Tóm tắt: Phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn sợi (Actinobacteria) tạo kháng sinh trong đất rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.04 MB, 26 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

Xác nhận đã xem lại của Chủ tịch Hội đồng

PGS.TS. ……….

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. - Thư viện Quốc gia Việt Nam.

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

iii

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ

1 Nguyen Tuan Hai and Cao Ngoc Diep, 2021. Isolation, selection and

antimicrobial activity of actinomycetes from mangrove soil of Can Gio forest,

HoChiMinh City, Vietnam. Global journal of science frontier research: C

(Biological Science), Volume 21, Issue 4, pp. 7-22.

2 Nguyen Tuan Hai and Cao Ngoc Diep, 2022. Bioactive secondary metabolites

from marine streptomyces isolated from mangrove forest soil of Can Gio,

HoChiMinh City, Vietnam. International Journal of Pharmaceutical and

Clinical Research, Volume 14, Issue 2, pp. 7-15.

3 Nguyen Tuan Hai and Cao Ngoc Diep, 2022. Antimicrobial compounds of

one Streptomyces celluloflavus strain isolated from Can Gio mangrove soil, Vietnam. GSC Biological and Pharmaceutical Sciences, Volume 19, Issue 3,

pp. 120–126.

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1. 1 Đặt vấn đề

Vi sinh vật là nguyên nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm cho người và động vật. Kháng sinh là nhóm thuốc tiêu diệt hoặc làm chậm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, giúp chống lại quá trình nhiễm khuẩn và còn được

ứng dụng trong một số lĩnh vực khác như nông nghiệp, chế biến… (Ceylan et al., 2008 và Kohanski et al., 2010).

Tuy nhiên, hiện nay đang nổi lên hiện tượng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc. Vì vậy rất cần thiết cải tiến các

kháng sinh cũ, đồng thời thúc đẩy nghiên cứu tìm ra các kháng sinh mới (Xu et al., 2014).

Trong số các vi sinh vật có khả năng tạo kháng sinh thì vi khuẩn sợi (actinobacteria) hay cịn gọi là xạ khuẩn đóng vai trị quan trọng hàng đầu, khoảng 80% các chất kháng sinh được phát hiện có nguồn gốc từ vi

khuẩn sợi, đặt biệt là các loài thuộc chi Streptomyces (Berdy, 2005). Hơn nữa, Streptomyces phân lập từ các nguồn

đại dương được quan tâm nhiều hơn do khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp (secondary metabolites) có giá trị

như kháng sinh, kháng ung thư, kháng khối u (Xu et al., 2014).

Rừng ngập mặn là một tập hợp các loại cây nhiệt đới, cận nhiệt đới thích nghi với vùng khắc nghiệt giữa

biển và đất liền (Ottoni et al., 2015). Nguồn carbon dồi dào từ xác bã động thực vật giúp cho các quần xã vi sinh vật phát triển, trong đó có vi khuẩn sợi (Miththapala et al, 2008). Rừng ngập mặn huyện Cần Giờ (thành phố Hồ

Chí Minh) được UNESCO công nhận là Khu dự trữ sinh quyển thế giới với hệ sinh vật đa dạng, có tiềm năng to lớn.

Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi sinh vật rừng ngập mặn Việt Nam nói chung và rừng ngập mặn Cần Giờ nói riêng vẫn cịn rải rác trên nhiều đối tượng, như: phân lập, định danh, khảo sát đặc điểm của các vi khuẩn liên

kết thực vật và vi khuẩn sống trong đất vùng rễ cây rừng ngập mặn ở Cà Mau (Hồ Thanh Tâm và ctv., 2016);

nghiên cứu về vi sinh vật ở vùng ven biển Hải Phòng (Đỗ Mạnh Hào và Phạm Thiên Thư, 2010); nghiên cứu vi

khuẩn sinh tổng hợp polyhydroxyalkanoates phân lập từ rừng ngập mặn Quảng Ninh (Nguyễn Thị Bình và ctv.,

2012)... Từ đây đặt ra nhu cầu nghiên cứu các loài vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn Cần Giờ, bổ sung nguồn tiềm năng để thu nhận các chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt là kháng sinh mới.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ chí Minh có khả năng tổng hợp kháng sinh hỗ trợ chống lại bệnh nhiễm trùng và có thể ứng dụng rộng hơn.

