nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn streptococcus iniae vào cá chẽm (lates calcarifer) và đánh giá khả năng phòng bệnh do streptococcus iniae gây ra bằng cách ngâm cá trong vaccine

Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang i
LỜI CẢM ƠN
Thực tập tốt nghiệp thật sự là cơ hội quan trọng để sinh viên nói chung, sinh
viên chuyên ngành Bệnh học thủy sản nói riêng có thể tiếp cận với thực tế nghề
nghiệp, rèn luyện phương pháp nghiên cứu khoa học và hoàn thiện những kỹ năng
thực hành cần thiết trước khi rời khỏi giảng đường đại học. Những kiến thức đúc
kết được sẽ là bước đệm vững chắc, hỗ trợ cho công việc thực tế sau này.
Trong thời gian hoàn thành đồ án tốt nghiệp, ngoài những cố gắng của bản
thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều cơ quan và cá nhân. Với tất cả sự chân
thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin được gởi lời cảm ơn tới:
Thạc sĩ Trần Vĩ Hích-giáo viên hướng dẫn, người đã định hướng, động viên
và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi được thực hiện đề tài này.
Tiến sĩ Nguyễn Hữu Dũng-giám đốc trung tâm Giống và Dịch bệnh thủy sản,
trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được học hỏi và thực hiện đề tài
tại đây.
Ban chủ nhiệm Khoa Nuôi trồng Thủy sản, các thầy cô bộ môn Bệnh học
thủy sản đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và những người thương yêu tôi đã
luôn bên cạnh, giúp tôi có thêm sức mạnh thực hiện tốt đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, tháng 06 năm 2012
Sinh viên thực hiện

Võ Thị Mỹ Dung

Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang ii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
MỞ ĐẦU 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN 3
1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm 3
1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Streptococcosis trên cá 4
1.2.1 Bệnh Streptococcosis 4
1.2.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trên cá 5
1.2.2 Bệnh do Streptococcus iniea gây ra trên cá chẽm 8
1.3. Vaccine 8
1.3.1 Tình hình nghiên cứu phát triển vacxin ở cá trên thế giới 9
1.3.2 Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá. 10
1.3.3 Tình hình nghiên cứu và triển vọng sử dụng vacxin ở Việt Nam 13
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 14
2.2. Vật liệu nghiên cứu. 14
2.2.1. Môi trường. 14
2.2.2. Hóa chất. 14
2.2.2.1. Hóa chất sản xuất vaccine, xác định đặc điểm sinh hóa. 14
2.2.2.2. Hóa chất nhuộm mô hóa miễn dịch. 14
2.2.3. Dụng cụ, thiết bị. 15
2.2.3.1. Nuôi cấy vi khuẩn, sản xuất vaccin và cắt mô. 15
2.2.3.2. Xác định hiệu quả vaccin. 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu 15

Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang iii
2.3.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu (Hình 2.1). 15
2.3.2. Kiểm tra một số đặc điểm sinh hóa của hai chủng Streptococcus
iniae. 15
2.3.3 Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị vacxin Streptococcus iniae bất hoạt. 16
2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm và thu mẫu 18
2.2.4.2. Xử lý mẫu. 18
2.2.4.3.Quy trình nhuộm mô hóa miễn dịch. 18
2.2.5. Phương pháp đánh giá hiệu quả vaccine. 19
2.2.5.1. Chuẩn bị cá thí nghiệm 19
2.2.5.2 Xác định liều gây chết 50% (LD50) bằng phương pháp ngâm 21
2.2.6 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm ngược, xác định tỷ lệ sinh tồn tương
đối RPS (%). 21
2.2.7 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 21
2.2.7.1 Phương pháp xác định các thông số 21
2.2.7.2 Phương pháp xử lý số liệu 22
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
3.1 Các đặc điểm sinh hóa của hai chủng vi khuẩn Streptococcus inae 23
3.2 Kết quả LD50 (%) và độc lực của chủng vi khuẩn Strep1 25
3.3 Sự xâm nhiễm của vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm. 27
3.4 Đánh giá mức độ an toàn của vaccine 31
3.5 Kết quả cảm nhiễm cá sau khi dẫn truyền vaccine và tỷ lệ sinh tồn tương
đối RPS (%) 33
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 38
4.1. Kết luận. 38
4.2. Đề xuất ý kiến 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

API Strep Tên KIT định danh
BA Blood agar
CFU ( Colony forming unit) Đơn vị hình thành khuẩn lạc
DAB 3,3’-Diaminobenzidinetetrahydrochloride
ĐC Đối chứng
g Gravity
h Giờ
LD
50
Liều gây chết 50%
Mabs (Mono-antibody) Kháng thể đơn dòng
NT Nghiệm thức
PBS Phosphate buffered saline
ppt Nồng độ phần nghìn
RPS (Relative percent survival) Tỷ lệ sinh tồn tương đối
SE Sai số chuẩn
SGR (specific growth rate) Tốc độ sinh trưởng đặc trưng
SL (standard length) Chiều dài thân (không kể đuôi)
TBS Tris Buffered Saline
TSA Trypticase Soy Agar
TSB Trypticase Soy Broth
w/v (weight / volume ) Khối lượng / thể tích
v/v (volume / volume) Thể tích / thể tích

Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang v
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. So sánh đặc điểm sinh hóa 2 chủng Strep1, Strep 2 với S. iniae từ các
nghiên cứu khác. 24
Bảng 3.2. Tốc độ sinh trưởng đặc trưng theo chiều dài của cá chẽm ở các nghiệm
thức. 32
Bảng 3.3. Tỷ lệ chết trung bình và tỷ lệ sinh tồn tương đối ở các nghiệm thức 34

Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cá chẽm Lates calcarifer 3
Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình nghiên cứu mô hóa miễn dịch. 17
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ của vaccine. 20
Hình 3.1: Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn Streptococcus iniae trên môi trường BA bổ
sung 5% máu cừu và 2% NaCl (A); mẫu soi tươi của vi khuẩn trên khi được nuôi
trong môi trường TSB (B). 23
Hình 3.2: Đồ thị về tương quan giữa tỷ lệ cá chết với nồng độ vi khuẩn chủng
Strep1 trong thí nghiệm xác định LD50 (%) bằng phương pháp ngâm 26
Hình 3.3: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá chẽm ở những nồng độ vi khuẩn khác nhau khi
cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm 26

