Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.61 MB, 250 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN TUẤN HẢI

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN

CÁC VI KHUẨN SỢI (ACTINOBACTERIA)TẠO KHÁNG SINH TRONG ĐẤT

RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ,THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌCMÃ SỐ 94 20 201

2024

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌCMÃ SỐ 94 20 201

NGƯỜI HƯỚNG DẪNGS.TS. CAO NGỌC

ĐIỆP

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

2024

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Luận án này với tựa đề là “Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi(Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ chíMinh”, do nghiên cứu sinh Nguyễn Tuấn Hải thực hiện theo sự hướng dẫn của GS.TS.Cao Ngọc Điệp. Luận án đã báo cáo và được Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ thôngqua ngày: …../…../ 20…. Luận án đã được chỉnh sửa theo góp ý và được Hội đồngđánh giá luận án xem lại.

GS.TS. Cao Ngọc Điệp

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạoViện, Phòng Đào tạo, Phòng Quản lý Khoa học, Khoa Sau Đại học và các phòng bankhác củaTrường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt qtrình học tập và nghiên cứu tại trường.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Sài Gòn, BanLãnh đạo Khoa Môi Trường - Trường Đại học Sài Gòn đã hỗ trợ và tạo điều kiệnthuận lợi cho tôi suốt thời gian làm nghiên cứu sinh.

Chân thành gửi lời cảm ơn đến các anh chị, các bạn đồng nghiệp thuộc ViệnCông nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Cần Thơ và Khoa Môi Trường -Trường Đại học Sài Gòn đã quan tâm, giúp đỡ và động viên, chia sẻ khó khăn với tơi.

Chân thành cảm ơn các thầy cô và anh chị chuyên viên tại các phịng thí nghiệmliên quan cũng như các em sinh viên, các anh chị đồng học nghiên cứu sinh tại ViệnCông nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Cần Thơ đã cộng tác cùng tôitrong thời gian thực hiện các thí nghiệm. Đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS.TrầnThị Giang, phịng thí nghiệm Vi sinh môi trường, Viện Công nghệ Sinh học và Thựcphẩm Trường Đại học Cần Thơ, người đã hỗ trợ tơi rất nhiều trong q trình triển khaivà thực hiện nghiên cứu. Sau cùng xin được gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, những ngườithân trong gia đình, đã hết lòng ưu ái, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôitrong suốt thời gian đi lại học tập giữa hai thành phố lớn.

Nguyễn Tuấn Hải

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

TĨM

TẮT

Rừng ngập mặn có vai trị sinh học quan trọng. Vi khuẩn sợi là nguồn cung cấp

kháng sinh và các hoạt chất sinh học ứng dụng rộng rãi. Đề tài “Phân lập và tuyển

chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặnCần Giờ, Thành phố Hồ chí Minh” phân lập, chọn lọc và phân tích hoạt chất kháng

khuẩn của những chủng vi khuẩn sợi từ đất ngập mặn Cần Giờ. Đề tài phân lập đuợc48 chủng vi khuẩn sợi, chọn được 8 chủng có tính kháng khuẩn, nhận diện dựa vàotrình tự đoạn gen 16S rDNA. Kết quả đều là vi khuẩn Gram dương thuộc chi

Streptomyces, họ Streptometaceae, bộ Actinomycetales, lớp Actinobacteria, ngành

Actinobacteria; với 8 loài khác nhau: Streptomyces tendae, S. tanashiensis, S.

parvulus, S. celluloflavus, S. aegytia, S. africanus, S. albogriseolus và S. laurentii. Có

3 chủng (Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1, S. albogriseolusANTHOIDONG 7.1 và S. parvulus ANTHOIDONG 3.1) kháng được 4 vi khuẩn gâybệnh cho người là Bacillus cereus, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus và

Staphylococcus aureus. Tỷ lệ hiện diện của gen chỉ thị kháng sinh, 8/8 chủng vi khuẩn

sợi đều mang gen nrps, 4/8 chủng mang gen pksI, đặc biệt là 50% các chủng mang cả2 gen nrps và pksI. Chọn được 2 dòng vi khuẩn sợi tạo kháng sinh hay kháng các vikhuẩn gây bệnh tốt nhất (S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S. celluloflavus

ANTHOIDONG 4.1) để trích ly hoạt chất bằng ethyl acetate, thu được cao chiết chứa

hoạt chất ức chế 3 vi khuẩn gây bệnh cho người là Bacillus cereus, Escherichia coli,và Staphylococcus aureus; sử dụng kỹ thuật GC- MS phân tích thành phần hoạt chất.Cao chiết của chủng S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 xác định được 6 hoạt chất

sinh học tiêu biểu như: Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane,tetradecamethyl; dẫn xuất 3TMS của acid 2,6- dihydroxybenzoic; Heptasiloxane,hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec;

Tetracosamethyl, cyclododecasiloxane. Chủng S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1

phát hiện được 7 hoạt chất tiêu biểu, bao gồm: 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl;Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Benzoic acid, 2-hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene; và Heptasiloxane, hexadecamethyl (hai chất Cycloheptasiloxane,tetradecamethyl và Heptasiloxane, hexadecamethyl xuất hiện ở cả hai chủng), hợp chấtSiloxane được xác định tính kháng khuẩn. Các chất này được tài liệu quốc tế ghi nhậntính kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa. Hoạt chất sinh học của hai dịng vikhuẩn sợi giữ được tính kháng khuẩn sau q trình xử lý dung mơi, mở ra khả năngứng dụng vào sản xuất thành thuốc đồng thời là cơ sở để khai thác nguồn dược liệutiềm năng từ vi khuẩn sợi của đất rừng ngập mặn, góp phần tăng hiệu quả trị bệnh ởngười. Như vậy, loài vi khuẩn sợi và sinh chất hiện diện đất ngập mặn Cần Giờ tươngđồng với các vùng ngập mặn trên thế giới.

Từ khóa: gen nrps, kháng sinh, rừng ngập mặn Cần Giờ, Streptomyces, vi khuẩn sợi

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

Mangrove forests play an important biological role. Actinobacteria are a source

of antibiotics and other useful substances. This thesis "Isolation and selection of

antibiotic-producing Actinobacteria from Can Gio mangrove soil, Ho Chi Minhcity" isolated, selected and analyzed antibacterial ingredients of actinobacterial strains

from Can Gio mangrove soil. The project isolated 48 strains, selected 8 strains withantibacterial properties, and identified them based on the 16S rDNA gene fragment

sequence. All such strains belong to the genus Streptomyces, family Streptometaceae,

order Actinomycetales, class Actinobacteria, phylum Actinobacteria, and

Gram-positive bacteria, with 8 species: Streptomyces tendae, S. tanashiensis, S. parvulus, S.

celluloflavus, S. aegytia, S. africanus, S. albogriseolus and S. laurentii. Among them, 3

strains (Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1, Streptomyces albogriseolusANTHOIDONG 7.1 and Streptomyces parvulus ANTHOIDONG 3.1) were resistant to4 human pathogens Bacillus cereus, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus and

Staphylococcus aureus. The presence of antibiotic genes, 8/8 actinobacteria strains

carry nrps gene, 4/8 strains carry pksI gene, especially 50% of strains carry both nrpsand pksI genes. Two strains with the best antimicrobial ability (S. albogriseolus

7.1 and S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1) were extracted bioactives using ethylacetate. This extract inhibited 3 human pathogens (Bacillus cereus, Escherichia coli,and Staphylococcus aureus) and was analyzed for antibacterial ingredients by GC-MS.Spectrum analysis of S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 extract obtained at least 6

active ingredients; including Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane,tetradecamethyl; 2,6 dihydroxybenzoic acid 3TMS; Heptasiloxane, hexadecamethyl;Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec; and Tetracosamethyl,

cyclododecasiloxane. For S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 extract, obtained at

7 major components: 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane,tetradecamethyl; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane;Cyclododecane; Benzoic acid, 2-hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene andHeptasiloxane, hexadecamethyl (in those, 2 compounds, namely Cycloheptasiloxane,

tetradecamethyl and Heptasiloxane, hexadecamethyl, were same as in S.albogriseolus

ANTHOIDONG 7.1 extract). These substances, particularly siloxanes, have beenreported antimicrobial, antifungal and antioxidant. Bioactive ingredients of twoactinobacteri strains retain their antibacterial properties after solvent treatment,opening up the possibility of application in the production of drugs and simultaneouslyserving as a basis for exploiting potential medicinal sources from mangrove soilactinobacteria, contributing to increase the effectiveness of treating human diseases.Thus, the species of actinobacteria along with bioactives present in Can Gio mangrovesoil are similar to other mangrove areas in the world.