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các dòng vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn có khả năng tổng hợp kháng sinh. Nghiên cứu được giới hạn trên phạm vi là đất rừng ngập mặn tại huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh.

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thu mẫu và phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi được thực hiện vào tháng 02 năm 2019. Các dịng có tính kháng khuẩn được chọn định danh từ tháng 11 năm 2020 đến tháng 4 năm 2021.

Các nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các dịng vi khuẩn sợi và sinh hóa được tiến hành tại phịng thí nghiệm Vi sinh mơi trường, Sinh học phân tử thuộc Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Đại học Cần Thơ. Một số phân tích hóa học chuyên sâu (như GC-MS) được gửi mẫu thực hiện bởi Bộ môn Khoa Học Môi Trường, khoa Môi Trường và Tài Nguyên Thiên Nhiên, Đại học Cần Thơ.

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

2

1.5. Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu bao gồm các nội dung:

- Thu thập mẫu đất rừng ngập mặn Cần Giờ, phân lập và tuyển chọn các dịng vi khuẩn sợi có khả năng kháng khuẩn.

- Nhận diện các dòng vi khuẩn sợi được chọn với các kỹ thuật khuếch đại trình tự gen 16S rRNA bằng PCR

sử dụng cặp mồi S-C-Act-0235-a-S-20 và S-C-Act-0878-a-A-19 (Stach et al., 2003 và Sun et al., 2015), giải

trình tự, so sánh với cơ sở dữ liệu trực tuyến trên GenBank và đề xuất tên phân loại vi khuẩn sợi.

- Thu nhận hoạt chất kháng khuẩn và phân tích thành phần hóa chất bằng máy sắc ký ghép khối phổ MS).

(GC-1.6. Đóng góp mới của luận án

Đã phân lập được 48 chủng vi khuẩn sợi từ đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, trong đó, có 10 chủng kháng

lại ít nhất một trong bốn loài vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm là Bacillus cereus (8 chủng), E. coli (4 chủng), S.

aureus (6 chủng) và V. parahaemolyticus (3 chủng). Mười chủng vi khuẩn sợi này được tuyển chọn và định danh

ghi nhận được 8 dòng đều thuộc chi Streptomyces họ Streptometaceae, bộ Actinomycetales, lớp Actinobacteria, ngành Actinobacteria; với 8 loài khác nhau: Streptomyces tendae, S. tanashiensis, S. parvulus, S. celluloflavus, S.

aegytia, S. africanus, S. albogriseolus và S. laurentii. Tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có hoạt tính

sinh học trong 8 dịng vi khuẩn sợi được ghi nhận có sự khác nhau, bao gồm pksI là 50%, pksII là 0% và nrps là

100%.

Đã chọn được hai dòng VKS tiềm năng nhất có khả năng kháng khuẩn cao là S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 và S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1. Sáu hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu được sản xuất từ S. albogriseolus ANTHOIDONG 7.1 được xác định, gồm có: Cyclohexasiloxane, dodecaethyl;

Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; dẫn xuất 3TMS của acid 2,6- dihydroxybenzoic; Heptasiloxane, hexadecamethyl; Octasiloxane, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-Hexadec; và Tetracosamethyl,

cyclododecasiloxane. Đối với S. celluloflavus ANTHOIDONG 4.1, 11 hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu

được xác định bao gồm: 2-pentanone, 4-hydroxy-4-methyl; Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl; Cyclododecane; 1,1,1,3,5,7,7,7-Octamethyl-3,5-bis(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; Benzoic acid, 2-hydroxy-, 1-methylethyl ester; 1-Hexadecene; và Heptasiloxane, hexadecamethyl.

Đất rừng ngập mặn Cần Giờ với vi khuẩn sợi là nguồn chất kháng khuẩn tiềm năng nhưng chưa được quan tâm nhiều. Đây là đối tượng mới khi nghiên cứu về vi sinh vật bản địa; là cơng trình nghiên cứu đầu tiên về tính trạng kháng khuẩn và gen chỉ thị kháng sinh của vi khuẩn sợi trong đất tại đây. Đồng thời, chất kháng vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn sợi phân lập từ đây góp phần bổ sung nguồn dược liệu có thể khai thác trong tương lai.