Hình 3.4: Một số dấu hiệu bệnh lý của cá chẽm bị nhiễm bệnh do S. iniae khi cảm
nhiễm bằng phương pháp ngâm. (A) xuất huyết bụng, (B) màu sắc cơ thể đen tối,
xuất huyết ở gốc vây ngực 27
Hình 3.5: Sự hiện diện cuả vi khuẩn () trong các cơ quan khác nhau: (A, B)
mang, (C, D) mô thận, (E, F) lách. Lách (E) thể hiện sự thoái hóa () 28
Hình 3.6: Mô gan và ruột của cá chẽm sau khi được cảm nhiễm với S. iniae: (A, B)
mô gan thể hiện sự xuất hiện của vi khuẩn (), hình thành các không bào () và
thoái hóa (); (C, D) mô ruột có nhiều vi khuẩn bên trong () 29
Hình 3.7: Sự hiện diện cuả vi khuẩn () trong mắt (A, B) và não (C, D) cá chẽm
sau khi cảm nhiễm S. iniae bằng phương pháp ngâm 30
Hình 3.8. Tỷ lệ chết tích lũy (%) của cá chẽm ở các nghiệm thức khác nhau. 33
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 1
MỞ ĐẦU
Nghề nuôi tôm sú đi vào giai đoạn thoái trào đã làm cho nghề nuôi trồng
thủy sản Việt Nam phải chuyển hướng sang những đối tượng thay thế mới. Trong
nỗ lực thay đổi đó, cá chẽm được đưa vào nghiên cứu và chuyển giao cho người
nuôi. Với ưu thế là tốc độ sinh trưởng khá nhanh, dễ nuôi, năng suất nuôi cao và có
giá trị kinh tế, cá chẽm đã dần dần là đối tượng nuôi quan trọng ở nhiều vùng nước
ta. Tuy nhiên, sự phát triển nghề nuôi cá chẽm gia tăng nhanh chóng cả về quy mô
và diện tích, đồng thời thiếu sự quản lý, quy hoạch trong quá trình phát triển trong
thời gian qua đã dẫn đến một số vấn đề về môi trường và dịch bệnh, kết quả là các
báo cáo dịch bệnh trên đối tượng nuôi này xuất hiện với tần số ngày càng tăng.
Một trong những bệnh nguy hiểm và thường gặp đã được thông báo trên cá
chẽm có thể kể đến là bệnh Streptococcosis do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra.
Bệnh đã được bắt gặp trên nhiều hệ thống nuôi cá chẽm ở Việt Nam và một số quốc
gia trên thế giới với tỷ lệ gây chết lớn lên đến 70% trong một thời gian ngắn, gây
thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi. Kháng sinh, chất kích thích miễn

dịch và vaccine là những công cụ được ứng dụng để kiểm soát bệnh. Tuy nhiên, so
với vaccine, hai công cụ kháng sinh và chất kích thích miễn dịch còn thể hiện nhiều
hạn chế. Sử dụng kháng sinh có thể để lại dư lượng trong cá, trong môi trường tạo
ra những tác động tiềm ẩn gây nguy hại cho môi trường và con người, từ đó dẫn đến
những sản phẩm dùng kháng sinh gặp phải e ngại của người tiêu dùng, gây khó
khăn trong tiêu thụ. Sử dụng chất kích thích miễn dịch tuy an toàn với con người,
với môi trường và vật nuôi nhưng lại chỉ tạo ra sự bảo vệ trong một thời gian ngắn.
Do đó, sử dụng vaccine là phương pháp kiểm soát tối ưu được các nhà khoa học
hướng đến để kiếm soát bệnh này.
Trên thế giới, vaccine phòng bệnh Streptococcosis đã được nghiên cứu từ
những năm 1980, trên thị trường cũng đã xuất hiện sản phẩm vaccine thương mại để
phòng bệnh S. iniae trên các loài cá khác nhau, nhưng ở Việt Nam lĩnh vực vaccine
còn rất mới. Với mục tiêu phát triển nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam nói chung,
nghề nuôi cá chẽm nói riêng hướng tới sự bền vững, thận thiện với môi trường và
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 2
an toàn với con người, các nỗ lực nghiên cứu để hiểu hơn về tác nhân gây bệnh, từ
đó sản xuất và đưa vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá chẽm vào ứng dụng
đã và đang được thực hiện.
Được sự cho phép của khoa Nuôi trồng thủy sản, trường Đại học Nha Trang
và sự định hướng, giúp đỡ của thầy Trần Vĩ Hích, tôi đã thực hiện đề tài tốt nghiệp
với tiêu đề: “Nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus
iniae vào cá chẽm (Lates calcarifer) và đánh giá khả năng phòng bệnh do
Streptococcus iniae gây ra bằng cách ngâm cá trong vaccine”
Nội dung thực hiện:
1. Nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá
chẽm.
2. Đánh giá khả năng phòng bệnh do Streptococcus iniae gây ra bằng cách

ngâm cá trong vaccine.
Mục tiêu của đề tài: Xác định con đường xâm nhập, phát triển của S. iniae vào
cá chẽm Lates calcarifer và hiệu quả của vaccine dẫn truyền bằng phương pháp
ngâm trong phòng trị bệnh do S. iniae gây ra trên đối tượng này, từ đó làm cơ sở
khoa học cho những nghiên cứu tiến tới hoàn thiện quy trình sản xuất và sử dụng
vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá chẽm ở Việt Nam.
Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, kiến thức còn hạn chế và bước đầu làm
quen với phương pháp nghiên cứu khoa học nên đồ án khó tránh khỏi những sai xót.
Kính mong các thầy cô cùng bạn đọc đóng góp ý kiến để đồ án được hoàn thiện
hơn.






Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 3
PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm.
Cá Chẽm có hệ thống phân loại như sau:
Ngành: Chordata
Lớp: Actinopterygii
Bộ: Perciformes
Họ: Centropomidae
Giống: Lates Hình 1.1. Cá chẽm Lates calcarifer
Loài: Lates calcarifer (Bloch, 1790)

Tên tiếng Việt: Cá chẽm, cá vược.
Tên tiếng Anh: Sea bass, Barramundi, Giant seaperch [9]

Cá chẽm có thân hình thon dài và dẹp bên, cuống đuôi khuyết sâu. Chiều dài
thân bằng 2,7 – 3,6 lần chiều cao. Đầu nhọn, nhìn bên cho thấy phía trên hơi lõm
xuống ở giữa và hơi lồi ở lưng. Miệng rộng và hơi so le, hàm trên kéo dài đến
phía dưới sau hốc mắt. Răng dạng nhung, không có răng nanh, trên nắp mang
có gai cứng, vây lưng gồm có 2 vi: vi trước có 7-9 gai cứng và vi sau có 10-11 tia
mềm. Vi hậu môn có 3 gai cứng, vi đuôi tròn và có hình quạt. Vẩy dạng lược và có
kích cỡ vừa phải, có 61 vẩy đường bên.
Khi cá còn khoẻ, trên mặt lưng có màu nâu, mặt bên và bụng có màu bạc khi
sống trong môi trường nước biển, màu nâu vàng khi sống trong môi trường nước
ngọt. Khi cá ở giai đoạn trưởng thành sẽ có màu xanh lục hay vàng nhạt trên lưng
và màu vàng bạc ở mặt bụng.
Cá chẽm phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc tây Thái Bình
Dương và Ấn Độ Dương, từ Đông Phi đến Papua New Guinea, từ nam Trung Quốc,
Đài Loan đến Bắc Úc. Tại Việt Nam, cá chẽm có thể được tìm thấy ở vịnh Bắc bộ,
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 4
vùng biển Trung và Nam Bộ.
Về khả năng thích ứng với các yếu tố sinh thái, cá chẽm là loài có khả năng
thích ứng rộng với sự thay đổi độ mặn, cá giai đoạn giống và trưởng thành sống
được ở độ mặn từ 0 – 35 ppt và có thể chịu đựng tốt với sự thay đổi độ mặn đột
ngột. Thực tế cho thấy cá giống cỡ 2 – 3 cm có thể thuần hóa từ độ mặn 30 – 32 ppt
xuống 5 – 10 ppt trong 2 – 3 giờ (Kungvankij et al. 1984; Tucker, 2000) [1]