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Key words: actinobacteria, antibiotics, Can Gio mangrove, nrps gene, Streptomyces

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

1.2 Mục tiêu nghiên cứu...2

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu...2

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu...2

1.5. Nội dung nghiên cứu...3

1.6. Đóng góp mới của luận án...3

1.7. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án...4

2.3.1 Giới thiệu về thuật ngữ vi khuẩn sợi (xạ khuẩn)...8

2.3.2 Phân bố của vi khuẩn sợi trong tự nhiên...9

2.3.3. Đặc điểm sinh học tổng quát của vi khuẩn sợi...9

2.3.4 Phân loại (Taxonomy) vi khuẩn sợi...13

2.3.5. Những ứng dụng công nghệ sinh học của vi khuẩn sợi...18

2.4. Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp...19

2.4.1 Lược khảo chung về kháng sinh...19

2.4.2 Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp:...21

2.5. Sự tồn tại của các gen chỉ thị kháng sinh (pks-I, pks-II và nrps) để nhận diện vikhuẩn sợi có khả năng tổng hợp kháng sinh...26

2.6. Một số thành tựu nghiên cứu về vi khuẩn sợi tổng hợp kháng sinh phân lập từrừng ngập mặn...31

2.6.1 Trên thế giới...31

2.6.2. Nghiên cứu trong nước...36

CHƯƠNG 3...37

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...37

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu...37

3.2. Phương tiện nghiên cứu...37

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

3.2.1 Nguyên vật liệu...37

3.2.2 Thiết bị - dụng cụ...39

3.2.3 Hóa chất – mơi trường...39

3.3 Phương pháp nghiên cứu...41

3.3.1 Thu thập và xử lý mẫu...41

3.3.2 Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn sợi...42

3.3.3 Đánh giá khả năng kháng khuẩn...45

3.3.4. Nhận diện vi khuẩn sợi bằng phương pháp sinh học phân tử...46

3.3.5 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS...49

3.3.6. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ vi khuẩn sợitiềm năng được tuyển chọn...53

CHƯƠNG 4...57

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...57

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn sợi...57

4.1.1 Số lượng, nguồn gốc vi khuẩn sợi phân lập được...57

4.1.2 Đặc điểm hình thái các dòng vi khuẩn sợi phân lập được...58

4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn...64

4.3 Kết quả định danh và cây phả hệ di truyền...68

4.3.1 Định danh các dòng vi khuẩn sợi kháng khuẩn mạnh...68

4.3.2 Hình thái của các chủng vi khuẩn sợi được chọn...71

4.4 Sự hiện diện của các gen chỉ thị kháng sinh...79

4.5. Chất kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợi được chọn...84

4.5.1 Chiết tách chất kháng khuẩn của 2 dòng vi khuẩn sợi...84

4.5.2 Kết quả phân tích GC-MS chất kháng khuẩn của vi khuẩn sợi Streptomycesalbogriseolus ANTHOIDONG 7.1...88

4.5.3 Kết quả phân tích GC-MS chất kháng khuẩn của vi khuẩn sợi Streptomycescelluloflavus ANTHOIDONG 4.1...95

CHƯƠNG 5...107

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT...107

5.1 Kết luận...107

5.2 Đề xuất...108

TÀI LIỆU THAM KHẢO...109

DANH MỤC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ...133

PHỤ LỤC...134

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Dữ liệu phân loại VKS...14

Bảng 2.2: Phân phối Loài và Chi của VKS theo Lớp, Bộ, Họ...15

Bảng 2.3: Những cặp mồi khuếch đại gen của VKS...28

Bảng 3.1: Danh sách mẫu đất lấy tại huyện Cần Giờ...38

Bảng 3.2: Thành phần môi trường SCA...39

Bảng 3.3: Thành phần môi trường LB...40

Bảng 3.4: Thành phần môi trường MHA...40

Bảng 3.5: Quy ước khả năng kháng khuẩn...46

Bảng 3.6: Thành phần hóa chất để PCR nhận diện VKS...48

Bảng 3.7: Thành phần hóa chất để PCR gen pksI...50

Bảng 3.8: Thành phần hóa chất để PCR gen pksII...51

Bảng 3.9: Thành phần hóa chất để PCR gen nrps...52

Bảng 3.10: Chương trình nhiệt độ phân tích GC-MS...56

Bảng 4.1: Nguồn gốc và số khuẩn lạc VKS phân lập được...57

Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc VKS phân lập được...60

Bảng 4.3: Khả năng kháng khuẩn của các dòng VKS...65

Bảng 4.4: Mức độ tương đồng gen (định danh) VKS với GenBank...69

Bảng 4.5: Sự hiện diện các gen chỉ thị kháng sinh trong 8 dòng VKS...80

Bảng 4.6: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ VKS S. albogriseolusANTHOIDONG 7.1...86

Bảng 4.7: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ VKS S. celluloflavusANTHOIDONG 4.1...86

Bảng 4.8: Các chất trong phổ GCMS cao chiết của VKS S. albogriseolusANTHOIDONG 7.1...88

Bảng 4.9: Các chất kháng khuẩn của VKS S.albogriseolus ANTHOIDONG 7.1... 91

Bảng 4.10: Thành phần chất kháng khuẩn tiêu biểu của VKS S. albogriseolusANTHOIDONG 7.1...92

Bảng 4.11: Các chất trong phổ GCMS cao chiết của VKS S. celluloflavusANTHOIDONG 4.1...96

Bảng 4.12: Các chất kháng khuẩn của VKS S.celluloflavus ANTHOIDONG 4.1... 100

Bảng 4.13: Thành phần chất kháng khuẩn tiêu biểu của VKS S.celluloflavusANTHOIDONG 4.1...102

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn sợi trên mơi trường thạch...9

