Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.57 MB, 203 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN TUẤN HẢI

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN

CÁC VI KHUẨN SỢI (ACTINOBACTERIA) TẠO KHÁNG SINH TRONG ĐẤT

RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ 94 20 201

2024

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ 94 20 201

NGƯỜI HƯỚNG DẪN GS.TS. CAO NGỌC ĐIỆP

2024

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

iii

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Luận án này với tựa đề là “Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ chí Minh”, do nghiên cứu sinh Nguyễn Tuấn Hải thực hiện theo sự hướng dẫn của GS.TS. Cao Ngọc Điệp. Luận án đã báo cáo và được Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ thông qua ngày: …../…../ 20…. Luận án đã được chỉnh sửa theo góp ý và được Hội đồng đánh giá luận án xem lại.

Thư ký Ủy viên

Ủy viên Phản biện 3

Phản biện 2 Phản biện 1

Người hướng dẫn Chủ tịch hội đồng

GS.TS. Cao Ngọc Điệp

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện, Phòng Đào tạo, Phòng Quản lý Khoa học, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác củaTrường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập và nghiên cứu tại trường.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Sài Gòn, Ban Lãnh đạo Khoa Môi Trường - Trường Đại học Sài Gòn đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt thời gian làm nghiên cứu sinh.

Chân thành gửi lời cảm ơn đến các anh chị, các bạn đồng nghiệp thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Cần Thơ và Khoa Mơi Trường - Trường Đại học Sài Gịn đã quan tâm, giúp đỡ và động viên, chia sẻ khó khăn với tơi.

Chân thành cảm ơn các thầy cơ và anh chị chun viên tại các phịng thí nghiệm liên quan cũng như các em sinh viên, các anh chị đồng học nghiên cứu sinh tại Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Cần Thơ đã cộng tác cùng tôi trong thời gian thực hiện các thí nghiệm. Đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS.Trần Thị Giang, phòng thí nghiệm Vi sinh mơi trường, Viện Cơng nghệ Sinh học và Thực phẩm Trường Đại học Cần Thơ, người đã hỗ trợ tơi rất nhiều trong q trình triển khai và thực hiện nghiên cứu. Sau cùng xin được gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, những người thân trong gia đình, đã hết lịng ưu ái, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian đi lại học tập giữa hai thành phố lớn.

Nguyễn Tuấn Hải

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

TÓM

TẮT

Rừng ngập mặn có vai trị sinh học quan trọng. Vi khuẩn sợi là nguồn cung cấp

kháng sinh và các hoạt chất sinh học ứng dụng rộng rãi. Đề tài “Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ chí Minh” phân lập, chọn lọc và phân tích hoạt chất kháng khuẩn

của những chủng vi khuẩn sợi từ đất ngập mặn Cần Giờ. Đề tài phân lập đuợc 48 chủng vi khuẩn sợi, chọn được 8 chủng có tính kháng khuẩn, nhận diện dựa vào trình tự đoạn

gen 16S rDNA. Kết quả đều là vi khuẩn Gram dương thuộc chi Streptomyces, họ

Streptometaceae, bộ Actinomycetales, lớp Actinobacteria, ngành Actinobacteria; với 8

loài khác nhau: Streptomyces tendae, S. tanashiensis, S. parvulus, S. celluloflavus, S.

aegytia, S. africanus, S. albogriseolus và S. laurentii. Có 3 chủng (Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1, S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S. parvulus

ANTHOIDONG 3.1) kháng được 4 vi khuẩn gây bệnh cho người là Bacillus cereus,

Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus và Staphylococcus aureus. Tỷ lệ hiện diện

của gen chỉ thị kháng sinh, 8/8 chủng vi khuẩn sợi đều mang gen nrps, 4/8 chủng mang gen pksI, đặc biệt là 50% các chủng mang cả 2 gen nrps và pksI. Chọn được 2 dòng vi khuẩn sợi tạo kháng sinh hay kháng các vi khuẩn gây bệnh tốt nhất (S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1) để trích ly hoạt chất bằng

ethyl acetate, thu được cao chiết chứa hoạt chất ức chế 3 vi khuẩn gây bệnh cho người

là Bacillus cereus, Escherichia coli, và Staphylococcus aureus; sử dụng kỹ thuật MS phân tích thành phần hoạt chất. Cao chiết của chủng S. albogriseolus

GC-ANTHOIDONG 7.1 xác định được 6 hoạt chất sinh học tiêu biểu như: Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; dẫn xuất 3TMS của acid 2,6- dihydroxybenzoic; Heptasiloxane, hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec; Tetracosamethyl, cyclododecasiloxane.

Chủng S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 phát hiện được 7 hoạt chất tiêu biểu, bao

gồm: 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Benzoic acid, 2-hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene; và Heptasiloxane, hexadecamethyl (hai chất Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl và Heptasiloxane, hexadecamethyl xuất hiện ở cả hai chủng), hợp chất Siloxane được xác định tính kháng khuẩn. Các chất này được tài liệu quốc tế ghi nhận tính kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa. Hoạt chất sinh học của hai dịng vi khuẩn sợi giữ được tính kháng khuẩn sau q trình xử lý dung môi, mở ra khả năng ứng dụng vào sản xuất thành thuốc đồng thời là cơ sở để khai thác nguồn dược liệu tiềm năng từ vi khuẩn sợi của đất rừng ngập mặn, góp phần tăng hiệu quả trị bệnh ở người. Như vậy, loài vi khuẩn sợi và sinh chất

hiện diện đất ngập mặn Cần Giờ tương đồng với các vùng ngập mặn trên thế giới.

Từ khóa: gen nrps, kháng sinh, rừng ngập mặn Cần Giờ, Streptomyces, vi khuẩn sợi

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

ABSTRACT

Mangrove forests play an important biological role. Actinobacteria are a source of

antibiotics and other useful substances. This thesis "Isolation and selection of antibiotic-producing Actinobacteria from Can Gio mangrove soil, Ho Chi Minh city" isolated, selected and analyzed antibacterial ingredients of actinobacterial strains

from Can Gio mangrove soil. The project isolated 48 strains, selected 8 strains with antibacterial properties, and identified them based on the 16S rDNA gene fragment

sequence. All such strains belong to the genus Streptomyces, family Streptometaceae,

order Actinomycetales, class Actinobacteria, phylum Actinobacteria, and Gram-positive

bacteria, with 8 species: Streptomyces tendae, S. tanashiensis, S. parvulus, S.

celluloflavus, S. aegytia, S. africanus, S. albogriseolus and S. laurentii. Among them, 3

strains (Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1, Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 and Streptomyces parvulus ANTHOIDONG 3.1)were resistant to

4 human pathogens Bacillus cereus, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus and

Staphylococcus aureus. The presence of antibiotic genes, 8/8 actinobacteria strains carry nrps gene, 4/8 strains carry pksI gene, especially 50% of strains carry both nrps and pksI

genes. Two strains with the best antimicrobial ability (S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 and S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1) were extracted bioactives using ethyl acetate. This extract inhibited 3 human pathogens (Bacillus cereus, Escherichia coli, and Staphylococcus aureus) and was analyzed for antibacterial ingredients by GC-MS. Spectrum analysis of S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 extract obtained at least 6

active ingredients; including Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; 2,6 dihydroxybenzoic acid 3TMS; Heptasiloxane, hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec; and Tetracosamethyl,

cyclododecasiloxane. For S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 extract, obtained at least

7 major components: 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Cyclododecane; Benzoic acid, 2-hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene and Heptasiloxane, hexadecamethyl (in those, 2 compounds, namely Cycloheptasiloxane,

tetradecamethyl and Heptasiloxane, hexadecamethyl, were same as in S.albogriseolus

ANTHOIDONG 7.1 extract). These substances, particularly siloxanes, have been reported antimicrobial, antifungal and antioxidant. Bioactive ingredients of two actinobacteri strains retain their antibacterial properties after solvent treatment, opening up the possibility of application in the production of drugs and simultaneously serving as a basis for exploiting potential medicinal sources from mangrove soil actinobacteria, contributing to increase the effectiveness of treating human diseases. Thus, the species of actinobacteria along with bioactives present in Can Gio mangrove soil are similar to other mangrove areas in the world.

Key words: actinobacteria, antibiotics, Can Gio mangrove, nrps gene, Streptomyces

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

1.2 Mục tiêu nghiên cứu ... 2

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ... 2

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ... 2

1.5. Nội dung nghiên cứu ... 3

1.6. Đóng góp mới của luận án ... 3

1.7. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án ... 4

2.3.1 Giới thiệu về thuật ngữ vi khuẩn sợi (xạ khuẩn) ... 8

2.3.2 Phân bố của vi khuẩn sợi trong tự nhiên ... 9

2.3.3. Đặc điểm sinh học tổng quát của vi khuẩn sợi... 9

2.3.4 Phân loại (Taxonomy) vi khuẩn sợi ... 13

2.3.5. Những ứng dụng công nghệ sinh học của vi khuẩn sợi ... 18

2.4. Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp ... 19

2.4.1 Lược khảo chung về kháng sinh ... 19

2.4.2 Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp: ... 21

2.5. Sự tồn tại của các gen chỉ thị kháng sinh (pks-I, pks-II và nrps) để nhận diện vi khuẩn sợi có khả năng tổng hợp kháng sinh ... 26

2.6. Một số thành tựu nghiên cứu về vi khuẩn sợi tổng hợp kháng sinh phân lập từ rừng ngập mặn ... 31

2.6.1 Trên thế giới ... 31

2.6.2. Nghiên cứu trong nước ... 36

CHƯƠNG 3 ... 37

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 37

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ... 37

3.2. Phương tiện nghiên cứu ... 37

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

3.2.1 Nguyên vật liệu ... 37

3.2.2 Thiết bị - dụng cụ ... 39

3.2.3 Hóa chất – mơi trường ... 39

3.3 Phương pháp nghiên cứu... 41

3.3.1 Thu thập và xử lý mẫu ... 41

3.3.2 Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn sợi ... 42

3.3.3 Đánh giá khả năng kháng khuẩn ... 45

3.3.4. Nhận diện vi khuẩn sợi bằng phương pháp sinh học phân tử ... 46

3.3.5 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS... 49

3.3.6. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ vi khuẩn sợi tiềm năng được tuyển chọn ... 53