. Vì
vậy, đây là loài rất thích hợp cho phát triển nuôi cả trong nước ngọt, nước lợ cũng

như nuôi biển (Kungvankij et al. 1984; Schipp, 1996) [1]. Cá chẽm có thể thích ứng
với nhiệt độ từ 21 – 39
o
C, thích hợp nhất 27 – 30
o
C. Nhiệt độ thay đổi đột ngột
2 – 3
o
C có thể gây sốc cho cá giống (Tucker, 2000) [ 1]. Độ pH thích hợp cho cá từ
7,0 – 8,5; DO 4 -9 ppm; NH
3
-N < 0,025 ppm, H
2
S < 0,3 ppm (Kungvankij et al.
1984) [9]

.
Cá chẽm là loài cá dữ, ăn mồi sống và có khả năng ăn thịt đồng loại, đặc biệt tỉ
lệ chết do ăn nhau cao nhất ở giai đoạn từ 1 – 10 cm. Ngoài tự nhiên, thức ăn của cá
chẽm gồm cá nhỏ, tôm, cua, mực…
Cá chẽm là loài có kích thước lớn, khối lượng tối đa có thể đạt 60 kg. Cá tăng
trưởng chậm ở giai đoạn đầu, khi đạt 20 – 30 g tốc độ tăng trưởng nhanh hơn và
chậm lại khi đạt khoảng 4 kg. Cá bột mới nở có chiều dài 1,49 mm, sau 40 ngày đạt
cỡ 17,4 mm, 50 ngày đạt 28,9 mm, 90 ngày đạt chiều dài 93 mm, khối lượng là 9 g
(Kungvankij et al. 1984)

[1]. Trong điều kiện nuôi, cá giống cỡ 2 – 2,5 cm sau thời
gian ương từ 30 – 45 ngày đạt cỡ 5 – 11 cm, sau từ 6 đến 24 tháng nuôi thương
phẩm cá đạt 0,35 – 3 kg (Schipp, 1996)

[1]. Cá chẽm nuôi tại Úc dễ dàng đạt > 0,6
kg sau 12 tháng nuôi. Tại các vùng có nhiệt độ cao, cá có thể đạt 0,8 kg sau 12
tháng, 3 kg sau 18 – 24 tháng (Tucker et al. 2002)

[1].
1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Streptococcosis trên cá.
1.2.1 Bệnh Streptococcosis.
Streptococcosis là một bệnh thường gặp ở người, động vật trên cạn và cả ở
động vật thủy sản. Ở cá, Streptococcosis được xem là một phức hợp các bệnh giống
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 5
nhau được gây ra bởi các loài vi khuẩn khác nhau. Bệnh được phát hiện xảy ra đầu
tiên ở châu Á vào năm 1957 trên cá hồi Oncorhynchus mykiss tại Nhật Bản
(Hoshina et al. 1958) [28]. Từ đó, bệnh đã không ngừng lan rộng cả về quốc gia
phân bố, loài cá cảm nhiễm và trở thành một bệnh nhiễm khuẩn gây thiệt hại kinh tế
nghiêm trọng cho các quốc gia nuôi trồng thủy sản trên thế giới.
Phân lập vi khuẩn từ các loài cá bệnh khác nhau và phân loại dựa vào lai
đoạn DNA của chuỗi 16S cho thấy có ít nhất 6 loài Streptococcus khác nhau
Streptococcus parauberis, S. iniae (S. shiloi), S. difficilis (S. agalactiae),
Lactococcus garvieae (Enterococcus seriolicida), L. piscium và Vagococcus
salmoninarum (Mata et al. 2004) [25]. Trong những thông báo đầu tiên, các chủng
vi khuẩn gây bệnh này được phân chia làm 3 nhóm dựa vào đặc điểm dung huyết:
dung huyết α, dung huyết β (Boom-ker et al. 1979; Kitao et al. 1981) và dung huyết
γ (Plumb et al. 1974; Rasheed et al. 1985; Baya et al. 1990) [16], [27]. Ngày nay,
người ta chia những vi khuẩn này thành hai nhóm dựa vào độc lực của vi khuẩn
theo nhiệt độ. Trong đó, L. Garvieae, S. iniae, S. agalactiae và S. parauberis
được xem là các tác nhân gây bệnh Streptococcosis cho các loài cá nước ấm với
việc gây chết ở nhiệt độ trên 15

o
C, còn L. piscium và V. salmoninarum là những
tác nhân gây bệnh Streptococcosis nước lạnh [27]. Các vi khuẩn gây bệnh ở vùng
nước ấm được xem là những tác nhân tiềm năng có khả năng gây bệnh cho người.
1.2.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trên cá.
S. iniae là những vi khuẩn hình cầu, có đường kính lên đến 1,5 µm, các tế
bào thường ghép với nhau tạo thành chuỗi liên cầu. Những liên cầu khuẩn này
thuộc vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, không di động, có phản ứng oxidase
và catalase âm tính. Vi khuẩn sinh trưởng trong các môi trường tổng hợp như TSA,
BHIA hình thành các khuẩn lạc tròn nhỏ có đường kính 1 - 2 mm sau 24 - 48h nuôi
cấy ở 15 - 37
o
C, trong môi trường TSB vi khuẩn kéo dài thành chuỗi (Bromage at
al. 1999; Romalde et al. 2009). Nuôi cấy trên môi trường thạch có bổ sung 5% máu
cừu cho phản ứng dung huyết α hay β (Pier and Madin, 1976; Eldar et al. 1995;
Bromage et al. 1999; Suanyuk et al. 2010).
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 6
S. iniae là một trong những tác nhân chính gây bệnh ở động vật thủy sản, vi
khuẩn này được phân lập đầu tiên vào năm 1976 trên cá heo nước ngọt vùng
Amazon Inia geoffrensis, đến năm 1979 thì phát hiện đầu tiên trên cá nuôi, loài cá
nhiễm bệnh là cá yellowtail Seriola spp. ở Nhật Bản (Pier and Madin, 1976;
Minami et al. 1979) [16]. Chỉ một thời gian ngắn sau đó, tác nhân này đã lây lan
khắp Nhật Bản và nhiều quốc gia khác, cảm nhiễm nhiều ký chủ khác nhau.
Streptococcus iniae được xem là tác nhân gây bệnh chủ yếu ở cá rô phi
Oreochromis niloticus x O. aureus (Al-Harbi, 1994; Perera et al. 1994), striped bass
hybrids Morone saxatilis (Evans et al. 2000), cá hồi Oncorhynchus mykis (Hoshina
et al. 1958; Bragg và Broere, 1986; Ceschia et al. 1992) [16], [25]. Ngoài ra, một số