Hình 2.2: Khuẩn ty của vi khuẩn sợi (VKS)...10

Hình 2.3: Tỷ lệ phân bố các lớp trong ngành VKS...17

Hình 2.4: Tỷ lệ phân bố các chi trong ngành VKS...18

Hình 2.5: Cấu trúc hóa học của một số kháng sinh cơ bản...20

Hình 2.12: Một số chất sinh học mới của VKS...25

Hình 2.13: Sự tăng trưởng của vi khuẩn sợi trong mơi trường lỏng...32

Hình 2.14: Mối quan hệ di truyền trong trình tự các vùng KS trên gen pksI...35

Hình 3.1: Sơ đồ chương trình nghiên cứu tồn thể đề tài...37

Hình 3.2: Bối cảnh nơi lấy mẫu đất trong rừng ngập mặn Cần Giờ...41

Hình 3.3: Bản đồ vị trí lấy mẫu tại huyện Cần Giờ...42

Hình 3.4: Quy trình pha lỗng mẫu đất với nước cất vơ trùng...43

Hình 3.5: Quy trình cấy chuyển...43

Hình 3.6: Phân loại khuẩn lạc và nhuộm Gram...44

Hình 3.7: Chương trình nhiệt độ phản ứng PCR đoạn gen 16S rDNA...48

Hình 3.8: Hệ thống điện tốn giải trình tự...49

Hình 3.9: Quy trình tách chiết hợp chất sinh học của VKS...54

Hình 4.1: Hình dạng một số khuẩn lạc VKS trên mơi trường SCA...59

Hình 4.2: Tỷ lệ màu sắc các khuẩn lạc của VKS phân lập được...62

Hình 4.3: Tỷ lệ hình dạng các khuẩn lạc của VKS phân lập được...63

Hình 4.4a: Tỷ lệ theo dạng bìa khuẩn lạc của VKS phân lập được...64

Hình 4.4b: Số lượng theo dạng bìa của VKS phân lập được...64

Hình 4.5: Số lượng dịng VKS có tính kháng khuẩn...67

Hình 4.6: Số lượng dịng VKS theo mức độ kháng khuẩn...67

Hình 4.7: Hoạt tính kháng khuẩn của dịng VKS ANTHOIDONG 7.1...68

Hình 4.8: Hoạt tính kháng khuẩn của dịng VKS ANTHOIDONG 4.1...68

Hình 4.9: Giản đồ phân nhóm di truyền 8 dịng VKS bằng Maximum Likehood....70

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Hình 4.10: Dịng VKS Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1...72

Hình 4.11: Dịng VKS S. aegyptia ANTHOIDONG 6.1...72

Hình 4.12: Dịng VKS S. laurentii ANTHOIDONG 11.1...73

Hình 4.13: Dịng VKS Streptomyces tanashiensis ANTHOIDONG 3.2...73

Hình 4.14: Dịng VKS Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1...74

Hình 4.15: Dịng VKS Streptomyces parvulus ANTHOIDONG 3.1...76

Hình 4.16: Dịng VKS Streptomyces africanus LONGHOA 4.2...78

Hình 4.17: Dịng VKS Streptomyces tendae THANHAN 4.4...78

Hình 4.18: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại gen nrps...81

Hình 4.19: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại gen pksI...81

Hình 4.20: Vịng kháng khuẩn của cao chiết từ 2 dịng VKS chọn lọc...85

Hình 4.21: Phổ GCMS 6 đỉnh chất kháng khuẩn của VKS S. albogriseolusANTHOIDONG 7.1...91

Hình 4.22: Phổ GC-MS với 7 đỉnh chất kháng khuẩn của VKS S. celluloflavusANTHOIDONG 4.1...101

Hình 4.23: Cấu trúc chuỗi Siloxane...104

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

EDTA: EthyleneDiamineTetraacetic AcidEtOAc: ethyl acetate

GC-MS: gas chromatography - massive spectrophotometry (sắc kí khối phổ)GTP: guanosine triphosphate

MMA: Modified Marine Agar

NCBI: national center for biotechnology informationNRPS: non-ribosomal polyketide synthetase

PCR: polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi dây chuyền)RNA: ribonucleic acid

rRNA: Ribosome RiboNucleic AcidSCA: starch casein agar

ISP: International Streptomyces Projects (chương trình vi khuẩn sợi quốc tế)SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis SYP-SW: Starch - Yeast extract – Peptone – Sea Water

TE: Tris EDTAVKS: vi khuẩn sợi

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

CHƯƠNG 1GIỚI THIỆU

1. 1 Đặt vấn đề

Vi sinh vật gây bệnh thường xuyên đe dọa sức khỏe người và động vật. Năm1928, Alexander Fleming phát hiện ra penicillin, một loại kháng sinh điều trị các bệnhnhiễm trùng, góp cơng vào nền y học. Kháng sinh là nhóm thuốc có tác dụng tiêu diệttrực tiếp hoặc làm chậm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, giúp cho hệ miễn dịch

của con người ức chế q trình nhiễm khuẩn (Kohanski et al., 2010). Ngồi ra, những

chất kháng sinh, kháng khuẩn còn được ứng dụng trong một số lĩnh vực khác như chăn

nuôi, bảo quản thực phẩm, bảo vệ thực vật… (Ceylan et al., 2008). Tuy nhiên, hiện

nay đang có sự xuất hiện của các vi khuẩn gây bệnh đề kháng lại kháng sinh ngày càngnhiều. Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất chất kháng sinhlà: cải tiến các chất kháng sinh hiện có để tránh tình trạng kháng thuốc, đồng thời thúc

đẩy nghiên cứu tìm ra các chất kháng sinh, kháng khuẩn mới (Xu et al., 2014).

Trong số các vi sinh vật có khả năng tạo chất kháng sinh, vi khuẩn sợi(actinobacteria) hay còn gọi là xạ khuẩn đóng vai trị quan trọng, với khoảng 80% cácchất kháng sinh được phát hiện có nguồn gốc từ vi khuẩn sợi, đặc biệt là các loài thuộc

chi Streptomyces (Berdy, 2005). Tuy nhiên, hiện nay việc phân lập các loài vi khuẩnsợi từ những nguồn đặc biệt khác (ngoài Streptomyces trong đất) để tìm kiếm khángsinh mới là rất cần thiết (Sirisha et al., 2013). Trong xu hướng này, những loài vi

khuẩn sợi phân lập từ các nguồn gốc biển được quan tâm nhiều hơn do khả năng sảnsinh các hợp chất thứ cấp (secondary metabolites) với nhiều hoạt tính sinh học có giátrị như chất kháng khuẩn, kháng nấm, hợp chất ngăn ngừa ung thư, ức chế khối u (Xu

et al., 2014).

Rừng ngập mặn là một tập hợp các lồi cây nhiệt đới, cận nhiệt đới và cây bụi

thích nghi với vùng khắc nghiệt giữa biển và đất liền (Ottoni et al., 2015). Các hệ sinh

thái ở rừng ngập mặn bị ngập nước theo thủy triều, do đó, biến động về hàm lượngmuối và chất dinh dưỡng trong đất. Dựa vào cơ chế điều tiết muối, thực vật rừng ngậpmặn được chia thành hai nhóm: nhóm một là những cây có tuyến muối (secretor) hoặclơng muối trên lá, giúp bài tiết lượng muối dư thừa; nhóm hai là những cây khơng cólá mang tuyến muối, sẽ tích lũy muối vào vỏ cây hoặc tế bào thịt lá và sẽ được thải ra

ngồi khi lá rụng hay khi tróc vỏ (Miththapala, 2008; Spelchan et al., 2014).

Sự đa dạng về hệ động-thực vật cùng với các lợi ích của rừng ngập mặn được ghinhận trong nhiều tài liệu (Thatoi và Biswal, 2008; Miththapala, 2008). Rừng ngập mặncó chức năng điều tiết lũ, hấp thu các chất ơ nhiễm, tăng tính ổn định cho các vùngduyên hải. Nguồn carbon dồi dào từ xác bã động-thực vật ở đây khiến cho rừng ngập

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

Thời gian qua, Việt Nam có nhiều nghiên cứu về tiềm năng kháng khuẩn của cácloài vi sinh vật khác nhau. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi sinh vật rừng ngập mặnCần Giờ nói riêng vẫn còn rải rác trên nhiều đối tượng như: vi khuẩn cố định đạm(Đinh Thúy Hằng và Trần Triết, 2009); vi khuẩn liên kết thực vật và vi khuẩn sống

trong đất vùng rễ cây rừng ngập mặn ở Cà Mau (Hồ Thanh Tâm và ctv., 2016-2017);

vi sinh vật ở vùng ven biển Hải Phòng (Đỗ Mạnh Hào và Phạm Thiên Thư, 2010); vikhuẩn sinh tổng hợp polyhydroxyalkanoates từ rừng ngập mặn Quảng Ninh (ĐồnVăn Thược và Nguyễn Thị Bình, 2012)... Từ đây đặt ra nhu cầu nghiên cứu các loài vikhuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn, bổ sung nguồn tiềm năng để thu nhận các chất thứcấp, đặc biệt là kháng sinh mới để ức chế vi khuẩn gây bệnh hiệu quả hơn (Dương Văn

Hợp và ctv., 2011).