CHƯƠNG 4 ... 57

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 57

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn sợi ... 57

4.1.1 Số lượng, nguồn gốc vi khuẩn sợi phân lập được: ... 57

4.1.2 Đặc điểm hình thái các dịng vi khuẩn sợi phân lập được ... 58

4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ... 64

4.3 Kết quả định danh và cây phả hệ di truyền ... 68

4.3.1 Định danh các dòng vi khuẩn sợi kháng khuẩn mạnh ... 68

4.3.2 Hình thái của các chủng vi khuẩn sợi được chọn ... 71

4.4 Sự hiện diện của các gen chỉ thị kháng sinh ... 79

4.5. Chất kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợi được chọn ... 84

4.5.1 Chiết tách chất kháng khuẩn của 2 dòng vi khuẩn sợi ... 84

4.5.2 Kết quả phân tích GC-MS chất kháng khuẩn của vi khuẩn sợi Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 ... 88

4.5.3 Kết quả phân tích GC-MS chất kháng khuẩn của vi khuẩn sợi Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 ... 95

CHƯƠNG 5 ... 107

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ... 107

5.1 Kết luận ... 107

5.2 Đề xuất ... 108

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 109

DANH MỤC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ ... 133

PHỤ LỤC ... 134

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Dữ liệu phân loại VKS ... 14

Bảng 2.2: Phân phối Loài và Chi của VKS theo Lớp, Bộ, Họ ... 15

Bảng 2.3: Những cặp mồi khuếch đại gen của VKS ... 28

Bảng 3.1: Danh sách mẫu đất lấy tại huyện Cần Giờ ... 38

Bảng 3.2: Thành phần môi trường SCA ... 39

Bảng 3.3: Thành phần môi trường LB ... 40

Bảng 3.4: Thành phần môi trường MHA ... 40

Bảng 3.5: Quy ước khả năng kháng khuẩn ... 46

Bảng 3.6: Thành phần hóa chất để PCR nhận diện VKS ... 48

Bảng 3.7: Thành phần hóa chất để PCR gen pksI... 50

Bảng 3.8: Thành phần hóa chất để PCR gen pksII ... 51

Bảng 3.9: Thành phần hóa chất để PCR gen nrps ... 52

Bảng 3.10: Chương trình nhiệt độ phân tích GC-MS ... 56

Bảng 4.1: Nguồn gốc và số khuẩn lạc VKS phân lập được... 57

Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc VKS phân lập được ... 60

Bảng 4.3: Khả năng kháng khuẩn của các dòng VKS ... 65

Bảng 4.4: Mức độ tương đồng gen (định danh) VKS với GenBank ... 69

Bảng 4.5: Sự hiện diện các gen chỉ thị kháng sinh trong 8 dòng VKS ... 80

Bảng 4.6: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ VKS S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1... 86

Bảng 4.7: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ VKS S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1... 86

Bảng 4.8: Các chất trong phổ GCMS cao chiết của VKS S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1... 88

Bảng 4.9: Các chất kháng khuẩn của VKS S.albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 ... 91

Bảng 4.10: Thành phần chất kháng khuẩn tiêu biểu của VKS S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1... 92

Bảng 4.11: Các chất trong phổ GCMS cao chiết của VKS S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1... 96

Bảng 4.12: Các chất kháng khuẩn của VKS S.celluloflavus ANTHOIDONG 4.1... 100

Bảng 4.13: Thành phần chất kháng khuẩn tiêu biểu của VKS S.celluloflavus ANTHOIDONG 4.1... 102

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn sợi trên mơi trường thạch ... 9

Hình 2.2: Khuẩn ty của vi khuẩn sợi (VKS) ... 10

Hình 2.3: Tỷ lệ phân bố các lớp trong ngành VKS ... 17

Hình 2.4: Tỷ lệ phân bố các chi trong ngành VKS ... 18

Hình 2.5: Cấu trúc hóa học của một số kháng sinh cơ bản ... 20

Hình 2.12: Một số chất sinh học mới của VKS ... 25

Hình 2.13: Sự tăng trưởng của vi khuẩn sợi trong mơi trường lỏng ... 32

Hình 2.14: Mối quan hệ di truyền trong trình tự các vùng KS trên gen pksI ... 35

Hình 3.1: Sơ đồ chương trình nghiên cứu tồn thể đề tài... 37

Hình 3.2: Bối cảnh nơi lấy mẫu đất trong rừng ngập mặn Cần Giờ ... 41

Hình 3.3: Bản đồ vị trí lấy mẫu tại huyện Cần Giờ ... 42

Hình 3.4: Quy trình pha lỗng mẫu đất với nước cất vơ trùng ... 43

Hình 3.5: Quy trình cấy chuyển ... 43

Hình 3.6: Phân loại khuẩn lạc và nhuộm Gram ... 44

Hình 3.7: Chương trình nhiệt độ phản ứng PCR đoạn gen 16S rDNA ... 48

Hình 3.8: Hệ thống điện tốn giải trình tự ... 49

Hình 3.9: Quy trình tách chiết hợp chất sinh học của VKS ... 54

Hình 4.1: Hình dạng một số khuẩn lạc VKS trên mơi trường SCA ... 59

Hình 4.2: Tỷ lệ màu sắc các khuẩn lạc của VKS phân lập được ... 62

Hình 4.3: Tỷ lệ hình dạng các khuẩn lạc của VKS phân lập được ... 63

Hình 4.4a: Tỷ lệ theo dạng bìa khuẩn lạc của VKS phân lập được ... 64

Hình 4.4b: Số lượng theo dạng bìa của VKS phân lập được ... 64

Hình 4.5: Số lượng dịng VKS có tính kháng khuẩn ... 67

Hình 4.6: Số lượng dịng VKS theo mức độ kháng khuẩn ... 67

Hình 4.7: Hoạt tính kháng khuẩn của dịng VKS ANTHOIDONG 7.1 ... 68

Hình 4.8: Hoạt tính kháng khuẩn của dịng VKS ANTHOIDONG 4.1 ... 68

Hình 4.9: Giản đồ phân nhóm di truyền 8 dòng VKS bằng Maximum Likehood ... 70

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

xii

Hình 4.10: Dịng VKS Streptomyces celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 ... 72

Hình 4.11: Dịng VKS S. aegyptia ANTHOIDONG 6.1 ... 72

Hình 4.12: Dịng VKS S. laurentii ANTHOIDONG 11.1 ... 73

Hình 4.13: Dịng VKS Streptomyces tanashiensis ANTHOIDONG 3.2 ... 73

Hình 4.14: Dịng VKS Streptomyces albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 ... 74

Hình 4.15: Dịng VKS Streptomyces parvulus ANTHOIDONG 3.1 ... 76

Hình 4.16: Dịng VKS Streptomyces africanus LONGHOA 4.2 ... 78

Hình 4.17: Dịng VKS Streptomyces tendae THANHAN 4.4 ... 78

Hình 4.18: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại gen nrps ... 81

Hình 4.19: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại gen pksI ... 81

Hình 4.20: Vịng kháng khuẩn của cao chiết từ 2 dịng VKS chọn lọc ... 85

Hình 4.21: Phổ GCMS 6 đỉnh chất kháng khuẩn của VKS S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 ... 91

Hình 4.22: Phổ GC-MS với 7 đỉnh chất kháng khuẩn của VKS S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1 ... 101

Hình 4.23: Cấu trúc chuỗi Siloxane ... 104

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

EDTA: EthyleneDiamineTetraacetic Acid EtOAc: ethyl acetate

GC-MS: gas chromatography - massive spectrophotometry (sắc kí khối phổ) GTP: guanosine triphosphate

MMA: Modified Marine Agar

NCBI: national center for biotechnology information NRPS: non-ribosomal polyketide synthetase

PCR: polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi dây chuyền) RNA: ribonucleic acid

rRNA: Ribosome RiboNucleic Acid SCA: starch casein agar

ISP: International Streptomyces Projects (chương trình vi khuẩn sợi quốc tế) SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis SYP-SW: Starch - Yeast extract – Peptone – Sea Water

TE: Tris EDTA VKS: vi khuẩn sợi

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1. 1 Đặt vấn đề

Vi sinh vật gây bệnh thường xuyên đe dọa sức khỏe người và động vật. Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra penicillin, một loại kháng sinh điều trị các bệnh nhiễm trùng, góp cơng vào nền y học. Kháng sinh là nhóm thuốc có tác dụng tiêu diệt trực tiếp hoặc làm chậm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, giúp cho hệ miễn dịch của con

người ức chế quá trình nhiễm khuẩn (Kohanski et al., 2010). Ngoài ra, những chất kháng

sinh, kháng khuẩn còn được ứng dụng trong một số lĩnh vực khác như chăn nuôi, bảo

quản thực phẩm, bảo vệ thực vật… (Ceylan et al., 2008). Tuy nhiên, hiện nay đang có

sự xuất hiện của các vi khuẩn gây bệnh đề kháng lại kháng sinh ngày càng nhiều. Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất chất kháng sinh là: cải tiến các chất kháng sinh hiện có để tránh tình trạng kháng thuốc, đồng thời thúc đẩy nghiên cứu

tìm ra các chất kháng sinh, kháng khuẩn mới (Xu et al., 2014).

Trong số các vi sinh vật có khả năng tạo chất kháng sinh, vi khuẩn sợi (actinobacteria) hay còn gọi là xạ khuẩn đóng vai trị quan trọng, với khoảng 80% các chất kháng sinh được phát hiện có nguồn gốc từ vi khuẩn sợi, đặc biệt là các loài thuộc

chi Streptomyces (Berdy, 2005). Tuy nhiên, hiện nay việc phân lập các loài vi khuẩn sợi từ những nguồn đặc biệt khác (ngồi Streptomyces trong đất) để tìm kiếm kháng sinh mới là rất cần thiết (Sirisha et al., 2013). Trong xu hướng này, những loài vi khuẩn sợi

phân lập từ các nguồn gốc biển được quan tâm nhiều hơn do khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp (secondary metabolites) với nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như chất

kháng khuẩn, kháng nấm, hợp chất ngăn ngừa ung thư, ức chế khối u (Xu et al., 2014).