loài cá biển như yellowtail Seriola spp. (Kitao, 1982), cá bơn ở Nhật Bản
Paralichthys olivaceus (Nakatsugawa, 1983), cá chẽm châu Âu (Dicentrarchus
labrax) và cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus) (Eldar et al. 1999) ở Israel, gần đây là cá
chẽm (Latex calcarifer) ở Australia (Bromage et al. 1999), cá giò (Rachycentron
canadum ) cũng đã được thông báo là phân lập được vi khuẩn này. Theo thống kê
đến năm 2007, đã có trên 27 loài cá nước ngọt và nước mặn nhiễm bệnh do vi
khuẩn này gây ra [28]. Các quốc gia được thông báo chịu ảnh hưởng nặng nề của
bệnh như Nhật Bản, Irasel, Mỹ, Australia .
Những loài cá khác nhau khi bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae biểu
hiện những dấu hiệu khác nhau, tuy nhiên đều xuất hiện một số dấu hiệu chung, bao
gồm: Màu sắc đen tối, mắt cá lồi và đục, xuất huyết ở các gốc vây và xương nắp
mang, cá mất thăng bằng, bơi lội không bình thường (Perera et al. 1994; Bromage
et al. 1999; Eldar et al. 1999; Colorni et al. 2002) [25]. Các vết xuất huyết lan rộng
thành lở loét, nhưng các vết loét thường nông hơn các bệnh có lở loét khác. Dấu
hiệu điển hình của bệnh là cá vận động khó khăn, bơi xoắn, không định hướng,
xoang bụng tích dịch, xuất huyết các cơ quan nội quan, thận và lá lách tăng lên về
thể tích do phù nề (Bromage et al. 1999; Suanyuk et al. 2011). Kiểm tra mô học cho
thấy các biến đổi rõ rệt trong gan, thận, lách, tim, mắt và não. Gan, thận và tim thể
hiện phản ứng viêm nghiêm trọng. Trong mô gan, các mao mạch gia tăng về kích
thước, xuất hiện nhiều các tế bào lympho, các tế bào gan xuất hiện nhiều không
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 7
bào, thoái hóa và hoại tử (Suanyuk et al. 2011). Màng tim phình to với sự xuất hiện
nhiều các tế bào lympho và các trung tâm Melanomacrophage. Lách, não thể hiện
sự thâm nhập lượng lớn các tế bào lympho và sự tắc nghẽn nội mạch thường xuyên
chứng tỏ sự suy giảm các sợi fibrin trong các mao mạch (Bromage và Owen, 2002).
Bệnh có thể xảy ra ở dạng cấp tính hay bán cấp tính, ở dạng bán cấp tính cá
thể hiện các dấu hiệu bệnh lý bên ngoài đặc trưng của bệnh, nhưng nội quan không

bị tổn thương, dạng này tỷ lệ chết chỉ chiếm 1%. Ở dạng cấp tính, cá chết với tỷ lệ
chết cao chủ yếu xảy ra trong đêm nhưng biểu hiện rất ít dấu hiệu bệnh lý bên ngoài
(Bromage và Owen, 2002). Bệnh Streptococcosis tác động trên cá ở bất kỳ tuổi và
kích thước khác nhau, có thể xảy ra trong bất kỳ giai đoạn nào trong quá trình nuôi.
Bệnh lan truyền theo chiều ngang có thể xảy ra thông qua nguồn nước hay
thông qua thức ăn chứa mầm bệnh…Trong cảm nhiễm thực nghiệm, cá có thể bị
nhiễm bệnh thông qua phương pháp tiêm, ngâm, cho ăn hay sống với những sinh
vật mang mầm bệnh. Mang, da, hệ thống tiêu hóa, hệ thống khứu giác được xem là
những vị trí xâm nhập của S. iniae. Tuy nhiên, con đường xâm nhiễm, phát triển và
lây lan bệnh khác nhau tùy theo phương pháp cảm nhiễm và loài cá. Trên cá rô phi,
Pereral et al. (1997) cho rằng S. iniae có thể gây bệnh thông qua phương pháp ngâm
hay cho ăn. Nghiên cứu sâu hơn của Evans et al. (2000) trên đối tượng này đã cho
thấy mang và cơ quan khứu giác là hai vị trí xâm nhập vi khuẩn, vi khuẩn phát triển
rất nhanh sau khi xâm nhập, xuất hiện trong máu, não và thận sau 12h. Trên cá bơn
Nhật Bản, mang là vị trí xâm nhiễm khi cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm, vi
khuẩn cũng xâm nhập qua ruột khi cho ăn thức ăn gây bệnh nhưng chỉ ở liều gây
nhiễm cao (Nguyen, 2000). Trên cá chẽm, Bromage và Owen (2002) tiến hành cảm
nhiễm bệnh bằng những phương pháp khác nhau, kết quả cho thấy cảm nhiễm bằng
phương pháp ngâm và cho ăn đều cho tỷ lệ chết cao, tuy nhiên ở phương pháp ngâm
bệnh xảy ra ở dạng cấp tính, phương pháp cho ăn gây bệnh ở dạng mãn tính. Cũng
trong thí nghiệm này, hai ông đã chứng minh được những vết thương trên da không
phải là vị trí xâm nhiễm của S. iniae trên cá chẽm, nhưng vị trí xâm nhiễm chủ yếu
chưa được xác định.
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 8
1.2.2 Bệnh do Streptococcus iniea gây ra trên cá chẽm.
Bệnh do S. iniae gây ra trên cá chẽm Lates calcarifer đã được thông báo xảy
ra từ rất sớm vào giữa những năm 1980: Singapore là quốc gia đầu tiên báo cáo sự