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ,thành phố Hồ chí Minh có khả năng tổng hợp các chất ức chế vi khuẩn gây bệnh chocon người.

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng là các vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn có khả năng tạo kháng sinh.Nghiên cứu được giới hạn trong các mẫu đất rừng ngập mặn thuộc 6 đơn vị hànhchính cấp xã của huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh, thu thập trong thời gian từtháng 02 đến tháng 4 năm 2019.

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thu mẫu và tiến hành phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi có khả năngtổng hợp kháng sinh được thực hiện từ tháng 02 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020.Sau đó định danh vi khuẩn sợi từ tháng 11 năm 2020 đến tháng 4 năm 2021.

Các nghiên cứu vi sinh vật được tiến hành tại các phịng thí nghiệm Vi sinh vậtmôi trường, Sinh học phân tử thuộc Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm, trườngĐại học Cần Thơ. Một số phân tích GC-MS và hóa học chun sâu khác được thựchiện bởi Bộ môn Khoa Học Môi Trường, khoa Môi Trường và Tài Nguyên Thiên

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

3Nhiên, Đại Học Cần Thơ.

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

1.5. Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu bao gồm các nội dung:

- Thu thập mẫu đất rừng ngập mặn Cần Giờ, phân lập và tuyển chọn các dòng vikhuẩn sợi có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh.

- Nhận diện các dòng vi khuẩn sợi bằng kỹ thuật khuếch đại và giải trình tự đoạngen 16S rDNA, với cặp mồi đặc hiệu S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C-Act-0878-a-A-19

(Sun et al., 2015), so sánh trình tự thu được với cơ sở dữ liệu trực tuyến trên GenBank

và đề xuất tên phân loại vi khuẩn sợi đồng thời xây dựng giản đồ phân nhóm di truyềnbằng phần mềm MEGA.

- Thu nhận hoạt chất kháng vi khuẩn gây bệnh, kiểm tra hoạt tính và phân tíchthành phần hóa chất theo các phương pháp phân tích phổ sử dụng máy sắc ký ghépkhối phổ (GC-MS).

1.6. Đóng góp mới của luận án

Đã phân lập được 48 chủng vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ,trong đó, có 10 chủng kháng lại ít nhất một trong bốn loài vi khuẩn gây bệnh thử

nghiệm là Bacillus cereus (8 chủng), E. coli (4 chủng), S. aureus (6 chủng) và V.

parahaemolyticus (3 chủng). Mười chủng vi khuẩn sợi này được tuyển chọn và định

danh ghi nhận được 8 dòng đều thuộc chi Streptomyces họ Streptometaceae, bộ

Actinomycetales, lớp Actinobacteria, ngành Actinobacteria; với 8 loài khác nhau:

Streptomyces tendae, S. tanashiensis, S. parvulus, S. celluloflavus, S. aegytia, S.africanus, S. albogriseolus và S. laurentii. Tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các

chất có hoạt tính sinh học trong 8 dịng vi khuẩn sợi được ghi nhận có sự khác nhau,

bao gồm pksI là 50%, pksII là 0% và nrps là 100%.

Đã chọn được hai dịng VKS tiềm năng nhất có khả năng kháng khuẩn cao là S.

albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1. Sáu hợp

chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu được sản xuất từ S. albogriseolus ANTHOIDONG

7.1 được xác định, gồm có: Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane,tetradecamethyl; dẫn xuất 3TMS của acid 2,6- dihydroxybenzoic; Heptasiloxane,hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec; và

Tetracosamethyl, cyclododecasiloxane. Đối với S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1,

11 hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu được xác định bao gồm: 2-pentanone, hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane;1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Benzoic acid, 2-hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene; và Heptasiloxane, hexadecamethyl.

4-Đất rừng ngập mặn Cần Giờ với vi khuẩn sợi là nguồn chất kháng khuẩn tiềmnăng nhưng chưa được quan tâm nhiều. Đây là đối tượng mới khi nghiên cứu về visinh vật bản địa; là cơng trình nghiên cứu đầu tiên về tính trạng kháng khuẩn và gen

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

5chỉ thị kháng

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

sinh của vi khuẩn sợi trong đất ở rừng ngập mặn huyện Cần Giờ. Đồng thời, chấtkháng vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn sợi phân lập từ đây góp phần bổ sung nguồndược liệu có thể khai thác trong tương lai.

1.7. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

Ý nghĩa khoa học của nghiên cứu này nhằm phân lập và chọn lọc vi khuẩn sợitrong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh có đặc tính tổng hợpđược kháng sinh. Kết quả của luận án góp phần làm phong phú tư liệu vi sinh vật họccủa rừng ngập mặn Việt Nam nói riêng và vùng Đơng Nam Á nói chung về thành phầnlồi và các lợi ích. Trong đó, có những lồi mang ý nghĩa kinh tế - xã hội, góp phầntrong cơng cuộc tìm kiếm kháng sinh mới.

Ý nghĩa thực tiễn là những vi khuẩn sợi ức chế được nhiều loài vi khuẩn gây hạicó thể sẽ là nguồn sản xuất chất kháng sinh, khắc phục hiện tượng kháng thuốc, làmphong phú nguồn dược liệu Việt Nam. Hơn nữa, giá trị của các vi khuẩn sợi như vậycàng khẳng định vai trị của rừng ngập mặn trong hệ sinh thái tồn cầu. Riêng đối vớirừng ngập mặn Cần Giờ, thể hiện được sự tươngst đồng về các loài vi khuẩn sợi vàthành phần hoạt chất so với các vùng ngập mặn khác trong khu vực và trên thế giới.

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về rừng ngập mặn

2.1.1 Khái niệm và phân loại rừng ngập mặn

Rừng ngập mặn là một dạng rừng quan trọng phát triển trên vùng đất ngập nướcdọc theo các bờ biển ở những khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới (Spelchan và Nicoll,

2014, Ottoni et al., 2015). Rừng ngập mặn trên thế giới phân bố chủ yếu ở Châu Á

(42%), Châu Phi (20%), Bắc và Trung Mỹ (15%), Châu Đại Dương (12%) và Nam Mỹ(11%); tỷ lệ bao phủ khoảng 60% –75% vùng nhiệt đới toàn cầu và các đường bờ biển

cận nhiệt đới (Giri et al., 2011). Cây rừng ngập mặn chủ yếu là những loài cây thân gỗ,

có hạt và một số cây bụi. Trên thế giới có gần 70 lồi cây rừng ngập mặn với chiều caothay đổi từ 1,5 m đến 50 m. Những chi thực vật thường thấy trong rừng ngập mặn là

chi Đước (Rhizophora), chi Mắm (Avicennia), chi Bần (Sonneratia), chi Vẹt(Bruguiera) (Miththapala, 2008). Cây rừng ngập mặn hình thành hai cơ chế thích nghi

với điều kiện sống trong mơi trường có nồng độ muối cao: một là trên lá cây có tuyếnmuối để bài tiết lượng muối thừa; hai là tích lũy muối thừa vào tế bào thịt lá hoặc vỏcây sau đó sẽ được thải ra ngoài khi lá rụng hoặc khi tróc vỏ (Miththapala, 2008;

Spelchan và Nicoll, 2014). Tổng diện tích rừng ngập mặn trên toàn thế giới vào

khoảng 11 – 18 triệu hecta (Spelchan và Nicoll, 2014). Rừng ngập mặn đóng vai trịquan trọng khi cung cấp các sản phẩm sinh khối động-thực vật cho con người, điều tiết

lũ, tích lũy phù sa và chuyển hóa các nguyên tố dinh dưỡng trong đất (Ewel et al.,

1998). Đất rừng ngập mặn là nơi có độ ẩm cao, độ mặn cao và chịu được tình trạng

thiếu oxy, là một hệ sinh thái đa dạng với nhiều loại vi sinh vật có giá trị (Wu et al.,

 Rừng lưu vực: loại rừng này nằm sâu trong đất liền, trong vùng trũng kênhchảy từ nội địa ra bờ biển. Chúng bị ngập không theo quy luật thủy triều.Rừng ngập mặn lưu vực được tìm thấy ở Maduganga, Galle, Sri Lanka.