Rừng ngập mặn là một tập hợp các loài cây nhiệt đới, cận nhiệt đới và cây bụi thích

nghi với vùng khắc nghiệt giữa biển và đất liền (Ottoni et al., 2015). Các hệ sinh thái ở

rừng ngập mặn bị ngập nước theo thủy triều, do đó, biến động về hàm lượng muối và chất dinh dưỡng trong đất. Dựa vào cơ chế điều tiết muối, thực vật rừng ngập mặn được chia thành hai nhóm: nhóm một là những cây có tuyến muối (secretor) hoặc lông muối trên lá, giúp bài tiết lượng muối dư thừa; nhóm hai là những cây khơng có lá mang tuyến muối, sẽ tích lũy muối vào vỏ cây hoặc tế bào thịt lá và sẽ được thải ra ngoài khi lá rụng

hay khi tróc vỏ (Miththapala, 2008; Spelchan et al., 2014).

Sự đa dạng về hệ động-thực vật cùng với các lợi ích của rừng ngập mặn được ghi nhận trong nhiều tài liệu (Thatoi và Biswal, 2008; Miththapala, 2008). Rừng ngập mặn có chức năng điều tiết lũ, hấp thu các chất ô nhiễm, tăng tính ổn định cho các vùng duyên hải. Nguồn carbon dồi dào từ xác bã động-thực vật ở đây khiến cho rừng ngập

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Thời gian qua, Việt Nam có nhiều nghiên cứu về tiềm năng kháng khuẩn của các loài vi sinh vật khác nhau. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi sinh vật rừng ngập mặn Cần Giờ nói riêng vẫn còn rải rác trên nhiều đối tượng như: vi khuẩn cố định đạm (Đinh Thúy Hằng và Trần Triết, 2009); vi khuẩn liên kết thực vật và vi khuẩn sống trong đất

vùng rễ cây rừng ngập mặn ở Cà Mau (Hồ Thanh Tâm và ctv., 2016-2017); vi sinh vật

ở vùng ven biển Hải Phòng (Đỗ Mạnh Hào và Phạm Thiên Thư, 2010); vi khuẩn sinh tổng hợp polyhydroxyalkanoates từ rừng ngập mặn Quảng Ninh (Đoàn Văn Thược và Nguyễn Thị Bình, 2012)... Từ đây đặt ra nhu cầu nghiên cứu các loài vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn, bổ sung nguồn tiềm năng để thu nhận các chất thứ cấp, đặc biệt là kháng

sinh mới để ức chế vi khuẩn gây bệnh hiệu quả hơn (Dương Văn Hợp và ctv., 2011).

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ chí Minh có khả năng tổng hợp các chất ức chế vi khuẩn gây bệnh cho con người.

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng là các vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn có khả năng tạo kháng sinh. Nghiên cứu được giới hạn trong các mẫu đất rừng ngập mặn thuộc 6 đơn vị hành chính cấp xã của huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh, thu thập trong thời gian từ tháng 02 đến tháng 4 năm 2019.

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thu mẫu và tiến hành phân lập, tuyển chọn các dịng vi khuẩn sợi có khả năng tổng hợp kháng sinh được thực hiện từ tháng 02 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020. Sau đó định danh vi khuẩn sợi từ tháng 11 năm 2020 đến tháng 4 năm 2021.

Các nghiên cứu vi sinh vật được tiến hành tại các phịng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường, Sinh học phân tử thuộc Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm, trường Đại học Cần Thơ. Một số phân tích GC-MS và hóa học chun sâu khác được thực hiện bởi Bộ môn Khoa Học Môi Trường, khoa Môi Trường và Tài Nguyên Thiên Nhiên, Đại Học Cần Thơ.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

1.5. Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu bao gồm các nội dung:

- Thu thập mẫu đất rừng ngập mặn Cần Giờ, phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh.

- Nhận diện các dòng vi khuẩn sợi bằng kỹ thuật khuếch đại và giải trình tự đoạn gen 16S rDNA, với cặp mồi đặc hiệu S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C-Act-0878-a-A-19

(Sun et al., 2015), so sánh trình tự thu được với cơ sở dữ liệu trực tuyến trên GenBank

và đề xuất tên phân loại vi khuẩn sợi đồng thời xây dựng giản đồ phân nhóm di truyền bằng phần mềm MEGA.

- Thu nhận hoạt chất kháng vi khuẩn gây bệnh, kiểm tra hoạt tính và phân tích thành phần hóa chất theo các phương pháp phân tích phổ sử dụng máy sắc ký ghép khối phổ (GC-MS).

1.6. Đóng góp mới của luận án

Đã phân lập được 48 chủng vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, trong đó, có 10 chủng kháng lại ít nhất một trong bốn loài vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm

là Bacillus cereus (8 chủng), E. coli (4 chủng), S. aureus (6 chủng) và V.

parahaemolyticus (3 chủng). Mười chủng vi khuẩn sợi này được tuyển chọn và định

danh ghi nhận được 8 dòng đều thuộc chi Streptomyces họ Streptometaceae, bộ

Actinomycetales, lớp Actinobacteria, ngành Actinobacteria; với 8 loài khác nhau:

Streptomyces tendae, S. tanashiensis, S. parvulus, S. celluloflavus, S. aegytia, S. africanus, S. albogriseolus và S. laurentii. Tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các

chất có hoạt tính sinh học trong 8 dòng vi khuẩn sợi được ghi nhận có sự khác nhau, bao

gồm pksI là 50%, pksII là 0% và nrps là 100%.

Đã chọn được hai dịng VKS tiềm năng nhất có khả năng kháng khuẩn cao là S.

albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1. Sáu hợp

chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu được sản xuất từ S. albogriseolus ANTHOIDONG

7.1 được xác định, gồm có: Cyclohexasiloxane, dodecaethyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; dẫn xuất 3TMS của acid 2,6- dihydroxybenzoic; Heptasiloxane, hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec; và

Tetracosamethyl, cyclododecasiloxane. Đối với S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1,

11 hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu được xác định bao gồm: 2-pentanone, hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Benzoic acid, 2-hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene; và Heptasiloxane, hexadecamethyl.

4-Đất rừng ngập mặn Cần Giờ với vi khuẩn sợi là nguồn chất kháng khuẩn tiềm năng nhưng chưa được quan tâm nhiều. Đây là đối tượng mới khi nghiên cứu về vi sinh vật bản địa; là cơng trình nghiên cứu đầu tiên về tính trạng kháng khuẩn và gen chỉ thị kháng

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

sinh của vi khuẩn sợi trong đất ở rừng ngập mặn huyện Cần Giờ. Đồng thời, chất kháng vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn sợi phân lập từ đây góp phần bổ sung nguồn dược liệu có thể khai thác trong tương lai.

1.7. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

Ý nghĩa khoa học của nghiên cứu này nhằm phân lập và chọn lọc vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh có đặc tính tổng hợp được kháng sinh. Kết quả của luận án góp phần làm phong phú tư liệu vi sinh vật học của rừng ngập mặn Việt Nam nói riêng và vùng Đơng Nam Á nói chung về thành phần lồi và các lợi ích. Trong đó, có những lồi mang ý nghĩa kinh tế - xã hội, góp phần trong cơng cuộc tìm kiếm kháng sinh mới.

Ý nghĩa thực tiễn là những vi khuẩn sợi ức chế được nhiều loài vi khuẩn gây hại có thể sẽ là nguồn sản xuất chất kháng sinh, khắc phục hiện tượng kháng thuốc, làm phong phú nguồn dược liệu Việt Nam. Hơn nữa, giá trị của các vi khuẩn sợi như vậy càng khẳng định vai trò của rừng ngập mặn trong hệ sinh thái toàn cầu. Riêng đối với rừng ngập mặn Cần Giờ, thể hiện được sự tươngst đồng về các loài vi khuẩn sợi và thành phần hoạt chất so với các vùng ngập mặn khác trong khu vực và trên thế giới.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về rừng ngập mặn

2.1.1 Khái niệm và phân loại rừng ngập mặn

Rừng ngập mặn là một dạng rừng quan trọng phát triển trên vùng đất ngập nước dọc theo các bờ biển ở những khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới (Spelchan và Nicoll,

2014, Ottoni et al., 2015). Rừng ngập mặn trên thế giới phân bố chủ yếu ở Châu Á

(42%), Châu Phi (20%), Bắc và Trung Mỹ (15%), Châu Đại Dương (12%) và Nam Mỹ (11%); tỷ lệ bao phủ khoảng 60% –75% vùng nhiệt đới toàn cầu và các đường bờ biển

cận nhiệt đới (Giri et al., 2011). Cây rừng ngập mặn chủ yếu là những loài cây thân gỗ,

có hạt và một số cây bụi. Trên thế giới có gần 70 lồi cây rừng ngập mặn với chiều cao thay đổi từ 1,5 m đến 50 m. Những chi thực vật thường thấy trong rừng ngập mặn là chi

Đước (Rhizophora), chi Mắm (Avicennia), chi Bần (Sonneratia), chi Vẹt (Bruguiera)

(Miththapala, 2008). Cây rừng ngập mặn hình thành hai cơ chế thích nghi với điều kiện sống trong mơi trường có nồng độ muối cao: một là trên lá cây có tuyến muối để bài tiết lượng muối thừa; hai là tích lũy muối thừa vào tế bào thịt lá hoặc vỏ cây sau đó sẽ được

thải ra ngồi khi lá rụng hoặc khi tróc vỏ (Miththapala, 2008; Spelchan và Nicoll, 2014).

Tổng diện tích rừng ngập mặn trên toàn thế giới vào khoảng 11 – 18 triệu hecta (Spelchan và Nicoll, 2014). Rừng ngập mặn đóng vai trị quan trọng khi cung cấp các sản phẩm sinh khối động-thực vật cho con người, điều tiết lũ, tích lũy phù sa và chuyển

hóa các nguyên tố dinh dưỡng trong đất (Ewel et al., 1998). Đất rừng ngập mặn là nơi

có độ ẩm cao, độ mặn cao và chịu được tình trạng thiếu oxy, là một hệ sinh thái đa dạng

với nhiều loại vi sinh vật có giá trị (Wu et al., 2016).

Trên thế giới chủ yếu có 3 loại rừng ngập mặn (Miththapala, 2008), bao gồm: • Rừng ngập mặn ven sơng, như tên gọi của nó, xuất hiện dọc theo sơng suối

và bị ngập bởi thủy triều hàng ngày. Loại rừng ngập mặn này có thể được tìm thấy ở Kuraburi và Kapoe, Ranong, Thái Lan.