1.7. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

Ý nghĩa khoa học của nghiên cứu này nhằm phân lập và chọn lọc vi khuẩn sợi tổng hợp kháng sinh trong đất rừng ngập mặn huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả thu được của luận án sẽ góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về lĩnh vực vi sinh vật học của rừng ngập mặn Việt Nam nói riêng và vùng Đơng Nam Á nói chung. Trong đó, có những lồi đóng vai trị là nguồn sản xuất chất kháng khuẩn cho tương lai.

Về mặt ý nghĩa thực tiễn, các dòng vi khuẩn sợi tạo được kháng sinh, hoặc ức chế được nhiều chủng vi khuẩn gây hại sẽ có thể là nguồn giống vi sinh vật quý giá cho việc sản xuất thuốc chữa bệnh nhiễm khuẩn, góp phần giảm áp lực tìm kiếm kháng sinh mới, khắc phục hiện tượng đề kháng đang đe dọa nỗ lực điều trị của con người. Ngoài ra, kết quả thu được từ luận án làm phong phú nguồn dược liệu Việt Nam; cho thấy giá trị sinh thái của rừng ngập mặn nước ta, có sự tương đồng về các lồi vi khuẩn sợi và thành phần hoạt chất so với các vùng

ngập mặn khác trong khu vực và trên thế giới.

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về rừng ngập mặn

2.1.1 Khái niệm và phân loại rừng ngập mặn

Rừng ngập mặn là một dạng rừng phát triển trên vùng đất ngập nước dọc theo các bờ biển ở những khu vực

nhiệt đới và cận nhiệt đới (Spelchan và Nicoll, 2014, Ottoni et al., 2015). Những chi thực vật thường thấy trong rừng ngập mặn là chi Đước (Rhizophora), chi Mắm (Avicennia), chi Bần (Sonneratia), chi Vẹt (Bruguiera)

(Miththapala, 2008). Cây rừng ngập mặn có hai cơ chế thích nghi với điều kiện sống trong nồng độ muối cao: một là trên lá cây có tuyến muối để bài tiết lượng muối thừa; hai là tích lũy muối thừa vào tế bào thịt lá hoặc vỏ

cây sau đó sẽ được thải ra ngồi khi lá rụng hoặc khi tróc vỏ (Miththapala, 2008 và Spelchan và Nicoll, 2014).

Rừng ngập mặn đóng vai trị quan trọng khi cung cấp các sản phẩm sinh khối động thực vật cho con người, điều

tiết lũ, tích lũy phù sa và chuyển hóa các nguyên tố dinh dưỡng trong đất (Ewel et al., 1998). Đất rừng ngập mặn là một hệ sinh thái đa dạng với nhiều loại vi sinh vật có giá trị (Wu et al., 2016).

2.1.2. Rừng ngập mặn Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh

Theo Ban quản lý rừng phịng hộ Cần Giờ (2021), rừng ngập mặn Cần Giờ là Khu Dự trữ Sinh quyển Thế giới đầu tiên của Việt Nam, được UNESCO công nhận vào năm 2000, thuộc hạ lưu hệ thống sơng Đồng Nai – Sài Gịn, ở phía Đơng Nam Thành phố Hồ Chí Minh, với tổng diện tích là 70.445,34 ha. Trong rừng ngập mặn Cần Giờ có 3 khu bảo tồn các lồi động vật. Ngồi ra, rừng ngập mặn Cần Giờ còn là nơi sinh sống của nhiều loài

động thực vật quý hiếm thuộc Danh mục Sách đỏ Việt Nam năm 2007. Thực vật có 2 lồi là Cóc đỏ (Lumnitzera

littorea) và Chùm lé (Azima sarmentosa); động vật có 9 lồi bao gồm: Rái cái thường (Lutra lutra), Rái cá vuốt

bé (Aonyx cinereus), Mèo cá (Prionailurus viverrinus), Khỉ đuôi dài (Maccaca fascicularis); Bồ nông chân xám (Pelecanus philippensis), Cổ rắn (Anhinga melanogaster), Choắt mỏ vàng (Tringa guttifer); Rắn hổ chúa (Ophiophagus hannah), và Cá mang rổ (Toxotes chatareus).

