tiểu luận phương pháp phân tích trong cnsh chủ đề aflatoxin

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.69 MB, 11 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM------

TIỂU LUẬN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCHTRONG CNSH

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

II.2 Nguồn thực phẩm chứ aflatoxin6

II.3 Các phương pháp định lượng aflatoxin6

III.1 Chuẩn bị dung dịch aflatoxin tiêu chuẩn 7

III.2 Chuẩn bị mẫu thực vật 7III.3 Lây nhiễm mẫu với aflatoxin 7III.4 Chiết mẫu 7

V.4 Độ chụm 9

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

I. Đặc điểm chất phân tích

I.1. Định nghĩa Aflatoxin

Aflatoxin là viết tắt của Aspergillus flavus toxins.

Aflatoxin là chất độc được sản sinh ra như một chất chuyển hố trong qtrình trao đổi chất của nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trongthực phẩm và thức ăn gia súc. Aflatoxin là độc tố tích luỹ trong cơ thể người và giasúc, các aflatoxin có thể được gan chuyển hóa thành dạng trung gian epoxit hoạthóa hoặc được thuỷ phân và trở thành M1 ít độc hơn.

I.2. Công thức

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

B1 (C17 H12 O6), B2 (C17 H14 O6), G1 (C17 H12 O7), G2 (C17 H14 O ),…7

I.3. Đặc điểm

Aflatoxin là tinh thể màu trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấuở nhiệt độ thông thường (ở 1200 độ C phải đun 30 phút mới mất tác dụng độc) dovậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm khơng cần sự có mặt của nấm mốc tươngứng; đồng thời nó rất bền với men tiêu hóa. Tuy nhiên nó lại khơng bền dưới ánhsáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháphơn. Có 17 loại aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp bao gồm 6 loại (B1, B2,

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

G1, G2, M1 và M3). Aflatoxin B1 là loại cực độc, một lượng khoảng 0,03 ppm từaflatoxin B1 từ khơ lạc có thể gây ra u gan.

Aflatoxin là một mycotoxin được tiết ra từ nấm Aspergillus vàA.parasiyicus, các chủng nấm này phát triển mạnh ở các loài thực phẩm nông sản,thức ăn gia súc, gia cầm như ngô, lạc, đậu,… trong các điều kiện thuận lợi nóngẩm, nhất là điều kiện thời tiết ở Việt Nam. Tác hại của độc tố vi nấm này đối vớiđộng vật đã được biết đến từ lâu và đã được chứng minh có thể gây ung thư gan

Thông thường trong những điều kiện phù hợp Aspergillus sẽ sinh raAflatoxin song không đủ lượng để gây ngộ độc nặng, nó làm giảm khả năng hấpthu dinh dưỡng, vật nuôi tăng trưởng chậm, còi cọc làm tăng tiêu tốn thức ăn, khảnăng miễn dịch giảm, vật nuôi dễ mắc bệnh. Độc tốc gây hư hại tế bào gan, thận,gây ung thư làm tăng tỷ lệ chết ở thú non, giảm năng suất và sản lượng. Nếu conngười ăn thịt chứa aflatoxin thì có thể bị ung thư gan.

Độc tính trên động vật thí nghiệm: nhiễm độc các aflatoxin gây ra một loạtcác triệu chứng cấp tính và mãn tính. Nhiễm độc thường biểu hiện bằng cái chếtcủa các động vật thí nghiệm với các triệu chứng thường gặp là hủy hoại tử mô gan

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

chảy máu ở gan và viêm thận cấp. nhiễm độc mãn tính thường biểu hiện bằng ănkém ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mơ. Loại mãn tính tácđộng tới yếu tố di truyền tương ứng với ba kiểu gây ung thư, gây quái thai và gâyđột biến.

Đối với cơ thể: aflatoxin được xem như là một trong các tác nhân gây ungthư gan ở người và gây ra dị tật thai ở phụ nữ mang thai. Tác động bệnh lý củaaflatoxin có tính cộng hưởng với những tác nhân khác: HBV, hoặc những độc tố ditruyền. bên cạnh gan, các cơ quan khác như: phổi, thận, mạc treo, túi mật cũng bị tổthương ít nhiều

Khả năng tác động lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn:

Tác động qua lại với ADN ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm tổng hợpADN và ARN.