• Rừng ngập mặn rìa được tìm thấy dọc theo khu bảo vệ các đường bờ biển, các đảo và vùng nước lộ thiên của các vịnh và đầm phá. Các rừng này bị ngập theo thủy triều nhưng không phải chu kỳ ngày đêm như loại ven sơng. Rừng ngập mặn rìa được tìm thấy ở Vịnh Honda, Palawan, Philippine. • Rừng lưu vực: loại rừng này nằm sâu trong đất liền, trong vùng trũng kênh

chảy từ nội địa ra bờ biển. Chúng bị ngập không theo quy luật thủy triều. Rừng ngập mặn lưu vực được tìm thấy ở Maduganga, Galle, Sri Lanka.

2.1.2. Rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Theo Ban quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ (2021), rừng ngập mặn Cần Giờ có tên đầy đủ là Khu Dự trữ Sinh quyển Thế giới Rừng ngập mặn (DTSQTG RNM) Cần Giờ,

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

là Khu DTSQTG đầu tiên của Việt Nam, được UNESCO công nhận vào ngày 21/1/2000, thuộc thuộc khu vực hạ lưu hệ thống sông Đồng Nai – Sài Gịn, nằm ở phía Đơng Nam Thành phố Hồ Chí Minh, với tổng diện tích là 70.445,34 ha. Rừng ngập mặn Cần Giờ được chia làm 3 vùng như sau:

1. Vùng lõi, diện tích 6.134,43 ha, có chức năng bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn cả rừng trồng và rừng tự nhiên; bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn và các môi trường sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nước; bảo tồn thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển để tái sinh tự nhiên cả thực vật lẫn động vật; nghiên cứu khoa học và du lịch sinh thái có giới hạn.

2. Vùng đệm, diện tích 29.152,10 ha đất rừng và 12.763,56 ha diện tích mặt nước), có chức năng phục hồi các hệ sinh thái dựa trên các quần xã chiếm ưu thế; bảo vệ vùng lõi; tạo không gian lớn hơn cho thú hoang hã ngoài vùng lõi; tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hóa nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái; tạo điều kiện cho các mơ hình lâm ngư kết hợp thân thiện với môi trường.

3. Vùng chuyển tiếp có diện tích 13.227,79 ha đất rừng và 7.267,47 ha mặt nước, gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ. Vùng chuyển tiếp có chức năng khuyến khích các mơ hình phát triển kinh tế, hợp tác với sự tham gia của cán bộ quản lý, các cơ sở kinh tế, các tổ chức đoàn thể, tơn giáo, văn hóa, xã hội, các nhà khoa học, các tổ chức giáo dục…

Theo Ban Quản lý rừng phòng hộ Cần Giờ (2021), về đa dạng sinh học, rừng ngập mặn Cần Giờ có hệ động-thực vật rất phong phú, bao gồm:

+ Hệ thực vật: có 318 lồi thực vật bậc cao - Nhóm cây ngập mặn chủ yếu: 37 lồi - Nhóm cây tham gia rừng ngập mặn: 56 lồi - Nhóm cây du nhập: 225 lồi

+ Hệ động vật:

- Cơn trùng: 89 loài - Cá: 282 loài - Lưỡng cư: 36 loài - Bị sát: 36 lồi - Chim: 164 lồi - Thú: 35 loài

+ Phiêu sinh vật: 66 loài động vật nổi, 66 loài thực vật nổi.

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

• Khu bảo tồn dơi (Đầm Dơi) tại tiểu khu 15a là nơi trú ngụ của hơn 500 cá thể

dơi, chủ yếu là loài Dơi ngựa (Pteropus lylei);

• Khu bảo tồn khỉ (Khu Đảo Khỉ), với đàn Khỉ đuôi dài (Maccaca fascicularis)

phát triển trên 1.000 con.

Ngồi ra, rừng ngập mặn Cần Giờ cịn là nơi sinh sống của nhiều loài động-thực vật quý hiếm thuộc Danh mục Sách đỏ Việt Nam năm 2007. Về thực vật có 2 lồi là

Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) và Chùm lé (Azima sarmentosa); về động vật có 9 lồi bao

gồm:

• Thú: Rái cái thường (Lutra lutra), Rái cá vuốt bé (Aonyx cinereus), Mèo cá (Prionailurus viverrinus), Khỉ đi dài (Maccaca fascicularis);

• Chim: Bồ nông chân xám (Pelecanus philippensis), Cổ rắn (Anhinga

melanogaster), Choắt mỏ vàng (Tringa guttifer),

• Bị sát: Rắn hổ chúa (Ophiophagus hannah), • Cá: Cá mang rổ (Toxotes chatareus).

(Nguồn: Ban Quản lý rừng phịng hộ Cần Giờ, 2021)

Để có được sự đa dạng sinh học như trên, rừng ngập mặn Cần Giờ phải trải qua 40 năm phục hồi kể từ khi bị tàn phá bởi chiến tranh trong những năm 1970. Đồng thời, áp lực ô nhiễm môi trường từ các khu công nghiệp và kinh tế năng động của thành phố Hồ Chí Minh vẫn là một nguy cơ cần kiểm soát để bảo vệ sự ổn định của hệ sinh thái rừng

ngập mặn Cần Giờ (Thanh-Nho và ctv., 2019).

2.2. Vi sinh vật trong đất rừng ngập mặn

Mật số vi sinh vật trong đất thường rất dồi dào và đa dạng, ước tính có đến 109

CFU/g đất, thuộc 10.000 loài (Griffiths và Philippot, 2013). Quần xã vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn và nấm mốc, đảm trách rất nhiều chức năng (80 – 90% các phản ứng trong đất thông qua trung gian vi sinh vật), hình thành mùn đất, tuần hồn các yếu tố dinh

dưỡng, cải thiện cấu trúc đất và ảnh hưởng đến cây trồng (Grzadiel et al., 2018).

Đối với đất rừng ngập mặn, nhờ nguồn carbon và dinh dưỡng đầy đủ, các quần xã vi sinh vật rất phát triển, bao gồm vi khuẩn, vi nấm (91%), tảo và động vật nguyên sinh

(Thatoi et al., 2012). Vi sinh vật đất rừng ngập mặn có khả năng chịu mặn và tổng hợp chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt là các vi khuẩn sợi tạo được kháng sinh (Sivakumar et al., 2007; Thatoi et al., 2012).

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

Rừng ngập mặn rất giàu các loại tảo phù du, tảo đáy và tảo nhu động. Chúng thường tập trung ở khu vực gốc, rễ của cây ngập mặn và trong lớp đất bùn mềm. Các lồi tảo này có tính chống chịu khá đối với sự thay đổi độ mặn của môi trường và tạo

được những chất chống đông máu, kháng ung thư (Thatoi et al., 2012).

Đất rừng ngập mặn trên thế giới sở hữu đến 1500 loài vi nấm. Trong số đó, có lồi là tác nhân ký sinh gây bệnh cho cây rừng ngập mặn, nhưng có loài sản sinh ra acid hữu

cơ tham gia vào cơ chế hòa tan lân cung cấp dinh dưỡng cho cây (Thatoi et al., 2012).

Vi khuẩn là quần xã nổi bật và tạo nhiều sinh khối cho rừng ngập mặn, bao gồm các lồi với nhiều tính năng khác biệt như cố định đạm, hòa tan lân, oxy hóa lưu huỳnh,

phân giải cellulose và vi khuẩn sinh methane (Thatoi et al., 2012).

Các loài vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn của Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia được ghi nhận khả năng tổng hợp nhiều loại chất kháng sinh ức chế mạnh vi khuẩn

Gram âm lẫn vi khuẩn Gram dương (Hong et al., 2009 và Retnowati, 2010). Sivakumar

et al. (2007) khẳng định chất kháng sinh của nhóm vi khuẩn sợi nguồn gốc biển (rừng

ngập mặn) mới và độc đáo hơn so với kháng sinh của nhóm vi khuẩn sợi trong đất liền.

Các hợp chất đó phức tạp về cấu trúc và đa năng về hoạt tính sinh học (Hong et al., 2009 và Li et al., 2010). Có hơn 10.000 trong tổng số 23.000 hợp chất có hoạt tính sinh học

được báo cáo do vi khuẩn sợi tổng hợp và 80% các hoạt chất này được thu nhận từ

Streptomyces (Berdy, 2005). Môi trường rừng ngập mặn như vị trí địa lý, pH, nhiệt độ,

độ mặn, độ ẩm và dinh dưỡng rất biến động ở các vùng khác nhau nên vi khuẩn sợi rừng

ngập mặn rất đa dạng và độc đáo; theo thống kê của Amrita et al. (2012) có 24 chi của

11 họ và 8 phân ngành dưới bộ Actinomycetales được phân lập và định danh từ rừng ngập mặn. Có đến 2.000 dịng vi khuẩn sợi được phân lập từ rừng ngập mặn và các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng có tác dụng chống nhiễm trùng, chống khối u và hoạt động ức chế protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), các enzyme phân giải… (Hong

et al., 2009). Tuy nhiên, vì những khó khăn khi ni cấy nên chỉ mơ tả xác định được

rất ít (5%) số lượng chủng lồi, chưa tương xứng với tiềm năng sẵn có (Thatoi et al.,

2012). Do vậy, cần tiếp tục đầu tư nghiên cứu để khai thác trong tương lai.

2.3. Vi khuẩn sợi

2.3.1 Giới thiệu về thuật ngữ vi khuẩn sợi (xạ khuẩn)

Về nguồn gốc danh xưng “vi khuẩn sợi” (actinobacteria), theo Dworkin (2006), nhóm vi sinh vật này có nhiều tên gọi và được phân loại không rõ ràng thành nấm hoặc vi khuẩn. Danh từ “xạ khuẩn” - Actinomycete, được dùng từ năm 1870 đến 1921, (thậm chí hiện nay vẫn dùng ở Việt Nam). Từ sau năm 1980, nhờ những thành tựu trong việc so sánh trình tự 16S rDNA kết hợp với các tiêu chí phân loại hóa học (chemotaxonomic), cùng với đặc điểm những vi sinh vật Gram dương có thể có hoặc khơng có cấu trúc “tia xạ”, Dworkin (2006) đề xuất một tên phân loại mới là Actinobacteria – vi khuẩn sợi (VKS). Do vậy, đây sẽ là từ được dùng trong luận án này.