2.1.2. Rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Theo Ban quản lý rừng phịng hộ Cần Giờ (2021), rừng ngập mặn Cần Giờ có tên

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

đầy đủ là Khu Dự trữ Sinh quyển Thế giới Rừng ngập mặn (DTSQTG RNM) Cần Giờ,

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

là Khu DTSQTG đầu tiên của Việt Nam, được UNESCO công nhận vào ngày21/1/2000, thuộc thuộc khu vực hạ lưu hệ thống sông Đồng Nai – Sài Gịn, nằm ở phíaĐơng Nam Thành phố Hồ Chí Minh, với tổng diện tích là 70.445,34 ha. Rừng ngậpmặn Cần Giờ được chia làm 3 vùng như sau:

1. Vùng lõi, diện tích 6.134,43 ha, có chức năng bảo tồn hệ sinh thái rừngngập mặn cả rừng trồng và rừng tự nhiên; bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn vàcác môi trường sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nước; bảo tồn thủyvực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển để tái sinh tự nhiên cả thực vật lẫn độngvật; nghiên cứu khoa học và du lịch sinh thái có giới hạn.

2. Vùng đệm, diện tích 29.152,10 ha đất rừng và 12.763,56 ha diện tích mặtnước), có chức năng phục hồi các hệ sinh thái dựa trên các quần xã chiếm ưu thế;bảo vệ vùng lõi; tạo không gian lớn hơn cho thú hoang hã ngoài vùng lõi; tạo racảnh quan tự nhiên và văn hóa nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái; tạo điềukiện cho các mơ hình lâm ngư kết hợp thân thiện với môi trường.

3. Vùng chuyển tiếp có diện tích 13.227,79 ha đất rừng và 7.267,47 ha mặtnước, gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ. Vùng chuyển tiếp có chứcnăng khuyến khích các mơ hình phát triển kinh tế, hợp tác với sự tham gia củacán bộ quản lý, các cơ sở kinh tế, các tổ chức đồn thể, tơn giáo, văn hóa, xã hội,các nhà khoa học, các tổ chức giáo dục…

Theo Ban Quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ (2021), về đa dạng sinh học, rừngngập mặn Cần Giờ có hệ động-thực vật rất phong phú, bao gồm:

+ Hệ thực vật: có 318 lồi thực vật bậc cao- Nhóm cây ngập mặn chủ yếu: 37 lồi- Nhóm cây tham gia rừng ngập mặn: 56 lồi- Nhóm cây du nhập: 225 lồi

+ Hệ động vật:

- Cơn trùng: 89 lồi- Cá: 282 lồi- Lưỡng cư: 36 lồi- Bị sát: 36 loài- Chim: 164 loài- Thú: 35 loài

+ Phiêu sinh vật: 66 loài động vật nổi, 66 loài thực vật nổi.

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

• Khu bảo tồn dơi (Đầm Dơi) tại tiểu khu 15a là nơi trú ngụ của hơn 500 cá thể

dơi, chủ yếu là loài Dơi ngựa (Pteropus lylei);

• Khu bảo tồn khỉ (Khu Đảo Khỉ), với đàn Khỉ đuôi dài (Maccaca fascicularis)

phát triển trên 1.000 con.

Ngồi ra, rừng ngập mặn Cần Giờ cịn là nơi sinh sống của nhiều loài động-thựcvật quý hiếm thuộc Danh mục Sách đỏ Việt Nam năm 2007. Về thực vật có 2 lồi là

Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và Chùm lé (Azima sarmentosa); về động vật có 9 lồi

bao gồm:

• Thú: Rái cái thường (Lutra lutra), Rái cá vuốt bé (Aonyx cinereus), Mèo cá (Prionailurus viverrinus), Khỉ đuôi dài (Maccaca fascicularis);

• Chim: Bồ nơng chân xám (Pelecanus philippensis), Cổ rắn (Anhinga

melanogaster), Choắt mỏ vàng (Tringa guttifer),

• Bị sát: Rắn hổ chúa (Ophiophagus hannah),• Cá: Cá mang rổ (Toxotes chatareus).

(Nguồn: Ban Quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ, 2021)

Để có được sự đa dạng sinh học như trên, rừng ngập mặn Cần Giờ phải trải qua40 năm phục hồi kể từ khi bị tàn phá bởi chiến tranh trong những năm 1970. Đồngthời, áp lực ô nhiễm môi trường từ các khu công nghiệp và kinh tế năng động củathành phố Hồ Chí Minh vẫn là một nguy cơ cần kiểm soát để bảo vệ sự ổn định của hệ

sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ (Thanh-Nho và ctv., 2019).

2.2. Vi sinh vật trong đất rừng ngập mặn

Mật số vi sinh vật trong đất thường rất dồi dào và đa dạng, ước tính có đến 109CFU/g đất, thuộc 10.000 loài (Griffiths và Philippot, 2013). Quần xã vi sinh vật chủyếu là vi khuẩn và nấm mốc, đảm trách rất nhiều chức năng (80 – 90% các phản ứngtrong đất thông qua trung gian vi sinh vật), hình thành mùn đất, tuần hồn các yếu tố

dinh dưỡng, cải thiện cấu trúc đất và ảnh hưởng đến cây trồng (Grzadiel et al., 2018).

Đối với đất rừng ngập mặn, nhờ nguồn carbon và dinh dưỡng đầy đủ, các quầnxã vi sinh vật rất phát triển, bao gồm vi khuẩn, vi nấm (91%), tảo và động vật nguyên

sinh (Thatoi et al., 2012). Vi sinh vật đất rừng ngập mặn có khả năng chịu mặn và tổng

hợp chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt là các vi khuẩn sợi tạo được kháng sinh (Sivakumar

et al., 2007; Thatoi et al., 2012).

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Rừng ngập mặn rất giàu các loại tảo phù du, tảo đáy và tảo nhu động. Chúngthường tập trung ở khu vực gốc, rễ của cây ngập mặn và trong lớp đất bùn mềm. Cácloài tảo này có tính chống chịu khá đối với sự thay đổi độ mặn của môi trường và tạo

được những chất chống đông máu, kháng ung thư (Thatoi et al., 2012).

Đất rừng ngập mặn trên thế giới sở hữu đến 1500 loài vi nấm. Trong số đó, cólồi là tác nhân ký sinh gây bệnh cho cây rừng ngập mặn, nhưng có loài sản sinh ra

acid hữu cơ tham gia vào cơ chế hòa tan lân cung cấp dinh dưỡng cho cây (Thatoi et

al., 2012).