2.2. Vi sinh vật trong đất rừng ngập mặn

Vi sinh vật đất rừng ngập mặn rất phát triển, bao gồm vi khuẩn, vi nấm (91%), tảo và động vật nguyên sinh

(Thatoi et al., 2012), có khả năng chịu mặn và tổng hợp chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt là các vi khuẩn sợi tạo được kháng sinh (Sivakumar et al., 2007 và Thatoi et al., 2012). Các loài vi khuẩn sợi trong đất rừng ngập mặn của

Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia được báo cáo là có khả năng tổng hợp nhiều loại chất kháng sinh ức chế mạnh mẽ

cả vi khuẩn Gram âm lẫn Gram dương (Hong et al., 2009 và Wiwin, 2010). Sivakumar et al. (2007) khẳng định

chất kháng sinh của nhóm vi khuẩn sợi nguồn gốc biển (rừng ngập mặn) mới và độc đáo hơn so với kháng sinh của nhóm vi khuẩn sợi trong đất liền. Có đến 2000 dịng vi khuẩn sợi được phân lập từ rừng ngập mặn và các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng có tác dụng chống nhiễm trùng, chống khối u và hoạt động ức chế protein tyrosine

phosphatase 1B (PTP1B), các enzyme phân giải… (Hong et al., 2009).

Cho tới nay, có hơn 10.000 trong tổng số 23.000 hợp chất có hoạt tính sinh học được báo cáo là do vi khuẩn

sợi tổng hợp và 80% trong số ấy được thu nhận từ Streptomyces (Berdy, 2005). Vi khuẩn sợi rừng ngập mặn rất đa dạng và độc đáo; cho đến nay, đã phân lập và định danh 24 chi (Amrita et al., 2012). Mặc dù vậy nhưng vì

những khó khăn khi ni cấy nên chỉ mơ tả xác định được rất ít (5%) số lượng chủng lồi, chưa tương xứng với

tiềm năng sẵn có (Thatoi et al., 2012). Do vậy, cần tiếp tục đầu tư nghiên cứu để khai thác trong tương lai.

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

4

trưởng được. Vi khuẩn sợi mang nguồn gốc biển có khả năng chịu mặn cao, thường được phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tích biển ở các độ sâu khác nhau hoặc ở trên các sinh vật biển khác như đặc biệt là hải miên (bọt

biển) và san hô (Shamar et al., 2014).

2.3.3. Đặc điểm sinh học tổng quát của vi khuẩn sợi a. Khuẩn lạc

Trên môi trường đặc, vi khuẩn sợi sinh trưởng thành những khuẩn lạc khơ, kích thước và màu sắc thay đổi tùy theo lồi và điều kiện ni cấy. Bề mặt khuẩn lạc xù xì, có nếp tỏa ra theo hình phóng xạ hoặc có thể có dạng da, dạng vơi, nhung tơ hay màng dẻo. Khuẩn lạc vi khuẩn sợi thường có 03 lớp: lớp vỏ ngồi là các sợi bện chặt,

lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2001).

b. Khuẩn ty

Trên môi trường đặc, hệ sợi của vi khuẩn sợi sinh trưởng thành hai hướng tạo thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh (Hình 2.2). Khuẩn ty cơ chất sinh trưởng cắm sâu vào trong môi trường với chức năng chủ yếu là lấy nước và thức ăn. Khuẩn ty cơ chất sinh trưởng một thời gian thì dài ra trong khơng khí tạo thành khuẩn ty khí sinh.

Hình 2.2: Khuẩn ty ở vi khuẩn sợi (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2001)

c. Thành thế bào

d. Sự hình thành bào tử ở vi khuẩn sợi

e. Một số điểm đặc biệt trong di truyền học và sinh hóa của vi khuẩn sợi

Vi khuẩn sợi thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là tỉ lệ G – C cao (xấp xỉ 70% hoặc hơn) (Ventura

et al., 2007 và Verma et al., 2013). Chúng cịn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, có thể tự nhân lên

được gọi là plasmid với nhiều đặc tính chọn lọc q giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống

chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với kháng sinh, chuyển gen, sản xuất các chất kháng khuẩn (Ventura et al.,