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

2.3.2 Phân bố của vi khuẩn sợi trong tự nhiên

Vi khuẩn sợi là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong những cơ chất mà các vi sinh vật khác không sinh trưởng được. Số lượng vi khuẩn sợi trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật. Đất giàu dinh dưỡng và lớp đất bề mặt thường có mật số vi khuẩn sợi lớn trong đất. Số lượng vi khuẩn sợi trong đất thay đổi theo thời gian trong năm. Trong đất vùng rễ, vi khuẩn sợi thể hiện tỷ lệ cao về sinh khối vi sinh vật. Mật số của chúng thường chiếm hơn 30% (khoảng 106 đến 109 CFU/g) và thông

thường hai chi Streptomyces và Nocardia chiếm ưu thế, thậm chí Streptomyces có thể chiếm khoảng 95% (Ventura et al., 2007).

Vi khuẩn sợi có nguồn gốc biển thường được phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tích biển ở các độ sâu khác nhau hoặc ở trên các sinh vật biển khác như hải miên

(bọt biển) và san hô (Shamar et al., 2014). Vi khuẩn sợi ở biển thường có khả năng chịu mặn cao, đặc biệt có những lồi Streptomyces spp. có thể sinh trưởng được ở nồng độ NaCl 16% và nhiều loài thuộc chi Streptomyces và Nocardia sinh trưởng tốt khi ở nồng độ NaC l 10%, chi Micromonospora spp. và Salinospora spp. đều có khả năng chịu mặn cao (Solano et al., 2009).

2.3.3. Đặc điểm sinh học tổng quát của vi khuẩn sợi a. Khuẩn lạc

Trên môi trường đặc, vi khuẩn sợi sinh trưởng thành những khuẩn lạc khơ, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện nuôi cấy. Khuẩn lạc của vi khuẩn sợi không trơn, ướt như ở vi khuẩn hay nấm men mà thường có dạng thơ ráp, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ. Bề mặt khuẩn lạc xù xì, có thể có dạng da, dạng vơi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo (Hình 2.1). Màu sắc của khuẩn lạc rất đa dạng: đỏ, da cam,

vàng, lam, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện dinh dưỡng (Nguyễn Lân Dũng và

ctv., 2001).

Hình 2.1: Hình dạng các khuẩn lạc vi khuẩn sợi trên môi trường tinh bột-casein đặc (Starch

casein agar). (Ranjani et al., 2016)

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

b. Khuẩn ty

Vi khuẩn sợi giống có hệ sợi giống nấm mốc, nhưng lại đơn bào, khơng có nhân thực và kích thước giống vi khuẩn. Vi khuẩn sợi có 3 lớp khuẩn ty, lớp vỏ ngồi có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, acid hữu cơ, có thể tích lũy trong sinh khối

của tế bào vi khuẩn sợi hay được tiết ra môi trường (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2001).

Trên môi trường đặc, hệ sợi của vi khuẩn sinh trưởng thành hai hướng tạo thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh (Hình 2.2). Khuẩn ty cơ chất sinh trưởng cắm sâu vào trong môi trường với chức năng chủ yếu là lấy nước và thức ăn. Khuẩn ty cơ chất sinh trưởng một thời gian thì dài ra trong khơng khí tạo thành khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty khí sinh còn được gọi là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với khuẩn ty sơ cấp là loại khuẩn ty sinh trưởng từ các loại bào tử nảy mầm. Nhiều lồi vi khuẩn sợi chỉ có khuẩn ty cơ chất mà khơng có khuẩn ty khí sinh, nhưng có lồi vi khuẩn sợi thuộc chi

Sporichthya lại chỉ có khuẩn ty khí sinh. Khi đó, khuẩn ty khí sinh vừa làm nhiệm vụ

dinh dưỡng vừa làm nhiệm vụ sinh sản (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2001).

Hình 2.2: Khuẩn ty ở vi khuẩn sợi (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2001)

Khuẩn ty của vi khuẩn sợi thường mảnh hơn của nấm mốc, đường kính từ 0,2 - 3 µm, khơng có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Sau một thời gian sinh trưởng, ở đầu các khuẩn ty khí sinh thường hình thành các sợi bào tử. Khuẩn ty khơng mang bào tử gọi chung là khuẩn ty dinh dưỡng. Kích thước và khối lượng hệ sợi thường khơng ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Đặc điểm này phân biệt với nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn thay đổi từ 5 – 50 µm, dễ quan sát bằng mắt

thường (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2001).

c. Thành thế bào

Theo Nguyễn Lân Dũng và ctv. (2001) thành tế bào vi khuẩn sợi có dạng kết cấu

lưới dày khoảng 10 – 20 nm, có tác dụng duy trì hình dạng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Căn cứ vào kết cấu hóa học người ta chia thành tế bào thành 4 nhóm:

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

- Nhóm CW I: có chứa L, L-DAP và glycin. Thuộc nhóm này có các chi:

Streptomyces, Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides.

- Nhóm CW II: có chứa mezo-DAP và glycin. Thuộc nhóm này có các

chi: Micromonospora, Actinoplanes, Ampullariella.

- Nhóm CW III: có chứa mezo-DAP. Gồm các chi Dermatophilus,

Geodermatophilus, Frankia, Actinomadura, Nocardiopsis, Microbispora, Thermoactinomyces, Thermomonospora, Planomonospora, Planobispora, Streptosporangium, Actinosynnema.

- Nhóm CW IV: có chứa mezo-DAP, arabionose và galactose. Gồm các

chi Nocaridia, Oerskovia, Promicromonospora, Pseudonocardia, Rhodococcus,

Mycobacterium, Saccharomonospora, Saccharopopyspora, Actinopolyspora.

Thành tế bào vi khuẩn sợi chủ yếu gồm 03 lớp: lớp ngoài dày 60 – 120 Å, khi già có thể dày tới 150 Å; lớp giữa rắn chắc dày 50 Å và lớp trong dày 50 Å. Thành tế bào cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptide gồm các gốc N-acetylglucosamin liên kết với N-acetymuramic bởi liên kết 1,4-glycoside. Lớp ngoài thành tế bào vi khuẩn sợi có cấu tạo bằng lipid. Thành tế bào vi khuẩn sợi không chứa cellulose hay chitin. Vi khuẩn sợi phân lập từ các vùng ngập mặn có thành tế bào dày hơn và độ bền cơ học cao hơn, có thể chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường (nồng độ muối từ 3 - 4%, pH từ 6,8 – 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20 – 35oC). Thành tế bào của nhóm vi khuẩn sợi chịu kiềm ngồi peptidoglycan cịn có chứa nhiều acid như acid galacturonic, acid glutamic, acid aspartic và acid phosphoric. Với điện tích âm, bề mặt thành tế bào có thể hấp thụ các ion Na+, H+, ngược lại thải các ion OH-. Bên cạnh đó, tuy nhóm vi khuẩn sợi trung tính và nhóm chịu kiềm có lớp peptidoglycan giống nhau về cấu trúc nhưng lại khác nhau về thành phần hợp chất cấu thành, vi khuẩn sợi ưa kiềm chứa nhiều hesoamin và acid amin

(Kamekura và Kates, 1999).

d. Sự hình thành bào tử ở vi khuẩn sợi

Một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại vi khuẩn sợi là dựa vào hình

thái và kích thước của cuống sinh bào tử (Barka et al., 2016). Sợi bào tử có thể có nhiều

hình dạng khác nhau tùy theo lồi: thẳng-lượn sóng (retiflexibilis), xoắn (spirales) hoặc có móc, vịng (retinaculiaperti)… có loại mọc vịng một cấp, có loại mọc vịng hai cấp. Một số vi khuẩn sợi có sinh nang bào tử, bên trong có chứa các bào tử nang. Bề mặt của bào tử có thể nhẵn (smooth), gai (spiny), tóc (hairy), xù xì (warty), nếp nhăn (rugose)… tùy thuộc vào lồi vi khuẩn sợi. Sự hình thành bào tử bắt nguồn từ sự hình thành khuẩn ty khí sinh. Bào tử vi khuẩn sợi được hình thành theo ba phương thức sau đây: (1) phương thức sinh trưởng toàn bộ (toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty hình thành ra bào tử); (2) phương thức sinh trưởng trong thành ( bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng

nguyên sinh chất và thành khuẩn ty), trường hợp này gặp ở chi Planomonospora; (3)

phương thức sinh trưởng bào tử nội sinh thật (thành khuẩn ty không tham gia vào quá

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

trình hình thành bào tử), trường hợp này gặp ở chi Thermoactinomycetes (Barka et al.,

2016). Có mối quan hệ giữa sự hình thành bào tử và môi trường nghèo dinh dưỡng trong

nuôi cấy vi khuẩn sợi (Barka et al., 2016). Việc bổ sung CaCO3 và CaCl2 vào mơi trường sẽ kích thích sự hình thành bào tử ở vi khuẩn sợi. Tuy nhiên, việc bổ sung các nguyên tố vào môi trường phải được nghiên cứu kỹ và chỉ sử dụng ở nồng độ nhất định. Nếu môi trường giàu dinh dưỡng thì quá trình hình thành bào tử thường sẽ bị kìm hãm. Độ

ẩm và nhiệt độ đều có ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử (Schmidt et al., 2005).

Bào tử vi khuẩn sợi được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 – 400 Å chia làm 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH,… Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử, cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại vi khuẩn sợi. Tuy nhiên những tính trạng này có thể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau (Shamar

et al., 2014; Barka et al., 2016).

e. Một số điểm đặc biệt trong di truyền học và sinh hóa của vi khuẩn sợi

Vi khuẩn sợi thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt khác với những vi sinh vật nhân sơ khác là tỷ lệ G – C cao (xấp xỉ 70% hoặc hơn) trong khi đó ở vi khuẩn là 25

– 45% (Ventura et al., 2007; Verma et al., 2013). Ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm

sắc thể cịn có các plasmid có thể tự nhân đôi. Các plasmid này đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc q giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gen, sản xuất các chất kháng

khuẩn (Ventura et al., 2007). Vi khuẩn sợi không ổn định về di truyền và thường xảy ra

đột biến trong phân tử DNA. Điều này tạo ra tính đa dạng về hình thái, tính kháng thuốc. Sự tự nhân lên của các đoạn DNA làm cho việc nghiên cứu di truyền ở vi khuẩn sợi

phức tạp hơn (Ventura et al., 2007).