Vi khuẩn là quần xã nổi bật và tạo nhiều sinh khối cho rừng ngập mặn, bao gồmcác lồi với nhiều tính năng khác biệt như cố định đạm, hòa tan lân, oxy hóa lưu

huỳnh, phân giải cellulose và vi khuẩn sinh methane (Thatoi et al., 2012).

Các loài vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn của Trung Quốc, Ấn Độ,Indonesia được ghi nhận khả năng tổng hợp nhiều loại chất kháng sinh ức chế mạnh vi

khuẩn Gram âm lẫn vi khuẩn Gram dương (Hong et al., 2009 và Retnowati, 2010).Sivakumar et al. (2007) khẳng định chất kháng sinh của nhóm vi khuẩn sợi nguồn gốc

biển (rừng ngập mặn) mới và độc đáo hơn so với kháng sinh của nhóm vi khuẩn sợitrong đất liền. Các hợp chất đó phức tạp về cấu trúc và đa năng về hoạt tính sinh học

(Hong et al., 2009 và Li et al., 2010). Có hơn 10.000 trong tổng số 23.000 hợp chất có

hoạt tính sinh học được báo cáo do vi khuẩn sợi tổng hợp và 80% các hoạt chất này

được thu nhận từ Streptomyces (Berdy, 2005). Mơi trường rừng ngập mặn như vị trí

địa lý, pH, nhiệt độ, độ mặn, độ ẩm và dinh dưỡng rất biến động ở các vùng khác nhau

nên vi khuẩn sợi rừng ngập mặn rất đa dạng và độc đáo; theo thống kê của Amrita et

al. (2012) có 24 chi của 11 họ và 8 phân ngành dưới bộ Actinomycetales được phân

lập và định danh từ rừng ngập mặn. Có đến 2.000 dòng vi khuẩn sợi được phân lập từrừng ngập mặn và các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng có tác dụng chống nhiễmtrùng, chống khối u và hoạt động ức chế protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), các

enzyme phân giải… (Hong et al., 2009). Tuy nhiên, vì những khó khăn khi nuôi cấy

nên chỉ mô tả xác định được rất ít (5%) số lượng chủng lồi, chưa tương xứng với tiềm

năng sẵn có (Thatoi et al., 2012). Do vậy, cần tiếp tục đầu tư nghiên cứu để khai thác

trong tương lai.

2.3. Vi khuẩn sợi

2.3.1 Giới thiệu về thuật ngữ vi khuẩn sợi (xạ khuẩn)

Về nguồn gốc danh xưng “vi khuẩn sợi” (actinobacteria), theo Dworkin (2006),nhóm vi sinh vật này có nhiều tên gọi và được phân loại không rõ ràng thành nấmhoặc vi khuẩn. Danh từ “xạ khuẩn” - Actinomycete, được dùng từ năm 1870 đến 1921,(thậm chí hiện nay vẫn dùng ở Việt Nam). Từ sau năm 1980, nhờ những thành tựutrong việc so sánh trình tự 16S rDNA kết hợp với các tiêu chí phân loại hóa học(chemotaxonomic), cùng với đặc điểm những vi sinh vật Gram dương có thể có hoặc

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

khơng có cấu trúc “tia xạ”, Dworkin (2006) đề xuất một tên phân loại mới làActinobacteria – vi khuẩn sợi (VKS). Do vậy, đây sẽ là từ được dùng trong luận ánnày.

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

2.3.2 Phân bố của vi khuẩn sợi trong tự nhiên

Vi khuẩn sợi là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rất rộng rãi trongtự nhiên: trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chítrong những cơ chất mà các vi sinh vật khác không sinh trưởng được. Số lượng vikhuẩn sợi trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độcanh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật. Đất giàu dinh dưỡng và lớp đất bềmặt thường có mật số vi khuẩn sợi lớn trong đất. Số lượng vi khuẩn sợi trong đất thayđổi theo thời gian trong năm. Trong đất vùng rễ, vi khuẩn sợi thể hiện tỷ lệ cao về sinhkhối vi sinh vật. Mật số của chúng thường chiếm hơn 30% (khoảng 106 đến 109

CFU/g) và thông thường hai chi Streptomyces và Nocardia chiếm ưu thế, thậm chí

Streptomyces có thể chiếm khoảng 95% (Ventura et al., 2007).

Vi khuẩn sợi có nguồn gốc biển thường được phân lập từ cát biển, đất ngập mặn,trầm tích biển ở các độ sâu khác nhau hoặc ở trên các sinh vật biển khác như hải miên

(bọt biển) và san hô (Shamar et al., 2014). Vi khuẩn sợi ở biển thường có khả năngchịu mặn cao, đặc biệt có những lồi Streptomyces spp. có thể sinh trưởng được ởnồng độ NaCl 16% và nhiều loài thuộc chi Streptomyces và Nocardia sinh trưởng tốtkhi ở nồng độ NaC l 10%, chi Micromonospora spp. và Salinospora spp. đều có khảnăng chịu mặn cao (Solano et al., 2009).

2.3.3. Đặc điểm sinh học tổng quát của vi khuẩn sợia. Khuẩn lạc

Trên môi trường đặc, vi khuẩn sợi sinh trưởng thành những khuẩn lạc khơ, kíchthước khuẩn lạc thay đổi tùy từng lồi và điều kiện nuôi cấy. Khuẩn lạc của vi khuẩnsợi không trơn, ướt như ở vi khuẩn hay nấm men mà thường có dạng thơ ráp, có cácnếp tỏa ra theo hình phóng xạ. Bề mặt khuẩn lạc xù xì, có thể có dạng da, dạng vơi,dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo (Hình 2.1). Màu sắc của khuẩn lạc rất đa dạng: đỏ,da cam, vàng, lam, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện dinh dưỡng (Nguyễn Lân

Dũng và ctv., 2001).

Hình 2.1: Hình dạng các khuẩn lạc vi khuẩn sợi trên môi trường tinh bột-casein đặc (Starch

casein agar). (Ranjani et al., 2016)

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

b. Khuẩn ty

Vi khuẩn sợi giống có hệ sợi giống nấm mốc, nhưng lại đơn bào, khơng có nhânthực và kích thước giống vi khuẩn. Vi khuẩn sợi có 3 lớp khuẩn ty, lớp vỏ ngồi códạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trongmỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chấtnhư: chất kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, acid hữu cơ, có thể tích lũy trong sinh

khối của tế bào vi khuẩn sợi hay được tiết ra môi trường (Nguyễn Lân Dũng và ctv.,

Trên môi trường đặc, hệ sợi của vi khuẩn sinh trưởng thành hai hướng tạo thànhkhuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh (Hình 2.2). Khuẩn ty cơ chất sinh trưởng cắmsâu vào trong môi trường với chức năng chủ yếu là lấy nước và thức ăn. Khuẩn ty cơchất sinh trưởng một thời gian thì dài ra trong khơng khí tạo thành khuẩn ty khí sinh.Khuẩn ty khí sinh còn được gọi là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với khuẩn ty sơ cấp làloại khuẩn ty sinh trưởng từ các loại bào tử nảy mầm. Nhiều lồi vi khuẩn sợi chỉ cókhuẩn ty cơ chất mà khơng có khuẩn ty khí sinh, nhưng có lồi vi khuẩn sợi thuộc chi

Sporichthya lại chỉ có khuẩn ty khí sinh. Khi đó, khuẩn ty khí sinh vừa làm nhiệm vụ

dinh dưỡng vừa làm nhiệm vụ sinh sản (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2001).