II. Nguồn gốc

II.1. Phát hiện Aflatoxin

Độc tố nấm đã từ lâu được các nhà khoa học quan tâm, trong những năm1920 – 1930 ở Anh và Liên Xô đã phát hiện nhiều trường hợp ngộ độc Alcalloit ởngười và ở gà mà chất này tìm thấy trong lúa mạch và lúa mì. Năm 1960 một vụdịch làm chết hàng ngàn con gà tây tại một quần đảo nước Anh do ăn phải lạc thốimốc, các nhà khoa học phương tây tiến hành nghiên cứu và phát hiện ra độc tốiAnatoxin, độc tố tiết ra từ nấm Aspergillus flavus, parasiticus và fumigatus. Năm1961 ở Anh, người ta đã tiến hành thực nghiệm trên chuột cống cho ăn thức ăn đãnhiễm nấm mốc trong đó có 20% là bột lạc thối, sau 6 tháng thấy xuất hiện ung thưgan. Nghiên cứu của Shank mẫu lương thực thực phẩm bị mốc thì 50-60% cóAflatoxin, tại các gia đình cũng có 30-50% số mẫu có độc tố aflatoxin.

II.2. Nguồn thực phẩm chứa Aflatoxin

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

Ở Việt Nam, theo Viện VSDT nghiên cứu trên 29.381 mẫu lương thực thựcphẩm thấy có khoảng 30 loại men mốc khác nhau, trong đó Aspergillus chiếm tỷ lệcao nhất (5,2 – 80,39%) bao gồm 12 chủng Aspergillus khác nhau, trong đó có 11chủng sinh độc tố. Các sản phẩm thực phẩm có thể nhiễm Aflatoxin: các loại hạtngũ cốc, ngơ, thóc, gạo, lúa mì, bo bo…; các loại hạt có dầu như lạc, dừa, đậutương, hướng dương…; củ sắn, khoai tây; sữa tươi, phomat; sản phẩm lên men nhưbia, nước giải khát, rượu vang,...

Thực phẩm nhiễm aflatoxin

II.3. Các phương pháp định lượng Aflatoxin

Điều kiện tiến hành phân tích: ở phịng mát, tránh ánh nắng.

Có nhiều phương pháp phát hiện aflatoxin, các phương pháp lý hóa học chủ yếudựa trên tính chất phát huỳnh quang của bước sóng tử ngoại của aflatoxin.Aflatoxin có thể được phát hiện và định lượng bằng phương pháp sắc ký trên giấyvới các hệ dung môi butanol – nước – acetic (20:1:19) hay chloroform – methanol– (95:5) và sắc ký bản mỏng trên alumin, bột kieselguhl, bột cellulose với hệ dungmôi chloroform – methanol (99:1 hay 93:7) hoặc chloroform – aceton (90:10 hay85:15),… cũng có thể định lượng aflatoxin bằng sắc ký trên cột nhôm oxyd, cộtsilicagel với các dung dịch rửa là cloroform và hỗn hợp 5% methanol – cloroform.Hiện nay, phương pháp phổ biến nhất cho phát hiện định lượng aflatoxin với độnhạy cao là sử dụng HPLC.

Trong bài báo cáo này, em xin trình bày phương pháp định lượngaflatoxin có trong loài Maytenus ilicifolia bằng HPLC sử dụng đầu dò

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

Fluorescence, phương pháp được phát triển bởi Sayonara Lia Fook MeiraBraga và cộng sự (2005).

III. Chuẩn bị mẫu

III.1. Chuẩn bị dung dịch aflatoxin tiêu chuẩn

Dung dịch aflatoxin ban đầu được pha loãng với methanol để thu được dungdịch gốc với hàm lượng 10.0μg/mL và được bảo quản lạnh ở -20 C. Dung dịch gốcosau đó được pha lỗng bằng methanol để thu được dung dịch tiêu chuẩn với hàmlượng 1.0μg/mL. Nồng độ aflatoxin trong dung dịch chuẩn được kiểm tra bằngphương pháp quang phổ UV, tuân theo công thức

c = A × CF × MW × 1000/ε

Với A là độ hấp thụ ở bước sóng 362nm, CF là chỉ số tuyến tính của thiết bị, MWlà khối lượng phân tử của aflatoxin và ε bằng 21800, 24000, 17000 và 19300 vớilần lượt aflatoxin B , B , G , G1212.

III.2. Chuẩn bị mẫu thực vật

Mẫu M.ilicifolia được thu thập từ các cửa hàng y tế và hiệu thuốc địaphương. Chọn 10 túi mẫu ngẫu nhiên, trộn lại và lấy 500g từ hỗn hợp đem đi phântích. Mẫu sau đó được trộn, nghiền thành bột và mang đi lọc qua lưới dây. Sau khilọc đem chia nhỏ và bảo quản ở -20 C. o

III.3. Lây nhiễm mẫu với aflatoxin

5g mẫu sạch được chuẩn bị như trên được cho vào cốc đựng và 1mLaflatoxin được thêm vào để thu được mẫu chứa nồng độ aflatoxin trong khoảng 4-20ng/g.

