo- PMG là 55.102 đơn vị/mg protein chưa trong chế phẩm, còn enzyme Cx là 57,5 đơn vị/mg protein trong 1 lít dung dịch. Trong trường hợp này khơng cần có mặt PE. Nhưng nếu hoạt độ của endo- PMG ở trong chế phẩm là 31.102

đơn vị/mg protein thì cần có mặt PE với hoạt độ là 4,1 đơn vị/mg protein. Trong sản xuất vang nho giữa hàm lượng endo- PMG và Cx phải có sự tương quan nhất định. Khi chế phẩm có hoạt độ endo- PMG là 28,2.102 đơn vị/mg protein và Cx là 28,7 đơn vị/ mgP quá trình làm trong sẽ xảy ra nhanh hơn khi có hoạt độ endo- PMG là 25,4.102 đơn vị/ mg P và Cx là 55 đơn vị/mg P.

- Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn định của vang nghĩa là phải chứa enzyme protein với hoạt độ không thấp hơn 120 đơn vị/g theo globulin và 140 đơn vị/g theo anbumin.

Để tránh gây tổn thất các chất màu của vang đỏ và tránh xuất hiện màu tối trong vang trắng thì hoạt độ của các enzyme oxy hóa trong chế phẩm không được vượt quá 0,1 đơn vị/mg axit ascorbic trong một phút trên một gam chế phẩm.

- Chế phẩm pectinase dùng trong vang quả phải bảo tồn hoạt độ trong điều kiện có chứa rượu (10-12%) và phải tác dụng có hiệu quả trong điều kiện có độ pH nhất định.

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Bảng 1.3. Tốc độ ép của bã nghiền nho khi sử dụng pectinase

Thời gian ép Thể tích dịch thu đƣợc

Khơng xử lí Khi có xử lí bằng enzyme

30 giây đầu 30 giây thứ 2 Phút thứ 2 Phút thứ 3 Phút thứ 4 Phút thứ 5 Phút thứ 6 Phút thứ 7 Phút thứ 8 Phút thứ 9 Phút thứ 10

400 100 90 90 80 60 50 50 50 50 40

675 225 215 205 110 110 110 110 100 100 90

Khi sử dụng chế phẩm pectinase, các polime của dịch nhƣ protein, pectin sẽ thủy phân làm giảm độ nhớt đo đó làm tăng tốc độ lọc. Trong 1 giờ dịch thu đƣợc từ bã nghiền của nho có xử lý bằng chế phẩm pectinase sẽ qua lọc 7 lần nhanh hơn từ bã không đƣợc xử lý.

A.Martakov đã chứng tỏ rằng khi xử lý bã nghiền bằng enzyme thì độ nhớt của dịch bị giảm đi ít hơn là khi xủa lý dịch, vì lẽ khi đó protopectin của thành tế bào cũng bị phân giải.

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

19

Khi dịch không được xử lý bằng enzyme thì trong quá trình lắng, các hạt vẩn đục lớn và nhỏ sẽ bị kết tủa xuống. Khi sử dụng enzyme thì các chất cao phân tử của dịch sẽ bị thủy phân từng phần, độ nhớt bị giảm, kết quả là tốc độ làm trong đều tăng.

Sử dụng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng chất lượng của dịch quả và của vang. Trong quá trình xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase, thành phần hóa học của bã bị thay đổi rất đáng kể mà trước tiên là hàm lượng chất phenol. Người ta thấy rằng khi xủa lí bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng hàm lượng catesin ở trong dịch. Khi đó q trình trích ly sẽ vượt lên trước q trình oxy hóa catesin ngay cả khi nhiệt độ tăng. Điều này rất quan trọng, vì các hợp chất phenol đặc biệt là catesin có các nhóm hydroxil ở vị trí octo thường có hoạt tính của vitamin P. Như vậy xủa lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng giá trị sinh học của dịch quả và vang.[14]

Không những vậy vang được pha chế từ dịch và bã nghiền có xử lý bã bằng chế phẩm pectinase sẽ chín nhanh hơn do đó cần chiết sớm hơn. Người ta cho rằng chế phẩm thu được từ nấm mốc ảnh hưởng rất tốt đến chất lượng của vang, vang có hương mạnh và dịu do hàm lượng glyxerin và ester ở trong vang cao. [1]

1.1.8.2. Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) và cô lập protoplast

Trong chu trình sinh sản của thực vật, người ta không thể dùng phương pháp thao tác gen truyền thống để đưa nhiều tổ hợp các đặc tính mong muốn vào tế bào. Ngày nay, người ta sử dụng một phương pháp hiệu quả với thực vật bậc cao là dung hợp các protoplast (tế bào trần) cô lập từ tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) trong điều kiện invitro và sau đó phát triển nó thành thực vật lai. Đây có thể là một công cụ hữu hiệu để làm tăng sự đa dạng gen và tổ hợp các đặc điểm khơng có trong tự nhiên (Gleba, 1978). [1]