Vi khuẩn sợi thuộc loại sinh vật dị dưỡng, sử dụng nguồn carbon đa dạng gồm đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là các muối nitrate. Khả năng đồng hố các

chất thay đổi tùy theo chủng, lồi khác nhau (Barka et al., 2016).

f. Vòng đời hay chu kỳ sống của vi khuẩn sợi

Vi khuẩn sợi có vòng đời khá phức tạp bắt đầu bằng sự nẩy mầm của những bào tử, phát triển khuẩn ty dinh dưỡng rồi khuẩn ty phân nhánh và xuyên thấu vào cơ chất để giữ vững tế bào và hấp thu chất dinh dưỡng, tiêu hoá phần hữu cơ (polysaccharides, proteins, lipids và hợp chất hữu cơ khác), bởi những enzymes ngoại bào. Khuẩn ty dinh dưỡng hay khuẩn ty sơ cấp phát triển tiếp thành khuẩn ty thứ cấp hay khuẩn ty hiếu khí trên bề mặt cơ chất và bắt đầu cho giai đoạn sinh sản và hình thành bào tử, tiếp tục quay

trở lại vòng đời (Barka et al., 2016).

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

Vòng đời của vi khuẩn sợi thay đổi theo nguồn dinh dưỡng, với nguồn dưỡng chất dồi dào sẽ cho các khuẩn ty phát triển tốt. Ngược lại, chỉ có khuẩn ty dinh dưỡng phát

triển (Dastager et al., 2006). Hầu hết vi khuẩn sợi (chủ yếu là chi Streptomyces) là nhóm

hoại sinh (saprophytic) sống trong đất và gần như một nửa vòng đời của chúng là bào tử, chúng bị ảnh hưởng bởi nguồn dưỡng chất, chúng dễ thích nghi với nhiều điều kiện sinh thái như môi trường có chút ít muối và khơng khí hay trong mơi trường có nhiều sinh vật khác. Trong điều kiện thiếu dinh dưỡng, vi khuẩn sợi là nhóm mẫn cảm với

nhiệt độ cao nhưng lại chịu đựng tốt trong điều kiện khơ hạn (Manivasagan et al., 2013).

Chúng hình thành bào tử và thay đổi từ động bào tử di động (mobile zoospores) thành thể bào tử sinh sản đặc biệt (specialized propagules). Vi khuẩn sợi thuộc nhóm tạo bào

tử (chi Streptomyces) sẽ hình thành bào tử trong vùng đặc biệt của khuẩn ty khí sinh, sản xuất một lượng lớn bào tử và mỗi bào tử nẩy mầm rất mạnh; chi Thermoactinomyces có nội bào tử (endospores) trong khi các chi Micromonospora, Aleuriospores,

Geodermatophilus, Kitasatoa và Oerskovia là nhóm động bào tử di động (mobile

zoospores) (Stackebrandt et al., 1997).

Mật số của vi khuẩn sợi tuỳ thuộc vào hữu cơ trong đất và điều kiện khí hậu, đặc biệt lớp đất bề mặt đến độ sâu 2 m có tính kiềm hiện diện từ 106 đến 109 CFU/g đất;

thông thường chi Streptomyces chiếm ưu thế, gần 95% những dòng thuộc lớp Actinomycetales được phân lập từ đất (Stackebrandt et al., 1997).

Những yếu tố khác như nhiệt độ, pH, và ẩm độ đất có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn sợi. Giống như vi khuẩn đất khác, hầu hết chúng là nhóm chịu nhiệt (mesophilic) với nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng là 25oC đến 30oC nhưng vẫn có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn, từ 50 đến 60°C, nhờ vào ẩm độ cao (Edwards, 1993). Vi khuẩn sợi phát triển trong đất có pH trung tính, tốt nhất trong khoảng 6 và 9. Tuy nhiên

vài dòng của chi Streptomyces được phân lập từ đất phèn có pH 3,5 (Kim et al., 2003).

Nghiên cứu đầu tiên về ảnh hưởng của khí hậu trên sự phân bố của vi khuẩn sợi được

thực hiện bởi ltner và Strömer (Madigan et al., 2010), đếm và ghi nhận số vi khuẩn sợi

này chỉ có 20% trong tổng số các nhóm vi sinh vật vào mùa xuân và hơn 30% vào mùa thu vì mùa này có một lượng lớn xác bã thực vật; đến mùa đông, tuyết làm giảm mật số vi khuẩn sợi xuống còn 13%.

2.3.4 Phân loại (Taxonomy) vi khuẩn sợi

Khóa phân loại vi khuẩn sợi cổ điển dựa vào những đặc tính phân tử, sinh hoá và sinh lý để phân biệt các loài. Hiện nay, kết hợp thêm các phương pháp hiện đại như phân tích bộ gen và phân tích protein, có thể phân chia ngành phụ Actinobacteria chi tiết thấp dần đến mức độ loài phụ (subgroups), ngoài ra cịn có phân loại dựa trên vi hình thể

(micro-morphology) và sự thay đổi của cấu trúc vỏ tế bào (Bảng 2.1 và 2.2) (Gao et al.,

2006). Phương pháp sinh học phân tử thường dùng nhất hiện nay để định danh và phân

loại là phân tích gene 16S rDNA của vi khuẩn sợi (Krishnaveni et al., 2011).

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Bên cạnh đó, khóa phân loại vi khuẩn sợi cịn dựa vào sự phân tích thành phần và cấu trúc của peptidoglycan trên màng tế bào, các chất này khác nhau bởi những acid amin nằm ở vị trí số 3 trong chuỗi tetrapeptides, sự hiện diện của glycine ở giữa cầu nối peptide và carbohydrate chứa peptidoglycans. Theo đó, có các nhóm như: nhóm

Actinomyces (V- lysine và Ornithine), Rothia (V - lysine và acid aspartic), Oerskovia

(VI + Gallysine; Galactose; acid Aspartic), Agromyces (2,4-D acid diaminobutyric và glycine) và Mycoplasma (meso-DAP nhiều loại acid amin khác nhau) (Bull, 2004).

Bảng 2.1: Những dữ liệu chính yếu và những mối quan hệ đến sự phân loại vi khuẩn sợi (Bull, 2004)

Nhóm

Loai vỏ tế bào

Acid DAP: 2-6- diaminopimelic

Hằng số chính được phát hiện

Streptomyces (Streptoverticillium, Chainia, Actinopycnidium, Actinosporangium,

Elytrosporangium);

I I I I I

Microellobosporia; Actinoplanes;

Amorphosporangium; Ampullariella;

Dactylosporangi

II II II II II

Meso Xylose, arabinose

Actinomadura, Dermatophilus Microbiospora,

Pilimelia Actinoplanes Frankia

Streptosporangium; Spirillospora; Planomonospora Dermatophilus

III III III III III III III

Khơng có arabinose và xylose

Nocardia Rhodococcus Corynebacterium Mycobacterium Saccharomonospora

IV IV IV IV IV

Meso Galactose, arabinose và khơng có xylose

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Nhóm

Loai vỏ tế bào

Acid DAP: 2-6- diaminopimelic

Hằng số chính được phát hiện

Micropolyspora Pseudonocardia Thermomonospora

IV IV IV

Bảng 2.2: Phân phối Loài và Chi của ngành Vi khuẩn sợi cùng với Lớp, Bộ và Họ (Bull, 2004)

Thứ tự

chi

Tổng số loài

1 Acidimicrobiia Acidimicrobiia Acidimicrobiia 7 7

2 Actinobacteria Acidothermales Acidothermales 1 1 Actinomycetales Actinomycetaceae 8 76 Actinopolysporales Actinopolysporaceae 2 15

ifidobacteriales Bifidobacteriaceae 9 67 Catenulisporales Actinospicaceae 2 4

Corynebacteriales Corynebacteriaceae 2 127 Corynebacteriaceae 1 14

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Thứ tự

chi

Tổng số loài

Eggerthellales Eggerthellaceae 10 21 4 Nitriliruptoria Egibacterales Egibaceraceae 1 1

Nitriliruptorales Nitriliruptoraceae 1 1

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Thứ tự

chi

Tổng số loài

Rubrobacterale Rubrobacteraceae 1 8 6 Thermoleo-

philia

Solirubrobacterales Conexibacteraceae 1 2 Parviterribacteraceae 1 2

Thermoleophilales Thermoleophilaceae 1 2

Theo Bergey et al. (2000), dựa theo phân tích gen 16S rDNA, vi khuẩn sợi

(Actinobacteria) được xem là một ngành phụ lớn trong giới Vi khuẩn. Phân chia các ngành trong giới Vi khuẩn còn tuỳ thuộc vào sự thêm vào hay bớt đi nhóm protein trong gen 23S rDNA và sự sắp xếp khác nhau của các gen. Vi khuẩn sợi được chia làm 2 nhóm: nhóm có khuẩn ty thơ theo sau bởi những đoạn khuẩn ty dinh dưỡng; nhóm có một mạng khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium network) với nhiều bào tử. Các chi trong

nhóm thứ hai này gồm có Streptomyces, Actinoplanes, và Microbispora, ... Ngành phụ

Actinobacteria bao gồm 5 lớp (classes), 19 bộ (orders), 50 họ (families) và 221 chi (genera). Năm lớp là: Acidimicrobiia, Actinobacteria, Coriobacteriia, Rubrobacteria và Thermoleophilia. (Hình 2.3 và Hình 2.4).