2007). Vi khuẩn sợi thường xảy ra sự đột biến. Điều này tạo ra tính đa dạng về hình thái, tính kháng thuốc đồng

thời làm phức tạp việc nghiên cứu di truyền ở vi khuẩn sợi (Ventural et al., 2007). Khả năng đồng hoá các chất cũng thay đổi tùy theo các loài hay chủng vi khuẩn sợi khác nhau (Barka et al., 2016).

f. Vòng đời hay chu kỳ sống của vi khuẩn sợi 2.4. Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp

2.4.1 Lược khảo chung về kháng sinh 2.4.2 Kháng sinh do vi khuẩn sợi tổng hợp:

Hai kháng sinh đầu tiên được khám phá ở vi khuần sợi là Actinomycin vào năm 1940 khi ni cấy lồi

Streptomyces antibioticus (Barka et al., 2016) và Streptomycin (1943-1944) (Zaffiri et al., 2012). Từ đó về sau

người ta thu nhận được phần lớn chất kháng sinh từ nuôi cấy vi khuẩn sợi thuộc chủng Streptomyces (70%, Ningthoujam et al., 2009). Nhìn chung, vi khuẩn sợi có nguồn gốc đại dương đủ khả năng tổng hợp khá nhiều nhóm chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u và độc tố tế bào (Manivasagan et al., 2013), gồm 6 nhóm chất:

1. Aminoglycoside

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

5

2. Chloramphenicol

3. Glycopeptides, β-lactams, polyenes và actionomycins 4. Peptides là những chuổi đa phân tử ngắn

- Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất trao đổi sơ cấp duy nhất (như chất kháng sinh cloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm nucleozide).

- Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau (như các chất kháng sinh lincomicin, novobiocin).

- Chất kháng sinh được tổng hợp bằng cách polyme hóa các chất trao đổi bậc 1, sau đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác.

2.5. Sự tồn tại của các gen mã hóa kháng sinh (pks-I, pks-II và nrps) để nhận diện vi khuẩn sợi có khả

Sự phát hiện các gen pksI, pksII và nrps phụ thuộc vào việc sử dụng mồi PCR phù hợp. Bên cạnh đó, gen

nrps khơng nhất thiết phải liên quan đến sinh tổng hợp chất thứ cấp, mà có thể liên quan đến chức năng khác như

trao đổi sắt hoặc chưa có chức năng. Tuy nhiên, chiến lược sàng lọc bằng PCR vẫn được đánh giá là hiệu quả

trong việc tìm kiếm những chất thứ cấp có ích lợi mới (Jiang et al., 2007).

Bảng 2.3: Những cặp mồi dùng để khuếch đại các trình tự 16S rDNA, PKS-KS và NRPS-A của vi khuẩn sợi cộng

sinh với hải miên (Liu et al., 2019)

Cặp mồi Trình tự đích

Trình tự mồi (5’-3’) Kích thước đoạn khuếch

đại (bp)

Nhiệt độ bắt cặp (oC)

27F 1492R

16S rDNA gene

AGA GTTTGA TCM TGG CTC AG GGY TAC CTT GTT ACG ACT T

DKF DKR

Cụm PKS GTGCCGGTNCCRTGNGYYTC GCGATGGAYCCNCARCARYG

KS1F1 KS1R1

Vùng KS týp 1

ATG GAY CCS CAR CAR CGB CT GCY TCG ATS GGR TCN CCS A

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

6

Cặp mồi Trình tự

đích

Trình tự mồi (5’-3’) Kích thước đoạn khuếch

đại (bp)

Nhiệt độ bắt cặp (oC)

KS2aF1 KS2bR1

Cụm KS týp 2

TSG CST GYT TCG AYG CSA T GCR TAG AAC CAS GCG AWS GAC

A3F A7R

Vùng Adenyl hóa

của NRPS

GCSTACSYSATSTACACSTCSGG SASGTCVCCSGTSCGGTAS

* Các gen mã hóa kháng sinh khác của vi khuẩn sợi

Những gen cần thiết cho sự hình thành cấu trúc khuẩn ty khí sinh (sinh bào tử) là các gen bld và whi. Hoặc

gen KSα tổng hợp polyketide vịng thơm và qua đó gián tiếp làm marker nhận diện các chủng tạo kháng sinh, hỗ

trợ khá hiệu quả cho việc sàng lọc vi khuẩn sợi. Barka et al. (2016), cho rằng môi trường dinh dưỡng nghèo carbon sẽ kích hoạt các cụm gen ngủ cpk (mã hóa cho kháng sinh coelimycin), lồi Streptomyces coeliolor có hơn 20

cụm gene loại này.