III.4. Chiết mẫu

Lấy 5g mẫu cho vào cốc đựng, thêm vào 70mL hỗn hợp methanol:nước (tỉ lệ7:3) và 1g kali chloride. Hỗn hợp sau đó được siêu âm trong 60 phút và được lọcqua giấy lọc. 16 mL dịch lọc sau đó được pha lỗng với 32 mL dung dịch đệmphosphate pH 7.3 và lại được tiếp tục lọc. Sau khi lọc xong lấy 25 mL dịch lọcmang đi rửa cột ái lực.

III.5. Làm sạch mẫu

Dung dịch chiết thu được được đưa qua cột ái lực miễn dịch .Sau khi rửa với15 mL nước, aflatoxin được rửa giải trong ba bước liên tiếp với 1 mL metanol,vớikhoảng thời gian 30 giây sau mỗi bước, trong điều kiện giảm áp suất bằng cách sử

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

dụng một ống góp chân khơng. Dung dịch thu được được pha loãng với 3 mLmetanol và một phần dịch được chuyển vào lọ thủy tinh lấy mẫu tự động 2 mL vàđược sử dụng trực tiếp để tiêm vào HPLC.

IV. Điều kiện chạy sắc ký

IV.1. Cột sắc ký

Quá trình phân tách sắc ký được thực hiện trên cột Shim-pack CLC-ODS (5μm, 250 x 4.6 mm.

IV.2. Nhiệt độ, thể tích bơm mẫu và tốc độ dịng

Nhiệt độ chạy sắc ký của cột được duy trì ở nhiệt độ 35 C, thể tích bơm là 20oμL một lượt bơm và tốc độ dòng là 0,8 mL/phút.

IV.3. Detector

Detector 10Axl fluorescence có bước sóng kích thích là 360 nm và bướcsóng phát xạ là 440nm.

IV.4. Dung mơi pha động

Dung môi pha động là hỗn hợp gồm nước:methanol:acetonitrile (56:29:17).

V. Kết quả

V.1. Đường hiệu chuẩn

Đường hiệu chuẩn đã được xây dựng bằng cách lây nhiễm mẫu với aflatoxinở mức nồng độ 4-20ng/g. Dữ liệu được thu ở bảng, cho thấy dư lượng aflatoxintuyến tính trong phạm vi nồng độ thử nghiệm.

V.2. Độ thu hồi

Độ thu hồi của phương pháp được xác định bằng nồng độ aflatoxin trongmẫu đã được lây nhiễm với dung dịch aflatoxin tiêu chuẩn ở nồng độ 7-10ng/g. Kếtquả cho thấy ở nồng độ 7ng/g độ thu hồi trung bình dao động từ 55,4-61,4%. Ở

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

nồng độ 10ng/g, độ thu hồi trung bình dao động từ 61,7-91,6%. Mặc dù độ thu hồikhá thấp nhưng nó nằm trong giới hạn quy định bởi European Community directive(European Community, 1998) với việc xác định aflatoxin ở nồng độ thấp hơn1μg/mL.

V.3. Độ chính xác

Độ chính xác được kiểm tra trong cùng một ngày và trong một tuần. Để kiểmtra độ chính xác, mẫu đầu tiên được lây nhiễm với aflatoxin ở nồng độ 7,15 và 20ng/g, sau đó được đem đi chiết. Nồng độ aflatoxin trong mẫu lây nhiễm sau đóđược định lượng và so sánh với nồng độ trước khi lây nhiễm, cũng như tính tốn độlệch với từng nồng độ lây nhiễm. Kết quả cho thấy thử nghiệm trong ngày và liênngày đều tốt với giá trị độ lệch đều nhỏ hơn 20%, cũng như thử nghiệm liên ngàycó độ chính xác cao hơn.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

V.4. Độ chụm

Độ chụm được thể hiện bởi giá trị RSD và mọi giá trị RSD đều nhỏ hơn 20%. Giới hạn phát hiện nhỏ nhất (LOD) được tính tốn là 4ng/g với aflatoxin B , 1B2 và G và 7ng/g với aflatoxin G2 1

VI. Tài liệu tham khảo

Giáo trình nấm học – Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Bá, Nguyễn Văn ThànhĐộc tố học và an toàn thực phẩm – Lê Ngọc Tú

Tạp chí nơng nghiệp viễn thơng

Development and Validation of a Method for the Quantitative Determination of Aflatoxin Contaminants in Maytenus ilicifolia by HPLC with Fluorescence

Detection - Sayonara Lia Fook Meira Braga, Francinalva Dantas de Medeiros,

Eduardo de Jesus Oliveira and Rui Oliveira Macedo (2005). DOI: 10.1002.pca.837

</div>