Hình 2.2: Khuẩn ty ở vi khuẩn sợi (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2001)

Khuẩn ty của vi khuẩn sợi thường mảnh hơn của nấm mốc, đường kính từ 0,2 - 3µm, khơng có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Sau một thời gian sinh trưởng, ở đầucác khuẩn ty khí sinh thường hình thành các sợi bào tử. Khuẩn ty không mang bào tửgọi chung là khuẩn ty dinh dưỡng. Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổnđịnh và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Đặc điểm này phân biệt với nấmmốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn thay đổi từ 5 – 50 µm, dễ quan sát

bằng mắt thường (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2001).

c. Thành thế bào

Theo Nguyễn Lân Dũng và ctv. (2001) thành tế bào vi khuẩn sợi có dạng kết cấu

lưới dày khoảng 10 – 20 nm, có tác dụng duy trì hình dạng của khuẩn ty và bảo vệ tếbào. Căn cứ vào kết cấu hóa học người ta chia thành tế bào thành 4 nhóm:

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

- Nhóm CW I: có chứa L, L-DAP và glycin. Thuộc nhóm này có các chi:

Streptomyces, Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides.

- Nhóm CW II: có chứa mezo-DAP và glycin. Thuộc nhóm này có các

chi: Micromonospora, Actinoplanes, Ampullariella.

- Nhóm CW III: có chứa mezo-DAP. Gồm các chi Dermatophilus,

Geodermatophilus, Frankia, Actinomadura, Nocardiopsis, Microbispora,Thermoactinomyces, Thermomonospora, Planomonospora, Planobispora,Streptosporangium, Actinosynnema.

- Nhóm CW IV: có chứa mezo-DAP, arabionose và galactose. Gồm các

chi Nocaridia, Oerskovia, Promicromonospora, Pseudonocardia, Rhodococcus,

Mycobacterium, Saccharomonospora, Saccharopopyspora, Actinopolyspora.

Thành tế bào vi khuẩn sợi chủ yếu gồm 03 lớp: lớp ngoài dày 60 – 120 Å, khi giàcó thể dày tới 150 Å; lớp giữa rắn chắc dày 50 Å và lớp trong dày 50 Å. Thành tế bàocấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptide gồm các gốc N-acetylglucosamin liên kết vớiN-acetymuramic bởi liên kết 1,4-glycoside. Lớp ngồi thành tế bào vi khuẩn sợi có cấutạo bằng lipid. Thành tế bào vi khuẩn sợi không chứa cellulose hay chitin. Vi khuẩnsợi phân lập từ các vùng ngập mặn có thành tế bào dày hơn và độ bền cơ học cao hơn,có thể chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường (nồng độ muối từ 3 - 4%, pH từ6,8

– 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20 – 35oC). Thành tế bào của nhóm vi khuẩn sợi chịukiềm ngồi peptidoglycan cịn có chứa nhiều acid như acid galacturonic, acid glutamic,acid aspartic và acid phosphoric. Với điện tích âm, bề mặt thành tế bào có thể hấp thụcác ion Na+, H+, ngược lại thải các ion OH-. Bên cạnh đó, tuy nhóm vi khuẩn sợi trungtính và nhóm chịu kiềm có lớp peptidoglycan giống nhau về cấu trúc nhưng lại khácnhau về thành phần hợp chất cấu thành, vi khuẩn sợi ưa kiềm chứa nhiều hesoamin vàacid amin (Kamekura và Kates, 1999).

d. Sự hình thành bào tử ở vi khuẩn sợi

Một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại vi khuẩn sợi là dựa vào hình

thái và kích thước của cuống sinh bào tử (Barka et al., 2016). Sợi bào tử có thể có

nhiều hình dạng khác nhau tùy theo loài: thẳng-lượn sóng (retiflexibilis), xoắn(spirales) hoặc có móc, vịng (retinaculiaperti)… có loại mọc vịng một cấp, có loạimọc vịng hai cấp. Một số vi khuẩn sợi có sinh nang bào tử, bên trong có chứa các bàotử nang. Bề mặt của bào tử có thể nhẵn (smooth), gai (spiny), tóc (hairy), xù xì(warty), nếp nhăn (rugose)… tùy thuộc vào lồi vi khuẩn sợi. Sự hình thành bào tử bắtnguồn từ sự hình thành khuẩn ty khí sinh. Bào tử vi khuẩn sợi được hình thành theo baphương thức sau đây: (1) phương thức sinh trưởng toàn bộ (tồn bộ hay một bộ phậncủa khuẩn ty hình thành ra bào tử); (2) phương thức sinh trưởng trong thành ( bào tửsinh ra từ tầng nằm giữa màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ty), trường hợp này

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

gặp ở chi Planomonospora; (3) phương thức sinh trưởng bào tử nội sinh thật (thành

khuẩn ty không tham gia vào quá

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

trình hình thành bào tử), trường hợp này gặp ở chi Thermoactinomycetes (Barka et al.,

2016). Có mối quan hệ giữa sự hình thành bào tử và môi trường nghèo dinh dưỡng

trong nuôi cấy vi khuẩn sợi (Barka et al., 2016). Việc bổ sung CaCO3 và CaCl2 vàomơi trường sẽ kích thích sự hình thành bào tử ở vi khuẩn sợi. Tuy nhiên, việc bổ sungcác nguyên tố vào môi trường phải được nghiên cứu kỹ và chỉ sử dụng ở nồng độ nhấtđịnh. Nếu mơi trường giàu dinh dưỡng thì q trình hình thành bào tử thường sẽ bị

kìm hãm. Độ ẩm và nhiệt độ đều có ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử (Schmidt et

al., 2005).

Bào tử vi khuẩn sợi được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein vớiđộ dày khoảng 300 – 400 Å chia làm 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi nhữngtác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH,… Hình dạng, kích thướcchuỗi bào tử, cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặcđiểm quan trọng dùng trong phân loại vi khuẩn sợi. Tuy nhiên những tính trạng này cóthể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau

(Shamar et al., 2014; Barka et al., 2016).

e. Một số điểm đặc biệt trong di truyền học và sinh hóa của vi khuẩn sợi

Vi khuẩn sợi thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt khác với những vi sinhvật nhân sơ khác là tỷ lệ G – C cao (xấp xỉ 70% hoặc hơn) trong khi đó ở vi khuẩn là25

– 45% (Ventura et al., 2007; Verma et al., 2013). Ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm

sắc thể cịn có các plasmid có thể tự nhân đôi. Các plasmid này đem lại cho tế bàonhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất,chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gen, sản xuất

các chất kháng khuẩn (Ventura et al., 2007). Vi khuẩn sợi không ổn định về di truyền

và thường xảy ra đột biến trong phân tử DNA. Điều này tạo ra tính đa dạng về hìnhthái, tính kháng thuốc. Sự tự nhân lên của các đoạn DNA làm cho việc nghiên cứu di

truyền ở vi khuẩn sợi phức tạp hơn (Ventura et al., 2007).

Vi khuẩn sợi thuộc loại sinh vật dị dưỡng, sử dụng nguồn carbon đa dạng gồmđường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton,cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là các muối nitrate. Khả năng đồng hoá các

chất thay đổi tùy theo chủng, loài khác nhau (Barka et al., 2016).

f. Vòng đời hay chu kỳ sống của vi khuẩn sợi

Vi khuẩn sợi có vịng đời khá phức tạp bắt đầu bằng sự nẩy mầm của những bàotử, phát triển khuẩn ty dinh dưỡng rồi khuẩn ty phân nhánh và xuyên thấu vào cơ chấtđể giữ vững tế bào và hấp thu chất dinh dưỡng, tiêu hoá phần hữu cơ (polysaccharides,proteins, lipids và hợp chất hữu cơ khác), bởi những enzymes ngoại bào. Khuẩn tydinh dưỡng hay khuẩn ty sơ cấp phát triển tiếp thành khuẩn ty thứ cấp hay khuẩn tyhiếu khí trên bề mặt cơ chất và bắt đầu cho giai đoạn sinh sản và hình thành bào tử,

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

tiếp tục quay trở lại vòng đời (Barka et al., 2016).