2.6. Một số thành tựu nghiên cứu về vi khuẩn sợi tổng hợp kháng sinh phân lập từ rừng ngập mặn 2.6.1 Trên thế giới

Ấn Độ, Trung Quốc là hai quốc gia tích cực hàng đầu trong khía cạnh tìm kiếm kháng sinh từ vi khuẩn sợi, với rất nhiều bài báo được công bố. Suốt 40 năm, đã thu thập được 41 loài thuộc 8 chi vi khuẩn sợi từ những vùng

cửa sông, ven biển và rừng ngập mặn khắp Ấn Độ, trong đó có 34/41 lồi thuộc vào chi Streptomyces (Sivakumar

et al., 2007).

Các nhà khoa học của Mỹ, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Đức và Ai Cập cũng có xu hướng chuyển dần nghiên

cứu từ vi khuẩn sợi trong nội địa sang nhóm đại dương, thể hiện qua các cơng trình của Ayuso et al. (2005) với mẫu đất ven biển, (Abdelmohsen et al., 2010) với mẫu hải miên và Kumar et al.,(2018) với mẫu trầm tích biển;

trong đó số lượng chi lồi liên kết với hải miên có phần phong phú hơn.

Mặc dù rất giàu tiềm năng nhưng điều kiện môi trường khắc nghiệt cũng làm cho kiến thức về các loài vi khuẩn sợi rừng ngập mặn chưa được khào sát sâu rộng đầy đủ. Ví dụ 40,2% các chủng phân lập từ rừng ngập mặn

Malaysia là những chi vi khuẩn sợi hiếm ngoài chi Streptomyces và chỉ mới biết được 25% các hợp chất sinh học của chúng (Azman et al., 2015).

Tóm lại, vấn đề kháng thuốc cũng buộc con người tiếp tục tìm tịi các chất kháng khuẩn mới mà trong đó vi khuẩn sợi, đặc biệt là các dịng có liên quan đến môi trường biển, là nguồn nghiên cứu rất tiềm năng. Các loài

thuộc chi Streptomyces vẫn tiếp tục giữ vai trò nổi bật, xuất hiện nhiều nhất trong các phân lập và cung cấp nhiều

chất mang tính ứng dụng cao.

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Thời gian thực hiện các nội dung thí nghiệm bắt đầu từ tháng 02 năm 2019 đến tháng 12 năm 2021 và tiến hành phân tích dữ liệu đến tháng 01 năm 2022.

3.2. Phương tiện nghiên cứu 3.2.1 Nguyên vật liệu 3.2.2 Thiết bị - dụng cụ 3.2.3 Hóa chất – mơi trường 3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.3 Đánh giá khả năng kháng khuẩn 3.3.3.1 Mục tiêu thí nghiệm

3.3.3.2 Các bước tiến hành thí nghiệm

- Tiến hành trải các vi sinh vật thử nghiệm với nồng độ 106 CFU/mL lên môi trường MHA bằng tăm bông vô trùng.

- Khoan lỗ tạo giếng thạch trên các đĩa đã trải vi sinh vật thử nghiệm (Giếng thạch có đường kính 6 mm, sâu khoảng 2,5 mm; mỗi đĩa 5 giếng thạch).

- Hút 1 mL dung dịch nuôi vi khuẩn sợi trong ống falcon cho vào tube 2,2 mL đã khử trùng. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút.

- Lọc bỏ phần cặn, lấy phần dịch trích trong cho vào tube mới.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

8

- Hút 50 µL phần trong từ tube, nhỏ vào giếng đã khoan lỗ sẵn trên môi trường đã trải các dòng vi sinh vật thử nghiệm; mỗi dòng vi khuẩn sợi lặp lại 3 lần.