Hình 2.3: Tỷ lệ phân bố của các lớp khác nhau trong ngành vi khuẩn sợi. (Yadav et al., 2018)

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

Hình 2.4: Tỷ lệ phân bố khác nhau của các chi ưu thế trong ngành vi khuẩn sợi (Yadav et al.,

2018)

2.3.5. Những ứng dụng công nghệ sinh học của vi khuẩn sợi

Vi khuẩn sợi có tầm quan trọng trong lĩnh vực nơng nghiệp. Một số nghiên cứu cho thấy vi khuẩn sợi sinh sản mạnh có thể góp phần gia tăng năng suất cây trồng bằng cách cải thiện dưỡng chất cho cây thông qua hai cơ chế:

- Trực tiếp cố định đạm, hòa tan lân, kali và kẽm, sản xuất chất điều hòa sinh trưởng như acid indole acidic, acid gibberellic, zeatin, và sản xuất siderophores, enzyme ACC deaminase có hoạt tính;

- Gián tiếp thơng qua q trình sản xuất ammonia, hydrogen cyanide, kháng sinh, enzyme lytic và sản xuất siderophores giúp hấp thu sắt.

Ngoài ra, vi khuẩn sợi còn hướng đến giúp đề kháng lại những yếu tố gây stress sinh học trong môi trường, gia tăng tính chịu hạn và cải thiện sự hấp thu phospho (Verma

et al., 2013, 2014, 2015; Yadav et al., 2010, 2017, 2018).

Trong y học, vi khuẩn sợi tạo ra các hợp chất thứ cấp có tính kháng khuẩn

(antimicrobial) bao hàm cả chất kháng nấm và kháng kí sinh trùng (Sharma et al., 2014; Azman et al., 2015); trong đó, vai trị của chi Streptomyces chiếm tỷ lệ khá cao (Sharma

et al., 2014). Năm 2010, Dharmaraj ghi nhận rằng các vi khuẩn sợi Streptomyces sp. từ

biển và đại dương (bao gồm trong phù sa, bùn, nội sinh trong các sinh vật biển trong đó

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

có hải miên) tổng hợp ra nhiều hợp chất thứ cấp (secondary metabolites). Trong những

hợp chất đó, số lượng các chất có hoạt tính sinh học của chi Streptomyces phân lập từ

biển không ngừng gia tăng. Tùy theo cấu trúc phân tử được phân chia như sau: Peptides, Quinones, Macrolides, Polyketides, Piericidins, Trioxacarcins, Marinopyrrols, Sisomicin, Triazolopyrimidine, Esters, Macrocyclic Lactam, Dẫn xuất Manamycin, và

Streptoclorin (Dharmaraj, 2010; Shamar et al., 2014). Vi khuẩn sợi Streptomyces sp.

211726, được phân lập từ đất của rừng ngập mặn Wenchang, Trung Quốc, có năng suất tổng hợp macrocyclic lacton và năm thành phần khác của chất azalomycins không nhỏ, biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, đặc biệt là có cả chất ức chế thụ thể

interleukin-1 loại I (Yuan et al., 2013).

Lồi người đang gặp nhiều khó khăn trong điều trị các bệnh mãn tính, như thối hóa thần kinh và ung thư. Một trong những nguồn tiềm năng là vi khuẩn sợi, với sự phân

bố rộng trong tự nhiên; nhất là chi Streptomyces có thể được tìm thấy ở cả môi trường

trên cạn và biển, tạo ra các hợp chất hoạt tính sinh học đa dạng, độc đáo, có lợi cho sức

khỏe con người. Hai chủng Streptomyces (MUSC 137T và MUM 256) được phân lập từ

trầm tích rừng ngập mặn ở bán đảo Malaysia khi kiểm tra hoạt tính sinh học có biểu hiện các hoạt động chống oxy hóa và gây độc tế bào mạnh mẽ, ức chế một số dòng tế bào

ung thư ở người (Ser et al., 2017). Vi khuẩn sợi có nguồn gốc từ rừng ngập mặn được

cho rằng đã và đang trở thành nguồn tài nguyên triển vọng để phân lập các tác nhân hóa

trị liệu (Law et al., 2020). Những kết quả này là thể hiện tầm quan trọng của vi khuẩn

sợi từ các vùng chưa được khám phá ngoài hệ sinh thái trên cạn.

2.4. Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp 2.4.1 Lược khảo chung về kháng sinh

Theo Zaffiri et al. (2012), hợp chất có tính kháng khuẩn đầu tiên được Ehrlich giới

thiệu vào những năm 1909 - 1911 là Arsphenamine (sau đó gọi là Salvarsan), có chứa arsen. Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện kháng sinh Penicillin từ loài nấm mốc

Penicillium notatum. Năm 1932, khám phá ra các kháng sinh thuộc nhóm sulfanilamide.

Năm 1943, Waksman và Albert Schatz thu nhận được chất Streptomycin từ loài vi khuẩn

sợi Streptomyces griseus. Năm 1949, chất Cephalosporin được thu nhận từ vi nấm

Cephalosporium acremonium. Xuất phát từ nhu cầu khắc phục hiện tượng vi khuẩn đề

kháng lại kháng sinh, vào các năm 1961 và 1972 lần lượt có Ampicillin và Amocixillin là những kháng sinh thế hệ hai, được cải biến từ Penicillin. Đến nay, có nhiều kháng sinh thuộc thế hệ ba và bốn với phổ kháng khuẩn rộng hơn, ứng dụng vào điều trị nhiều bệnh hơn và vẫn tiếp tục được cải tiến để đương đầu với vấn đề phát sinh những chủng lồi vi sinh vật kháng thuốc. Cơng thức phân tử của một số kháng sinh được trình bày trong Hình 2.5.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

• Penicillin: trong cấu trúc hóa học có vịng β-lactam. Kháng sinh nhóm này ức chế sự hình thành peptidoglycan trong vách tế bào, bám vào những enzyme của vi khuẩn gây bệnh, từ đó thúc đẩy q trình tự phân giải vách tế bào. Đây là kháng sinh phổ rộng nhưng dễ bị đề kháng.

• Streptomycin: là kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside đầu tiên được phân lập từ vi khuẩn sợi, mở ra bước phát triển quan trọng trong điều trị y khoa. Nó gắn vào tiểu phần 30S trong ribosome của vi khuẩn gây bệnh, dẫn tới đọc sai mã và ức chế quá trình tổng hợp protein. Kháng sinh này phổ rộng nhưng đạt hiệu quả tốt trên vi khuẩn Gram âm.

• Cephalosporin: có vịng β-lactam như penicilin nhưng hiệu quả tùy thuộc vào nhiều yếu tố. Nó có hiệu quả điều trị với vi khuẩn Gram âm nhưng kém với vi khuẩn Gram dương và cho tới nay trải qua cải biến bốn thế hệ.

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

2.4.2 Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp:

Mặc dù chất kháng sinh đầu tiên được khám phá ở vi khuẩn sợi là Actinomycin,

khi ni cấy lồi Streptomyces antibioticus trong năm 1940 (Barka et al., 2016), nhưng chất thường được nhắc đến là Streptomycin (1943-1944) vì theo Clardy et al. (2009),

danh từ kháng sinh – (antibiotics) do Waksman đề xuất sau khi thu nhận chất này từ loài

Streptomyces gryseus phân lập trong hệ vi sinh vật đất (Zaffiri et al., 2012). Bên cạnh

đó, chất kháng nấm từ vi khuẩn sợi là Nistatin được thu nhận từ dịch ni cấy lồi

Streptomyces noursei (Khuất Hữu Thanh, 2006).

Y học hiện nay thu nhận được nhiều chất kháng sinh hơn, phần lớn (70%) có

nguồn từ vi khuẩn sợi thuộc chi Streptomyces (Ningthoujam et al., 2009 và Sharma et

al., 2014). Các kháng sinh này thuộc các nhóm chất như: aminoglycoside, anthracyclin,

macrolide, β-lactam, cloramphenicol, tetracyclin, nhóm polyene và griseofulvin (Barka

et al., 2016). Các macrolide được xếp loại theo kích cỡ vịng genin, quan trọng nhất là

các chất có vịng mang 14 đến 16 ngun tử carbon. Riêng vi khuẩn sợi có nguồn gốc đại dương đủ khả năng tổng hợp khá nhiều nhóm chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng

khối u và độc tố tế bào (Manivasagan et al., 2013).

Theo Xu et al. (2014), hiện có 122 chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau bao gồm 49

hợp chất phổ biến và 73 chất mới thu được từ vi khuẩn sợi rừng ngập mặn, bao gồm các alkaloid, benzen và các dẫn xuất cyclopentenon, dilactone, macrolite, 2-pyranones, sesquiterpenes và một số chất đặc biệt như salinosporamides, xiamycins và

indolocarbazoles. Chi Streptomyces tiếp tục được Xu et al. (2014) đánh giá là nguồn sản

xuất phong phú nhất. Mặc dù các hợp chất được phát hiện lại nhiều lần, nhưng chúng

vẫn được ghi nhận có hoạt tính sinh học mới tiềm năng (Xu et al., 2014).

Manivasagan et al. (2013) tổng kết các kháng sinh trên thế giới, trong đó nhấn

mạnh vai trị của nhóm vi khuẩn sợi có nguồn gốc đại dương, bao gồm:

1. Aminoglycoside: như Streptomycin là kháng sinh được khám phá từ vi khuẩn

sợi Streptomyces griseus (Hình 2.6)

2. Chloramphenicol (Hình 2.7), được phát hiện từ vi khuẩn sợi Streptomyces

venezuelae; Tetracycline và Anthrocycline…đều là sản phẩm của vi khuẩn sợi Streptomyces sp.

3. Glycopeptides, β-lactams, polyenes và actionomycins: Vancomycin (Hình 2.8) là kháng sinh điều trị nhiễm trùng ức chế vi khuẩn Gram dương.

4. Peptides đa phân tử ngắn: Hầu hết peptide của Streptomyces dạng vòng và

chứa những phân tử hiếm như chromophores hay những acid amin. Piperazimycins A–

C là hexadepsipeptides độc phân lập từ sự lên men dung dịch Streptomyces sp.

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

5. Polyesters: Bonactin (Hình 2.11), một ester kháng khuẩn, phân lập từ

Streptomyces sp. BD21-2 ở mẫu đất trầm tích ven biển Hawaii, có khả năng kháng lại

cả vi khuẩn Gram-dương, Gram-âm và kháng nấm (Schumacher et al., 2003).