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

Vòng đời của vi khuẩn sợi thay đổi theo nguồn dinh dưỡng, với nguồn dưỡngchất dồi dào sẽ cho các khuẩn ty phát triển tốt. Ngược lại, chỉ có khuẩn ty dinh dưỡng

phát triển (Dastager et al., 2006). Hầu hết vi khuẩn sợi (chủ yếu là chi Streptomyces) là

nhóm hoại sinh (saprophytic) sống trong đất và gần như một nửa vòng đời của chúnglà bào tử, chúng bị ảnh hưởng bởi nguồn dưỡng chất, chúng dễ thích nghi với nhiềuđiều kiện sinh thái như mơi trường có chút ít muối và khơng khí hay trong mơi trườngcó nhiều sinh vật khác. Trong điều kiện thiếu dinh dưỡng, vi khuẩn sợi là nhóm mẫn

cảm với nhiệt độ cao nhưng lại chịu đựng tốt trong điều kiện khơ hạn (Manivasagan et

al., 2013). Chúng hình thành bào tử và thay đổi từ động bào tử di động (mobile

zoospores) thành thể bào tử sinh sản đặc biệt (specialized propagules). Vi khuẩn sợi

thuộc nhóm tạo bào tử (chi Streptomyces) sẽ hình thành bào tử trong vùng đặc biệt của

khuẩn ty khí sinh, sản xuất một lượng lớn bào tử và mỗi bào tử nẩy mầm rất mạnh; chi

Thermoactinomyces có nội bào tử (endospores) trong khi các chi Micromonospora,Aleuriospores, Geodermatophilus, Kitasatoa và Oerskovia là nhóm động bào tử di

động (mobile zoospores) (Stackebrandt et al., 1997).

Mật số của vi khuẩn sợi tuỳ thuộc vào hữu cơ trong đất và điều kiện khí hậu, đặcbiệt lớp đất bề mặt đến độ sâu 2 m có tính kiềm hiện diện từ 106 đến 109 CFU/g đất;

thông thường chi Streptomyces chiếm ưu thế, gần 95% những dòng thuộc lớpActinomycetales được phân lập từ đất (Stackebrandt et al., 1997).

Những yếu tố khác như nhiệt độ, pH, và ẩm độ đất có ảnh hưởng đến sự tăngtrưởng của vi khuẩn sợi. Giống như vi khuẩn đất khác, hầu hết chúng là nhóm chịunhiệt (mesophilic) với nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng là 25oC đến 30oC nhưng vẫncó thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn, từ 50 đến 60°C, nhờ vào ẩm độ cao (Edwards,1993). Vi khuẩn sợi phát triển trong đất có pH trung tính, tốt nhất trong khoảng 6 và 9.

Tuy nhiên vài dòng của chi Streptomyces được phân lập từ đất phèn có pH 3,5 (Kim et

al., 2003). Nghiên cứu đầu tiên về ảnh hưởng của khí hậu trên sự phân bố của vi khuẩn

sợi được thực hiện bởi ltner và Strömer (Madigan et al., 2010), đếm và ghi nhận số vi

khuẩn sợi này chỉ có 20% trong tổng số các nhóm vi sinh vật vào mùa xuân và hơn30% vào mùa thu vì mùa này có một lượng lớn xác bã thực vật; đến mùa đông, tuyếtlàm giảm mật số vi khuẩn sợi xuống cịn 13%.

2.3.4 Phân loại (Taxonomy) vi khuẩn sợi

Khóa phân loại vi khuẩn sợi cổ điển dựa vào những đặc tính phân tử, sinh hố vàsinh lý để phân biệt các loài. Hiện nay, kết hợp thêm các phương pháp hiện đại nhưphân tích bộ gen và phân tích protein, có thể phân chia ngành phụ Actinobacteria chitiết thấp dần đến mức độ lồi phụ (subgroups), ngồi ra cịn có phân loại dựa trên vihình thể (micro-morphology) và sự thay đổi của cấu trúc vỏ tế bào (Bảng 2.1 và 2.2)

(Gao et al., 2006). Phương pháp sinh học phân tử thường dùng nhất hiện nay để địnhdanh và phân loại là phân tích gene 16S rDNA của vi khuẩn sợi (Krishnaveni et al.,

2011).

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

Bên cạnh đó, khóa phân loại vi khuẩn sợi cịn dựa vào sự phân tích thành phần vàcấu trúc của peptidoglycan trên màng tế bào, các chất này khác nhau bởi những acidamin nằm ở vị trí số 3 trong chuỗi tetrapeptides, sự hiện diện của glycine ở giữa cầunối peptide và carbohydrate chứa peptidoglycans. Theo đó, có các nhóm như: nhóm

Actinomyces (V- lysine và Ornithine), Rothia (V - lysine và acid aspartic), Oerskovia

(VI + Gallysine; Galactose; acid Aspartic), Agromyces (2,4-D acid diaminobutyric vàglycine) và Mycoplasma (meso-DAP nhiều loại acid amin khác nhau) (Bull, 2004).

Bảng 2.1: Những dữ liệu chính yếu và những mối quan hệ đến sự phân loại vi khuẩn sợi(Bull, 2004)

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

vỏ tế bào

Acid DAP: diaminopimelic

được phát hiện

Streptomyces (Streptoverticillium, Chainia,

Actinopycnidium, Actinosporangium, Elytrosporangium); Microellobosporia; Actinoplanes;

Amorphosporangium; Ampullariella;

DactylosporangiActinomadura, Dermatophilus Microbiospora,Pilimelia Actinoplanes Frankia

Streptosporangium;

Spirillospora; Planomonospora Dermatophilus Nocardia

Rhodococcus Corynebacterium Mycobacterium Saccharomonospora

Khơng có arabinosevà xylose

Meso Galactose, arabinosevà khơng có xylose

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

Micropolyspora Pseudonocardia Thermomonospora

Loaivỏ tế bào

Acid DAP: diaminopimelic

được phát hiện

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Bảng 2.2: Phân phối Loài và Chi của ngành Vi khuẩn sợi cùng với Lớp, Bộ và Họ (Bull, 2004)

Tổng số loài

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

Tổng số loài

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

Tổng số loài

Theo Bergey et al. (2000), dựa theo phân tích gen 16S rDNA, vi khuẩn sợi

(Actinobacteria) được xem là một ngành phụ lớn trong giới Vi khuẩn. Phân chia cácngành trong giới Vi khuẩn còn tuỳ thuộc vào sự thêm vào hay bớt đi nhóm proteintrong gen 23S rDNA và sự sắp xếp khác nhau của các gen. Vi khuẩn sợi được chia làm2 nhóm: nhóm có khuẩn ty thơ theo sau bởi những đoạn khuẩn ty dinh dưỡng; nhómcó một mạng khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium network) với nhiều bào tử. Các chi

trong nhóm thứ hai này gồm có Streptomyces, Actinoplanes, và Microbispora, ...

Ngành phụ Actinobacteria bao gồm 5 lớp (classes), 19 bộ (orders), 50 họ (families) và221 chi (genera). Năm lớp là: Acidimicrobiia, Actinobacteria, Coriobacteriia,Rubrobacteria và Thermoleophilia. (Hình 2.3 và Hình 2.4).

Hình 2.3: Tỷ lệ phân bố của các lớp khác nhau trong ngành vi khuẩn sợi. (Yadav et al., 2018)

</div>