xuất hiện bệnh trên cá chẽm, bệnh được thông báo đồng thời với dịch bệnh nghiêm
trọng do vi khuẩn này gây ra trên cá dìa (Singanus canaliculatus), mặc dù dịch bệnh
gây chết lên đến 100% trên cá dìa nhưng trên cá chẽm tỷ lệ chết lại rất thấp (Foo et
al.1985) [10]. Trung Quốc là quốc gia thứ hai thông báo bệnh Streptococcosis trên
cá chẽm với tỷ lệ chết từ 16.7- 32.6%, tuy nhiên chưa xác định được loài
Streptococcus gây bệnh (Huang et al, 1990) [10]. Ở Australia, từ năm 1992,
Streptococcus iniae đã gây bệnh vào mỗi hè với thiệt hại khoảng 8-15% sản lượng
cá chẽm nuôi lồng trên biển hàng năm, thậm chí thiệt hại có thể lên 70% khi bệnh
bùng phát dữ dội (Bromage et al. 1999). Kết quả thử nghiệm cảm nhiễm chủng S.
iniae ở cá chẽm cho thấy tỉ lệ tử vong cao với tỷ lệ chết tích lũy lớn hơn 75%
(Bromage et al. 1999). Vào năm 2003 và 2004, S. iniae cũng đã được thông báo gây
tác động nghiêm trọng đến nghề nuôi cá chẽm ở khu vực phía Nam Thái Lan
(Suanyuk et al. 2010). Ngoài ra còn có các báo cáo về bệnh xảy ra trên cá chẽm ở
Port Hurt, đảo Bathhurst (2005) với những dấu hiệu đặc trưng như đã nêu trên [3].
Ở Việt Nam, bệnh cũng đã xuất hiện với thông báo của Hich và Duzng (2011) về
phân lập được vi khuẩn này trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa.
1.3. Vaccine
Ngành nuôi trồng thủy sản thế giới ngày càng phát triển, với sự tác động của
con người cùng hàng loạt mô hình nuôi thâm canh và siêu thâm canh ra đời đã làm
tăng hiệu suất trong nuôi trồng thủy sản, tuy nhiên một hệ quả kéo theo là sự mất
cân bằng sinh thái, dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều hơn đã gây tổn thất không nhỏ
cho người nuôi. Việc sử dụng kháng sinh để kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn - một
trong những nguyên nhân gây thiệt hại nặng nề cho nghề nuôi trồng thủy sản, là một
phương pháp truyền thống, tuy nhiên bên cạnh hiệu quả chữa trị thì việc dùng
kháng sinh còn kéo theo những mối nguy hại trực tiếp cho môi trường và cho sức
khỏe con người khi hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn càng gia tăng. Trong bối
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 9

cảnh đó, sử dụng vaccine được xem là một giải pháp tối ưu cho sự phát triển nghề
nuôi trồng thủy sản bởi vì đây là một phương pháp hiệu quả để kiểm soát nhiều
bệnh nguy hiểm. Mặt khác, mục tiêu chính của dùng vaccine là để ngăn ngừa bệnh,
trong khi dùng kháng sinh là để trị bệnh.Vì thế khi dùng vacxin có thể giảm thiểu
việc sử dụng thuốc kháng sinh trong qua trình nuôi, tăng năng suất nuôi và đảm bảo
vệ sinh an toàn thực phẩm, từ đó góp phần vào việc tạo ra các sản phẩm đạt tiêu
chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm.
Nguyên lý sản xuất và sử dụng vaccine là đưa vào cơ thể cá kháng nguyên có
nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật có cấu trúc kháng nguyên gần
giống với vi sinh vật gây bệnh, đã được bào chế đảm bảo độ an toàn cần thiết để
kích thích sự đáp ứng của hệ miễn dịch đặc hiệu của cá chống lại tác nhân gây bệnh
và bảo vệ cơ thể [4]. Theo nguyên lý trên, có các loại vaccine gồm: Vaccine bất
hoạt, vaccine nhược độc (vaccine sống), vaccine tiểu phần và DNA vaccine được
dẫn truyền thông qua 3 đường: tiêm, dẫn truyền qua da, dẫn truyền qua miệng. Mỗi
loại vaccine và mỗi cách dẫn truyền đều có những lợi, bất lợi nhất định về hiệu quả
bảo vệ, các tác dụng phụ lên cá, chi phí thực hiện. Hiện tại, hầu hết vaccine dùng
trong nuôi trồng thủy sản là vaccine bất hoạt của một hay nhiều tác nhân, có thể bảo
vệ một hay nhiều bệnh, các vaccine này được dùng kết hợp với chất bổ trợ như nhũ
tương dầu, β(1,3/1,6)–glucan. Phương pháp tiêm là phương pháp hiệu quả cao,
được dùng rộng rãi, tuy nhiên phương pháp ngâm là phương pháp có thể được ưa
thích hơn trong tương lai.
1.3.1 Tình hình nghiên cứu phát triển vacxin ở cá trên thế giới
Vaccine phòng bệnh trong nuôi trồng thủy sản được bắt đầu nghiên cứu và
phát triển từ những năm 40 với thông báo đầu tiên về vacxin của Duf (1942) khi thử
nghiệm cho ăn vaccine bất hoạt Aeromonas salmonicida ở cá hồi Oncorhynchus
clarki. Sau đó, vào những năm 1970 là những nghiên cứu của Mỹ về vaccine nhược
độc dạng ngâm để bảo vệ đàn cá nuôi chống lại bệnh Vibriosis. Đến thập kỷ 80,
vaccine được nghiên cứu ở Na Uy khi ngành công nghiệp nuôi cá hồi nước này gặp
nhiều tổn thất lớn mà tác nhân gây bệnh chính là vi khuẩn Vibrio spp., sử dụng
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS

GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 10
vaccine đã cho kết quả tốt, lượng kháng sinh sử dụng đã giảm đi rất đáng kể. Sau
đó, một lọai vi khuẩn mới (Aeromonas salmonicida) lại xuất hiện, vaccine sử dụng
theo phương pháp ngâm không mang lại hiệu quả bảo vệ nên đến những năm 1990
vaccine sử dụng theo phương pháp tiêm kết hợp cùng chất bổ trợ ra đời. Vài năm
tiếp sau đó, nhiều loại chất bổ trợ cùng những kháng nguyên tái tổ hợp được tiến
hành thử nghiệm. Ngày nay, vaccine đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới, đặc biệt
ở các vùng nuôi cá hồi công nghiệp của các nước Bắc Âu, Chile, Canada, Mỹ, Nhật;
các trang trại nuôi cá da trơn ở Mỹ, mô hình nuôi cá chẽm, cá rô phi ở Châu Âu hay
các mô hình nuôi nhỏ ở Trung Quốc, Nga, Tây Ban Nha và Đức. Từ vaccine thương
mại được cấp phép đầu tiên ở cá là vaccine Yersinia ruckeri bất hoạt chống lại bệnh
viêm đỏ miệng được dẫn truyền bằng phương pháp ngâm trên cá hồi thì cho đến
tháng 7 năm 2005, đã có 35 loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn và 2 loại vaccine
phòng bệnh virut được đăng ký bản quền và sử dụng cho 6 đối tượng nuôi phổ biến
trên 41 quốc gia trên thế giới bao gồm cá hồi, cá chẽm châu Âu, cá chẽm châu Á, cá
rô phi, cá turbot, và cá bơn đuôi vàng (Klesius và Shoemaker, 2009) [4]. Bên cạnh
đó 5 loại vaccine phòng bệnh virus trên động vật thủy sản khác đang được nghiên
cứu và phát triển
1.3.2 Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá.
Những nghiên cứu kiểm soát bệnh Streptococcosis đã được thực hiện trong
suốt bốn thập kỷ kể từ khi bệnh được phát hiện đầu tiên trên cá, trong đó có
vaccine. Vaccine phòng bệnh Streptococcosis được nghiên cứu đầu tiên vào năm
1982, vaccine được dùng là vaccine bất hoạt formaline dẫn truyền bằng phương
pháp tiêm phòng bệnh do L. garvieae gây ra ở cá yellowtail. Vaccine này đã cho
hiệu quả bảo vệ cao với tỷ lệ sinh tồn tương đối RPS đạt 70% (Idia et al. 1982) [27].
Sau sự thành công này, các nghiên cứu vaccine phòng bệnh do L. garvieae trên một
số đối tượng Oncorhynchus mykiss, yellowtail Seriola spp. và vaccine phòng bệnh
do những loài Streptococcus khác tiếp tục được phát triển.