Hình 2.11: Cấu trúc hóa học của polyester (Nguồn: Schumacher et al., 2003)

6. Các hợp chất sinh học mới: Salinipyrones A và B (Hình 2.12) là những

polyketides mới, phân lập từ vi khuẩn sợi biển Salinispora paciﬁca; tuy chưa được xác

định làm dược phẩm cho người nhưng salinipyrone A có tác dụng như interleukin-5 ở

nồng độ 10 µg/ml mà khơng ảnh hưởng đến dịng tế bào HCT-116 ở người (Oh et al., 2008). Newman và Crag (2004) báo cáo rằng loài Micromonospora marina thu thập từ

ngoài khơi Mozambique tổng hợp được chất ức chế DNA α-polymerase, có tác dụng

với khá nhiều dịng tế bào ung thư.

Hình 2.10: Cấu trúc hóa học của các polypeptides

(Manivasagan et al., 2013)

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Lồi Streptomyces coeliolor là hình mẫu để nghiên cứu sự tổng hợp kháng sinh

với hơn 20 cụm gene mã hóa cho các chất trao đổi trung gian. Hình thái của vi khuẩn sợi (phân mảnh hay nén chặt) có mối liên hệ phức tạp đến việc tạo thành kháng sinh

(Barka et al., 2016). Có thuyết cho rằng chất kháng sinh là sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất của vi khuẩn sợi (Manivasagan et al., 2014); có ý kiến cho rằng chất kháng

sinh là chất tham gia vào quá trình cạnh tranh của vi khuẩn sợi trong môi trường sống

tự nhiên (van der Heul et al., 2018). Nhìn chung, các con đường sinh ra chất kháng sinh từ vi khuẩn sợi được tóm tắt như sau (Clardy et al., 2009):

- Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất trao đổi sơ cấp duy nhất (như chất kháng sinh cloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm nucleozide).

- Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc 1 khác nhau (như các chất kháng sinh lincomicin, novobiocin).

- Chất kháng sinh được tổng hợp bằng cách polymer hóa các chất trao đổi bậc 1, sau đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác. Có 4 dạng polymer hóa: + Chất kháng sinh nhóm polypeptide theo con đường trùng hợp các acid amin: bacitracin, polymycin.

+ Chất kháng sinh được tạo thành nhờ phản ứng polymer hóa các đơn vị acetate, propionate: chất kháng sinh nhóm macrolide, tetracilin, rifamicin.

+ Chất kháng sinh aminoglycozide được tạo thành nhờ các phản ứng trùng hợp polysacaride: neomicin, streptomycin.

Hình 2.12: Cấu trúc hóa học của 1 số hợp chất sinh học mới. (Oh et al., 2008).

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

có giá trị. Theo Giri et al. (2011) và Xu et al. (2014), các nghiên cứu và kỹ thuật bao

gồm sàng lọc dựa trên trình tự, khai thác bộ gen hoặc phân lập các loài mới có thể nâng cao hiệu quả của việc khám phá các sản phẩm từ vi khuẩn sợi rừng ngập mặn. Mặc dù thu được khá nhiều kết quả quan trọng, nhưng những thách thức vẫn tồn tại vì các lý do sau: (1) sản phẩm hoạt chất bị trùng lặp; (2) chưa có kỹ thuật phân tích và nhận biết cấu trúc hóa học hiệu quả hơn; (3) sự suy giảm diện tích nghiêm trọng của rừng ngập mặn; (4) có những lồi khơng thể ni cấy trong mơi trường thí nghiệm; (5) chi phí tài chính

cao (Giri et al., 2011 và Xu et al., 2014).

2.5. Sự tồn tại của các gen chỉ thị kháng sinh (pks-I, pks-II và nrps) để nhận

diện vi khuẩn sợi có khả năng tổng hợp kháng sinh

Polyketide là một nhóm các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc đa dạng, bao gồm polyketide týp 1 và týp 2, được tạo thành do quá trình trùng ngưng các đơn vị acid carboxylic (giống như tổng hợp acid béo). Các polyketide có ứng dụng trong nơng

nghiệp lẫn y học, có thể kháng khuẩn, kháng nấm và ức chế tác nhân ung thư (Zhao et

al., 2009, 2011, 2018) nhưng theo Manivasagan et al. (2013) đa số polyketide có khả

năng kháng khuẩn, ngược lại độc tính gây chết tế bào và khả năng kháng nấm khơng cao. Những thuốc có chất polyketide bao gồm: aurantimycin, chartreusin, cocanamycin,

kirromycin, lisolipin và polyketomycin (Weber et al., 2003). Các vi khuẩn sợi phân lập

từ biển sâu (hoặc nói chung là có nguồn gốc từ biển/đại dương – marine actinobacteria) thường có những enzyme tổng hợp polyketide (PKS – polyketide synthases) và enzyme tổng hợp polyketide không phải ribo-thể (NRPS – nonribosomal polyketide synthase)

(Zhao et al., 2009; Sun et al., 2015). Theo nghiên cứu của Ayuso et al. (2005), mã hóa cho enzyme tổng hợp polyketide (chỉ thị kháng sinh) gồm các gen là pksI, pksII và nrps.

Ở vi khuẩn sợi các gen tổng hợp polyketide thường phân bố theo từng cụm

(Manivasagan et al., 2013).

Theo Jenke-Komada et al. (2006), các enzyme tổng hợp polyketide týp 1, tương

ứng với PKS-I của vi khuẩn sợi là các enzyme đa chức năng để lắp ráp các cấu trúc phức tạp từ các khối cấu tạo carbon đơn giản. Các vị trí hoạt động của PKS týp 1 được tổ chức tuyến tính thành các khối, mỗi khối xúc tác một chu kỳ kéo dài. Một khối tối thiểu chứa một enzyme ketosynthase (KS), một acyltransferase (AT) và một miền protein mang gốc acyl (ACP). Tính đặc hiệu của AT đối với malonyl-CoA, methylmalonyl-CoA, hoặc các α-alkylmalonyl-CoA khác có vai trị xác định chất kéo dài mạch carbon. Hơn nữa, vì methylmalonyl-CoA và α-alkylmalonyl-CoA có tâm bất đối xứng, nên sự kết hợp của chúng tạo ra các đồng phân lập thể khác nhau của chuỗi polyketide kéo dài.

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

Sau khi trùng ngưng, trạng thái oxy hóa của β-carbon hoặc được giữ dưới dạng nhóm ceto hoặc được biến đổi thành nhóm hydroxyl, methine hoặc metylene bằng hoạt động tùy chọn của enzyme ketoreductase (KR), khử nước (DH) và enoylreductase (ER). Sự biến đổi khác xuất phát từ sự tồn tại của hai loại miền KR tạo ra các đồng phân lập thể khác nhau liên quan đến β-carbon bất đối. Khả năng kết hợp các biến thể khác nhau theo cách hoán vị tạo ra sự đa dạng rất lớn về cấu trúc polyketide. Về mặt lý thuyết, một hệ thống PKS bao gồm sáu khối kéo dài có thể tạo ra hơn 100.000 cấu trúc (Jenke-Komada

et al., 2006).

Như vậy, các khối tổng hợp polyketide (PKS) của vi khuẩn sợi là một nguồn dự trữ khổng lồ các hợp chất thiên nhiên. Nghiên cứu con đường sinh tổng hợp những chất này có thể hỗ trợ việc thiết kế gen để thu nhận các hợp chất hoạt tính sinh học mới. Qua khảo sát quan hệ di truyền của các đoạn mã hóa enzyme ketosynthase (KS) trên PKS

của chi vi khuẩn sợi Streptomyces cho thấy phần lớn các khối tham gia vào quá trình

sinh tổng hợp một hợp chất được phát triển bằng cách nhân đôi một khối đầu tiên duy

nhất. Sử dụng loài Streptomyces avermitilis làm sinh vật mẫu, Jenke-Kodama et al.

(2006) tái tạo lại các mối quan hệ tiến hóa của những miền KS khác nhau. Phân tích này cho thấy 65% các khối bị thay đổi bởi sự thay thế tái tổ hợp xảy ra trong và giữa các cụm gen sinh tổng hợp. Các thay thế này bao gồm thay thế trên đoạn mã hóa cho acyltransferase (AT), ketoreductase (KR), và khử nước (DH) –KR tự nhiên. Kết quả

nghiên cứu của Jenke-Kodama et al. (2006) chỉ ra sự tái tổ hợp tương đồng dựa vào tính

lắp ráp theo khối của miền PKS, là cơ chế quan trọng nhất làm cơ sở cho sự đa dạng polyketide ở vi khuẩn sợi.

Việc xác định sự có mặt của các gen mã hóa cho enzyme tổng hợp kháng sinh rất quan trọng để nhận diện và khẳng định khả năng tổng hợp kháng sinh của các vi khuẩn

sợi (Ayuso et al., 2005). Các kỹ thuật sinh học phân tử như khuếch đại trình tự gen, lấy

dấu phân tử và phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP) thường được áp

dụng trên các gen pks và nrps để đánh giá khả năng tạo kháng sinh của vi khuẩn sợi (Ayuso et al., 2005; Zhao et al., 2009). Tuy nhiên, Ayuso et al. (2005) cho rằng kỹ thuật

PCR sàng lọc các gen liên quan đến chuyển hóa thứ cấp được sử dụng để đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp của vi khuẩn sợi đều có hạn chế là khơng hiệu quả trong việc "chống sao chép” hoặc định danh các dịng phân lập, bắt buộc phải giải trình tự tăng cường của sản phẩm PCR. Vì vậy, kết hợp dữ liệu thu được từ các phương pháp lấy dấu phân tử truyền thống và các phương pháp lấy dấu mới sẽ giúp các tập trung quá trình tuyển chọn vào các nhóm tiềm năng, làm tăng cơ hội tìm thấy các chất chuyển hóa thứ cấp có giá

trị. Ayuso et al. (2005) nghiên cứu kỹ thuật lấy dấu phân tử (finger printing) mới, dựa trên phân tích đoạn cắt giới hạn của các mảnh khuếch đại gen pks, nrps ở các chủng vi

khuẩn sợi phân lập từ đảo ở biển Trung Mỹ, nhằm đánh giá hiệu năng và mối liên hệ giữa sự tồn tại của các gen này với khả năng tổng hợp kháng sinh. Bên cạnh đó, so sánh

trình tự những vùng KS (khoảng 700 bp trên gen pksI) (Zhao et al., 2009) và KSα, KSβ

</div>