Đầu tiên, người ta làm mềm mô thực vật bằng cách sử lí với enzyme pectinase, sau đó tiếp tục xử lí với enzyme cellulase để chuyển mô này thành protoplast. Nồng độ của enzyme là pectinase 0,5%(W/V) và cellulase 5%(W/V), chỉnh pH 5,6 bằng HCl 2N (Tanabe, 1968; Bock, 1983). [2]

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

20

1.4 . Tổng quan về nấm Aspergillus niger

1.4.1. Giới thiệu chung

Aspergillus niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng

rãi trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều

vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Hiện nay, A. niger được sử dụng chủ yếu

trong công nghiệp sản xuất enzyme (điển hình như α - amylase, glucoamylase, pectinase, protease, cellulase), trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic. [1, 9]

Nấm mốc là vi sinh vật có thay đổi đáng kể trong lịch sử phân loại. Các nghiên cứu khởi đầu đã phân chia nấm thuộc ngành Thallophyta thuộc giới phụ

Cryptogamae, giới Plantae (thực vật). Các khảo sát về đặc tính cấu trúc dưới kính

hiển vi tiếp theo đã chứng minh nấm không thuộc thực vật lẫn động vật. Samson và van Reenen-Hoekstra (1988) đã phân chia nấm thật thành 4 lớp:

Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes và Deuteromycetes. Hệ thống phân

loại này đã tồn tại một thời gian dài và A. niger được phân loại thuộc giới nấm (Fungi), ngành phụ nấm bất toàn Deuteromycotina, lớp Deuteromycetes, bộ

Moniliales, họ Moniliaceae, chi Aspergillus và loài Aspergillus niger. [2]

Tuy nhiên, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nghiên cứu ở thập niên 70 của thế kỷ XX, bắt đầu từ nghiên cứu phân chia nhóm của Whittaker (1969, trích dẫn bởi Sumbali, 2005), đến giới (Alexopolous và Mims, 1979; trích dẫn bởi Sumbali, 2005) đã đề nghị khóa phân loại mới cho giới nấm nói chung

và A. niger nói riêng thuộc: Ngành: Amastigomycota Ngành phụ: Ascomycotina

Lớp: Ascomycetes

Lớp phụ: Plectomycetidae Bộ: Eurotiales

Họ: Eurotiaceae

Giống:Aspergillus

Loài: Aspergillus niger

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

21

Với đặc điểm chính trong họ Eurotiaceae là bào tử đính ở dạng thể bình

(Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010). [7]

1.4.2. Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger

Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn và có vách ngăn, gồm hai loại: - Khuẩn ty dinh dưỡng: khuẩn ty phát triển trong cơ chất, có kích thước nhỏ, màu trắng. Các khuẩn ty bện chặt thành một khối rất dai, ăn sâu vào môi trường nuôi cấy để hút dưỡng chất. Khi già hệ sợi ngã sang màu vàng. Khuẩn ty sinh sản: khuẩn ty phát triển trong khơng khí, có kích thước lớn hơn khuẩn ty dinh dưỡng rất nhiều, trong suốt. Khuẩn ty sinh sản hướng vào khơng khí để lấy oxy, có khả năng tạo bào tử khi già. Tóm lại, khi già hệ sợi có nhiều biến đổi: một số khuẩn ty dinh dưỡng tạo thành các hạch nấm làm hệ sợi ngã sang màu vàng. Trong khi đó, khuẩn ty sinh sản hình thành các bào tử đính làm cho bề mặt khuẩn lạc có màu đen. (Nguồn: Klich, 2002; Samson et al., 2007). [1, 7, 14]

1.4.3. Cấu tạo cơ quan sinh sản

Aspergillus niger là loại nấm khơng có giai đoạn sinh sản hữu tính, A.

niger sinh sản vơ tính chủ yếu bằng bào tử đính (Gams, 1985).

Hình 1.3. Cấu tạo của Aspergillus

Cơ quan sinh sản có dạng như hoa cúc, gồm các phần: bào tử đính phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc. Từ tế bào gốc tạo thành sợi cuống không vách ngăn, kéo dài với phần đỉnh phồng to tạo thành túi hình cầu, khơng màu cho đến vàng

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

22

nhạt. Xung quanh bề mặt túi là các cuống thể bình màu nâu, dài 10  15 m, là nơi sinh ra các thể bình. Thể bình có một tầng hoặc hai tầng. Các bào tử đính được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình thành chuỗi hướng gốc, khơng phân nhánh (bào tử ở ngay miệng thể bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình là bào tử càng già). Bào tử đính hình cầu, thường dẹt, đường kính 4  5 m,

nhưng thường nhỏ hơn (Onions et al., 1981). Loài A. niger được phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus bởi khối bào tử đính màu đen. [1, 4, 14]

</div>