Vaccine đầu tiên phòng bệnh do S. iniae gây ra là vaccine bất hoạt formaline
trên trên cá hồi Oncorhynchus mykiss ở Israel, được dẫn truyền bằng phương pháp
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 11
tiêm xoang bụng (Bercovier et al. 1997; Eldar et al.1997). Vaccine này đã đem lại
kết quả thành công từ 1995 đến năm 1997 khi cá 50 g được chủng ngừa cho hiệu
quả bảo vệ hơn bốn tháng trong điều kiện thí nghiệm và ngoài thực nghiệm, với tỷ
lệ chết hàng năm gây ra bởi S. iniae đã giảm từ 50% đến ít hơn 5%. (Bercovier et
al. 1997). Tuy nhiên, một thời gian ngắn sau đó vaccine dường như không hiệu quả
khi bệnh Streptococcosis lại bùng nổ, nguyên nhân được xác định là do một dạng
khác của vi khuẩn này, với kết cấu vỏ khác và với vị trí xác định kháng nguyên
khác nhau (Bachrach et al. 2001).
Tiếp theo đó, vaccine phòng bệnh do S. iniae gây ra trên cá rô phi được phát
triển và đã cho hiệu quả bảo vệ cao. Đầu tiên là nghiên cứu của Bercovier et al.
(1997), ông thực hiện vaccin bất hoạt dẫn truyền bằng phương pháp tiêm xoang
bụng, hiệu quả bảo vệ cao với RPS đạt 80-90%. Sau nghiên cứu này, vaccine trên
cá rô phi được phát triển theo hướng mở rộng các phương pháp dẫn truyền và tăng
hiệu quả bảo vệ với vaccine được bổ sung thêm các chất kích thích miễn dịch.
Shoemaker et al. (2006) thông báo hiệu quả bảo vệ RPS đạt đến 100% khi sử dụng
vaccine bổ sung chất kích thích miễn dịch được dẫn truyền bằng phương pháp tiêm
xoang bụng, tuy nhiên khi dẫn truyền bằng phương pháp cho ăn hiệu quả chỉ đạt
63%. Đến năm 2011, sau đợt bùng phát bệnh do S. iniae gây ra ở cá rô phi Thái
Lan, Suanyuk và Itsaro cũng đã tiến hành nghiên cứu vaccine phòng bệnh trên đối
tượng này, kết quả cho thấy một tuần sau khi dẫn truyền vaccine, nghiệm thức dùng
vaccine bất hoạt formallin có bổ sung β(1,3/1,6)–glucan dẫn truyền bằng phương
pháp tiêm cho hiệu quả bao vệ cao nhất RPS đạt 95.12%; nghiệm thức chỉ dùng
vaccine bất hoạt dẫn truyền bằng phương pháp tiêm xoang bụng cho hiệu quả bảo
vệ đạt 80,49%; nghiệm thức dùng vaccine ngâm cho hiệu quả bảo vệ 41.46% và

nghiệm thức dẫn truyền vaccine bằng phương pháp cho ăn cho hiệu quả thấp chỉ
9,75%.
Trên cá chẽm, vaccine phòng bệnh S.iniae được nghiên cứu đầu tiên ở
Australia vào năm 2006 với các nghiên cứu của Creeper và Buller, Delamare-
Deboutteville et al. Kết quả khả quan về đáp ứng miễn dịch dịch thể trên đối tượng
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 12
này đã được thông báo khi dẫn truyền vaccine bất hoạt bằng phương pháp tiêm
xoang bụng với một lượng lớn kháng thể đặc hiệu được tìm thấy trong cả dịch nhầy
và huyết thanh sau 21 ngày, ở phương pháp ngâm đáp ứng miễn dịch dịch thể mạnh
mẽ được tìm thấy trong dịch nhầy (Delamare- Deboutteville et al. 2006). Tuy nhiên,
khi áp dụng vaccine ngoài thực nghiệm thì gặp một số hạn chế khi cá lại bị cảm
nhiễm bệnh sau vài tuần dẫn truyền vaccine (Agnew and Barnes, 2007).
Với hơn 25 năm phát triển vacxin chống Streptococcosis, đã có nhiều
nghiên cứu vaccine trên nhiều loài Streptococcus khác nhau và trên những loài cá
khác nhau như cá hồi Oncorhynchus mykiss (Bercovier et al. 1997; Eldar et al.
1997b), cá chẽm (Delamare-Deboutteville et al. 2006), cá rô phi (Bercovier et al.
1997; Shoemaker et al. 2006; Suanyuk và Itsaro, 20110), yellowtail (Idia et al.
1982; Ooyama et al. 1999) và cá bơn Nhật Bản (Shin et al. 2007b; Shutou et al.
2007) [27]. Một số vaccine thương mại đã được đưa ra thị trường như vaccine
phòng bệnh S. iniae dùng cho cá chẽm châu Á của Intervet, vacxin dùng cho cá rô
phi của Schering-Plough [27].
Tùy theo từng loài cá, loài vi khuẩn, loại vaccine, phương pháp dẫn truyền,
tuổi cá cũng như việc dùng các chất kích thích miễn dịch kèm theo mà có sự khác
nhau trong hiệu quả bảo vệ khi dùng vaccine phòng bệnh Streptococcosis. Khoảng
thời gian bảo vệ sau khi dẫn truyền có sự khác nhau trên một số loài cá : báo cáo
cho thấy trong khi vaccine phòng bệnh do L. garvieae và S. iniae gây ra cho hiệu
quả bảo vệ cao trong khoảng 3-6 tháng ở cá hồi O. mykiss khi chủng ngừa trong