- Hút 50 µL kháng sinh đã pha lỗng nhỏ vào giếng thạch làm đối chứng dương. - Hút 50 µL nước cất (đã khử trùng) nhỏ vào giếng thạch làm đối chứng âm; - Ủ các đĩa ở 37oC trong 24 giờ.

3.3.3.3 Chỉ tiêu theo dõi

Quan sát, ghi nhận hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng khả năng tạo vòng ức chế xung quanh lỗ trên đĩa thạch theo công thức sau đây: Đường kính vịng kháng khuẩn = D - d (mm). Với: “D” là đường kính vịng kháng trên đĩa thạch và lỗ, “d” là đường kính của lỗ đục sẵn trên đĩa thạch.

So sánh tuyển chọn dòng vi khuẩn sợi tiềm năng căn cứ vào quy ước của Galindo (2004) (Bảng 3.5) và khả năng kháng được nhiều dòng vi khuẩn gây bệnh.

Bảng 3.5: Quy ước khả năng kháng khuẩn (Galindo, 2004)

*Phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rDNA

Sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho vi khuẩn sợi (Stach et al., 2003 và Sun et al.,2015):

SC-Act-0235-aS-20: 5’-CGCGGCCTATCAGCTTGTTG-3’. SC-Act-0878-aA-19: 5’- CCGTACTCCCCAGGCGGGG- 3’.

Tiến hành điện di

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di một chiều trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X, ở hiệu điện thế 150 V trong khoảng 30 phút, quan sát dưới đèn UV và chụp hình. Sử dụng thang chuẩn 100 bp plus để ước lượng kích thước của các sản phẩm PCR. Hoặc sản phẩm khuếch đại được lưu giữ ở nhiệt độ 4oC để sử dụng sau.

*Giải trình tự

Các mẫu DNA sau khuếch đại được gửi để phân tích trình tự nucleotide, do Cơng ty CP Cơng nghệ TBR, TP.Hồ Chí Minh thực hiện.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

9

3.3.4.3 Phân tích kết quả

Kết quả trình tự các đoạn gen 16S rDNA của các dịng vi khuẩn sợi được so sánh độ tương đồng ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình BLASTN (). Kết hợp với các đặc điểm sinh học khác để đề xuất tên phân loại. Đồng thời, khảo sát các mối quan hệ di truyền bằng phần mềm CLUSTALX, version 1.8 và phần mềm Mega 7.0 với hệ số bootstrapping 1000 lần.

3.3.5 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS 3.3.5.1 Mục tiêu

3.3.6. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ vi khuẩn sợi tiềm năng được tuyển chọn

3.3.6.1 Mục tiêu

3.3.6.2 Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn sợi.

Dịng vi khuẩn sợi tuyển chọn được ni với trong môi trường lỏng Starch Casein lỏng trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC trong 3 ngày.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

10

3.3.6.3 Chiết tách các chất từ dịch nuôi cấy vi khuẩn sợi với ethyl acetate

Các hợp chất trong dịch nuôi cấy vi khuẩn sợi được chiết theo phương pháp chiết tách lỏng – lỏng bằng

dung môi ethyl acetate, tỷ lệ 2:1, lặp lại 3 lần. (Lee et al., 2014 và Siddiquee et al., 2015)

*Đánh giá khả năng kháng khuẩn của mẫu cao chiết

Mẫu cao chiết thô sau khi chiết tách của dòng vi khuẩn sợi được đánh giá khả năng kháng khuẩn gồm các bước như trong mục 3.3.3 ở trên.

*Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS)

Mẫu cao chiết được gửi tinh sạch bằng phương pháp sắc ký cột, tiếp theo được phân tích bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) để tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học. Các kỹ thuật sắc ký do Bộ môn Khoa học Môi trường thuộc Khoa Môi trường và Tài nguyên thiên nhiên, Đại học Cần Thơ, giúp đỡ thực hiện.

Chương trình phân tích:

Chế độ ion hóa: EI, 70 eV. Loại ion: Positive Vùng khối phổ: 35-400 amu

Buồng tiêm: Nhiệt độ: 3000C. Thể tích tiêm: 1 L. Mode: Split. Split ratio: 10

Bảng 3.10: Chương trình nhiệt độ phân tích GC-MS

Tốc độ (0C/phút) Nhiệt độ (0C) Giữ (phút)

</div>