điều kiện thí nghiệm (Bercovier et al. 1997; Eldar et al. 1997), thì cả vaccine ngăn
ngừa bệnh do L. garvieae và S. parauberis đều cho hiệu quả bảo vệ cao trong một
thời gian dài với cá yellowtail và cá bơn (Romalde et al. 2009). Bên cạnh đó, hầu
hết các vaccine phòng bệnh Streptococcosis đều cho hiệu quả cao trong bảo vệ khi
dẫn truyền bằng phương pháp tiêm xoang bụng, các phương pháp khác hiệu quả bảo
vệ không cao. Vì thế thời gian bảo vệ ngắn hay sự hạn chế trong phương pháp dẫn
truyền là một trong những lý do hạn chế sự phát triển và ứng dụng vaccine này.
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 13
Mặc dù, công nghệ vaccine ở cá mới ở giai đoạn đầu của sự phát triển,
nhưng những thành tựu mà nó đã đạt được là đáng chú ý kể cả trên lĩnh vực nghiên
cứu khoa học hay ứng dụng vào sản xuất sản phẩm thương mại. Khoa học phát triển
vaccine ở cá sẽ tiếp tục phát triển hoàn thiện hơn những sản phẩm vaccine. Vì vậy,
bên cạnh việc kết hợp giữa chủng ngừa vaccine và chọn lựa cá kháng bệnh để nâng
cao việc kiểm soát bệnh, thì các nghiên cứu sâu về vaccine như phát triển những
dạng vaccine hiệu quả (vaccine bổ sung các chất bổ trợ, vaccine tạo từ những kháng
nguyên tinh khiết) hay thiết kế những phương pháp dẫn truyền hiệu quả hơn là xu
hướng phát triển vaccine ở cá nói chung và vaccine phòng bệnh Streptococcosis
trên thế giới trong thời gian tới.
1.3.3 Tình hình nghiên cứu và triển vọng sử dụng vacxin ở Việt Nam
Trong bối cảnh nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam ngày càng phát triển,
dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản cũng ngày càng thường xuyên hơn và những
tổn thất kinh tế lớn do dịch bệnh gây ra, việc sản xuất và sử dụng vaccine để quản lý
dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản ở nước ta là điều cần thiết. Trong thời gian qua,
tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu, phát triển và ứng dụng vaccine
vào nuôi trồng thủy sản như đề tài sản xuất vaccine cuả Bộ Thủy Sản, đề tài sản
xuất vaccine bất hoạt phòng bệnh xuất huyết trên cá trắm cỏ, đề tài nghiên cứu tạo
vaccine phòng bệnh đốm trắng trên cá tra của Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản

II. Ngoài ra, một số công ty nước ngoài cũng đang nghiên cứu sản xuất và thử
nghiệm vaccine phòng bệnh cho cá tra, cá điêu hồng và cá giò…[4]. Vào năm 2011,
vaccine thương mại đầu tiên cho cá ở ViệtNam đã được phép thử nghiệm, đó là
vaccine ALPHA JECT Panga 1 trên cá tra của công ty Pharmaq. Trên cá chẽm,
cùng với các công trình nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất giống và nuôi
thương phẩm, các nghiên cứu về bệnh thì những nghiên cứu sâu về đặc điểm miễn
dịch với vi khuẩn S. iniae cũng đang được thực hiện để tiến tới phát triển vaccine
phòng bệnh do S. iniae gây ra trên đối tượng này.


Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 14
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu.
 Đối tượng nghiên cứu: Cá chẽm Lates calcarifer (Bloch, 1790).
 Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 20/2/2012 đến 02/06/2012.
 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu Giống và Dịch bệnh thủy sản,
trường Đại học Nha Trang.
2.2. Vật liệu nghiên cứu.
2.2.1. Môi trường.
- Môi trường tổng hợp bổ sung 2% NaCl: TSA (Tryptic Soy Agar), TSB
(TrypticSoy Broth), BA (Blood Agar) có bổ sung 5% máu cừu.
- Môi trường Nutrient Broth ở các nồng độ muối khác nhau: 0 ppt, 10 ppt,
30 ppt, 40 ppt, 50 ppt để kiểm tra khả năng chịu mặn của vi khuẩn.
- Môi trường Manitol để kiểm tra khả năng di động và lên men đường manitol
của vi khuẩn.
- Test API Strep để thử đặc điểm sinh hóa của các chủng liên cầu khuẩn.
2.2.2. Hóa chất.

2.2.2.1. Hóa chất sản xuất vaccine, xác định đặc điểm sinh hóa.
- Thuốc thử kèm theo API Strep test kit; H
2
O
2
để thử phản ứng Catalase.
- Giấy tẩm hóa chất Tetramethyl Phenylenediamine Edihydroclorid để thử
phản ứng Oxidase.
- Nước muối sinh lý, dầu soi kính, cồn tuyệt đối.
- Formalin 40% (w/v).
2.2.2.2. Hóa chất nhuộm mô hóa miễn dịch.
- Paraffin, dung dịch Buffered Formallin 10% (v/v).
- H
2
O
2
(30%); Metanol; Etanol; Xylen; Bom Canada.
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 15
- Dung dịch Phosphate buffered saline (PBS); dung dịch Tris Buffered Saline
(TBS); 3,3’-Diaminobenzidinetetrahydrochloride (DAB) ; Hematoxylin.
- Mabs; huyết thanh dê; kháng thể Ig G gắn với HRP.
2.2.3. Dụng cụ, thiết bị.
2.2.3.1. Nuôi cấy vi khuẩn, sản xuất vaccin và cắt mô.
- Tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy, nồi áp suất, kính hiển vi, bếp điện, máy ly tâm thể tích
lớn, máy cắt mô Microtone.
- Hộp lồng, que cấy đầu tròn, đầu nhọn, que cấy chan.
- Micropipette, đầu cồn.

- Đèn cồn, lam, lamen.
- Bông không thấm nước, etiket.
2.2.3.2. Xác định hiệu quả vaccin.
- 500 con cá chẽm giống cỡ 2-4 cm, nguồn gốc từ trung tâm Giống và Dịch
bệnh, trường Đại học Nha Trang.
- Bể 2m
3
, hệ thống cung cấp khí, vợt cá và một số dụng cụ khác.
2.3. Phương pháp nghiên cứu.
2.3.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu (Hình 2.1).
2.3.2. Kiểm tra một số đặc điểm sinh hóa của hai chủng Streptococcus iniae.
Vi khuẩn được dùng trong nghiên cứu này là hai chủng vi khuẩn
Streptococcus iniae ký hiệu Strep1, Strep2 được cung cấp từ dự án SRV2701.
Những chủng vi khuẩn này trước đó được phân lập từ cá chẽm bệnh ở Khánh Hòa
và lưu giữ trong TSB bổ sung 20% Glycerol ở -80
o
C.
Kiểm tra đặc điểm sinh hóa bằng API Strep kit và kết hợp kiểm tra bổ sung
một số đặc điểm sinh hóa bằng phương pháp truyền thống: Manitol di động,
catalase, oxidase, khả năng chịu đựng nồng độ muối.
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 16

Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
2.3.3 Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị vacxin Streptococcus iniae bất hoạt.
Để sản xuất vaccine, mỗi chủng vi khuẩn được nuôi cấy thuần trong môi
trường TSA bổ sung 2% NaCl ở 27
o
C trong 24h, tiến hành nuôi tăng sinh trong
Nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá
chẽm (Lates cacarifer) và đánh giá khả năng phòng bệnh của vacxin dẫn
truyền bằng phương pháp ngâm.
Nghiên cứu con đường xâm nhiễm
qua phương pháp mô hóa miễn dịch.
Đánh giá vacxin dẫn truyền bằng
phương pháp ngâm
Đánh giá tính an
toàn
Đánh giá hiệu

quả bảo vệ.
Kết luận
Tỷ lệ
chết do
dẫn
truyền
Đánh
giá tốc
độ sinh
trưởng
đặc
trưng.
Tỷ lệ
sinh tồn
tương
đối
RPS
(%).
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 17
2000 mL TSB bổ sung 2% NaCl ở 27
o
C trong 24h. Sau đó, dung dịch formalline
40% (w/v) được cho dung dịch vi khuẩn để đạt nồng độ 0.5% (v/v) và ủ trong 24h ở
27
o
C. Tiến hành ly tâm (400 x g ) trong 30 phút, rửa trong nước muối sinh lý 0.85%
và tạo dịch huyền phù. Mật độ vi khuẩn trong dung dịch huyền phù được đo bằng

phương pháp sắc ký ở bước sóng 550 nm với độ hấp thụ quang OD
550
= 2.9, tương
ứng với nồng độ 2.75 x 10
8
tế bào/mL.
Chủng Strep1 được dùng làm chủng vi khuẩn để xác định LD50 (%), cảm
nhiễm ngược và bố trí thí nghiệm xác định con đường xâm nhiễm. Vi khuẩn được
nuôi cấy tăng sinh trong TSB + 2% NaCl ở 27
o
C trong 24h và tiến hành ly tâm ở
(400 x g) trong 30 phút để thu được vi khuẩn sống. Vi khuẩn sau khi ly tâm sẽ được
rửa và tạo dịch huyền phù trong nước muối sinh lý. Tiến hành đo mật độ quang ở
bước sóng 550 nm để xác định mật độ vi khuẩn.
2.3.4. Phương pháp xác định con đường xâm nhiễm bằng phương pháp thực
nghiệm.









Hình 2.2: Sơ đồ quy trình nghiên cứu mô hóa miễn dịch.


Cá chẽm được
ngâm trong

S. iniae
10
7
CFU/mL
trong 60 phút.

Thu và cố
định mẫu.


Làm mất
nước và mềm
mẫu.



Thấm parafin
và đúc mẫu.


Cắt mẫu
bằng máy
Microtone.

Nhuộm mô
hóa miễn
dịch.

Gắn tiêu bản
bằng bom-

Canada.

Đọc tiêu bản
dưới kính
hiển vi quang
học.
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 18
2.3.4.1. Bố trí thí nghiệm và thu mẫu
30 cá chẽm kích cỡ 3 cm được ngâm trong dịch huyền phù có chứa vi khuẩn
Streptococcus iniae nồng độ10
7
CFU/mL trong 60 phút. Sau đó, đưa cá trở lại nuôi
trong nước biển 31-33 ppt, nhiệt độ ở 26-29
o
C và cho ăn thức ăn công nghiệp. Tiến
hành thu mẫu cá sau 6h, 12h, 24h, 48h, 72h và 96h; mỗi lần thu 3 con và cố định
trong dung dịch Buffered Formallin 10% trong 24h để cắt mô.
2.3.4.2. Xử lý mẫu.
Mẫu cá sau khi thu được cố định trong dung dịch Buffered Formallin 10%
(v/v) trong 24h, sau đó tiến hành xử lý, đổ paraffin, cắt lát và nhuộm mẫu.
Xử lý và đổ parafin: Áp dụng quy trình xử lý mẫu và đổ paraffin theo
phương pháp mô bệnh học được được mô tả trong tài liệu “Một số phương pháp
nghiên cứu và chẩn đoán bệnh ở động vật thủy sản” của Đỗ Thị Hòa 2005 (Tài liệu
lưu hành nội bộ). Sau khi xử lý, khối parafin được giữ lạnh trước khi được cắt bằng
máy Microtone, lát cắt có độ dày 3-7 µm và nhuộm theo quy trình mô hóa miễn
dịch.
2.3.4.3.Quy trình nhuộm mô hóa miễn dịch.

 Ngâm trong Xilen 2 lần, mỗi lần 5 phút.
 Ngâm trong cồn ethanol 100% trong 5 phút, trong cồn ethanol 70% trong 3
phút.
 Rửa bằng nước cất.
 Đặt lam trong buồng ẩm và giữ lát cắt luôn được ẩm ướt.
 Dùng bút dầu khoanh tròn khu vực lát cắt.
 Ủ lam với H
2
O
2
trong methanol trong 10 phút ở nhiệt độ > 22
o
C.
 Rửa lam 3 lần với TBS.
 Ủ với huyết thanh dê pha loãng với TBS 1/10 trong 10 phút ở > 22
o
C.
 Đổ huyết thanh dê ra ngoài và lau huyết thanh thừa bằng cách dùng khăn
giấy thấm ở góc lam.
Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS
GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung

Trang 19
 Đặt 50-100 µl Mabs đã được pha lên lát cắt và ủ 60 phút ở >22
o
C trong
buồn ẩm.
 Rửa lam 3 lần với TBS.
 Thêm kháng thể IgG liên kết HRP được pha loãng với TBS 1/50 trong 30
phút.

 Rửa lam 3 lần với TBS.
 Ủ lam 10 phút với dung dịch DAB.
 Ngâm lam trong nước máy.
 Nhuộm Haematoxylin trong 3-4 phút.
 Rửa trong nước máy trong 10 phút.
 Ngâm lam trong cồn 70 trong 3 phút, cồn 100 trong 5 phút.
 Ngâm trong Xylen 5 phút, lặp lại 2 lần.
 Dán lamen và để khô.
2.3.5. Phương pháp đánh giá hiệu quả vaccine.
2.3.5.1. Chuẩn bị cá thí nghiệm.
Vaccine được dẫn truyền bằng phương pháp ngâm, cá được dùng để dẫn
truyền là cá chẽm kích cỡ 2 cm.Thí nghiệm được chia làm 4 nghiệm thức, 2 lần lặp,
mỗi đơn vị thí nghiệm gồm 100 cá thể:
 Nghiệm thức 1: Cá được ngâm trong vaccine chủng Strep1 bất hoạt bằng
formaline 0.5% (v/v) trong 60 phút.
 Nghiệm thức 2: Cá được ngâm trong vaccine chủng Strep2 bất hoạt bằng
formaline 0.5% (v/v) trong 60 phút.
 Nghiệm thức 3: Cá được ngâm trong vaccine Strep Si theo chỉ dẫn sử
dụng của công ty Intervet.
 Nghiệm thức 4: Nghiệm thức đối chứng, cá không ngâm vaccine.
Cá sau khi được ngâm vaccine được đưa trở lại nuôi trong bể composite 1 m
3

có chứa 1 m
3
nước, sục khí liên tục 24/24h, cho ăn thức ăn công nghiệp 2 lần/ngày,
duy trì nhiệt độ nước từ 26-28
o
C, độ mặn 31 -33 ppt, định kỳ 5 ngày thay 5-10%
nước.