Bước đầu nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn cố định nitơ tự do clotridium trong đất trồng lạc xã nghi liên nghi lộc nghệ an

Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
Trờng đại học vinh
Khoa Sinh học



Phạm Thị Lê

bớc đầu nghiên cứu một số đặc điểm của vi
khuẩn cố định nitơ tự do lostridium
trong đất trồng lạc tại xà nghi liên
-nghi lộc nghệ an

Khoá luận tốt nghiệp
Chuyên Ngành: di truyền vi sinh

Vinh - 2007

Phần I: Đặt vấn đề

1

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
Nitơ hay còn gọi là đạm là một trong những nguyên tố đợc ngời ta quan
tâm nhiều nhất từ trớc tới nay. Nitơ chiếm khoảng 16%trong prôtêin. Nitơ còn là

một thành phần quan trọng của axit Nuclêic. Không có nitơ thì không có sự
sống. Nitơ có mặt trong chÊt diƯp lơc, trong nhiỊu lo¹i vitamin, nhiỊu lo¹i kích tố
và rất nhiều hoạt chất quan trọng khác.
Ngời ta nhËn thÊy r»ng muèn cã thu ho¹ch 12 t¹ h¹t trên mỗi hecta,cây
trồng cần lấy đi khỏi đất khoảng 30kg nitơ. Số lợng nitơ này nằm trong hạt và
trong rơm rạ hoặc trong thân lá. Hiệu suất sử dụng phân hóa học là vào khoảng
75%. Nh vậy có nghĩa là nếu chỉ dựa vào nguồn nitơ của phân hoá học thì muốn
có 5 tấn hạt chúng ta phải bón vào mỗi hecta khoảng 116,6kg nitơ (tơng đơng
với 833kg amôn sunphát) Số lợng nitơ này thật khó có thể thỏa mÃn ngay cả ở nớc có công nghiệp phân nitơ hóa học phát triển
Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, trong không khí có đến 78,16% là nitơ.
Ngời ta tính rằng bầu không khí xung quanh trái đất chứa 4x10 15tấn nitơ, khoảng
không khí bên trên mỗi km2 đất đai có khoảng 80.000 tấn nitơ. Số lợng nitơ này
để thoả mÃn nhu cầu về nitơ của cây trồng sống trên mảnh đất đó(với thu hoạch
20 tạ/ha)trong khoảng 80 triệu năm.
Trong thực tế cây trồng( cũng nh ngời và động vật) không có khả năng
đồng hoá trực tiếp nguồn nitơ lớn lao này. Sở dĩ nh vậy bởi vì trong không khí,
phân tử nitơ tồn tại ở trạng thái liên kết 2 nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ 3 dây
nối rất bền vững(N=N). [3]
Trên toàn trái đất hằng năm cây trồng sử dụng khoảng 100-110 triệu tấn
nitơ, trong khi đó phân đạm hoá học của tất cả các nớc trên thế giới chỉ bổ sung
đợc khoảng 30% số lợng nitơ bị lấy đi.
Trong khi con ngời muốn phá vỡ 3 liên kết trong phân tử nitơ (N=N)để dễ
tạo ra các loại phân hoá học, cần phải sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất phức
tạp: nhiệt độ cao(6000 C ), áp suất cao(1000atm), chất xúc tác đắt tiền(Os,Ru) thì
2

==========================================================
Phạm Thị Lª

Kho¸ ln tèt nghiƯp
==========================================================
cã mét sè vi sinh vËt cã khả năng đồng hoá dễ dàng và thờng xuyên nitơ của
không khí ở điêù kiện bình thờng , ngời ta gọi chúng là các vi sinh vật cố định
nitơ.[2]
Vi sinh vật cố định nitơ gồm có nhiều loài vi sinh vật sống tự do trong đất
và trong nớc. Các loài thc c¸c gièng Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas
,Bacillus, Azotobacter,vi khn dinh dìng quang năng, vi khuẩn sinh
mêtan....Trong số những

vi sinh vật sống t do ở đất thì Azotobacter

,Clostridium là những vi khuẩn có khả năng cố định nitơ cao nhất.Khả năng cố
đinh nitơ tự do còn có ở vi khuẩn nốt sần(Rhizobium) sống cộng sinh trong rễ
các cây họ đậu. Tuy nhiên ở loài sống cộng sinh thì chúng có tính chọn lọc mỗi
loại vi khuẩn nốt sần chỉ xâm nhiễm lên một loài cây nhất định và chúng chỉ cố
định đợc nitơ khi ở trong nốt sần. đối với vi sinh vật sống tự do ngoài khả năng
cố định nitơ tự do trong không khí cho đất cho cây còn có ứng dụng lớn lao
trong sản xuất phân bón vi sinh.
Ngời ta đà dành những cố gắng rất lớn một mặt đi sâu nghiên cứu về đặc
điểm sinh học của các nhóm vi sinh vật cố định nitơ và tìm cách phát huy cao
nhất tác dụng lớn lao này của chúng, mặt khác tìm cách khám phá ra các bí mật
của cơ chế cố định nitơ sinh học với hy vọng sẽ từng bớc dẫn đến những cải tiến
quan trọng trong ngành công nghiệp sản xuất các loại phân nitơ hoá học.[3]
Trong điều kiện nớc ta hiện nay, việc nghiên cứu các đặc điểm sinh học
của vi khuẩn cố định nitơ tự do có ý nghĩa rất lớn nhằm để phát huy hết khả năng
cố định nitơ của chúng, từ đó ứng dụng trong công nghiệp sản xuất trong phân
bón vi sinh.
Trong chiến lợc phát triển kinh tế những năm gần đây, nhà nớc đà chú
trọng phát triển những cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao trong đó

3

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
có cây lạc.ở Nghệ An, cây lạc là một trong những cây có giá trị kinh tế đà đợc
tỉnh quan tâm đầu t và phát triển.
Từ những lý do trên và với khuôn khổ của một đề tài tốt nghiệp cử nhân
sinh học mà chúng tôi đi vào tìm hiểu khả năng cố định nitơ tự do của vi khuẩn
kị khí Clostridium trong đất trồng lạc xà Nghi Liên- Nghi Lộc-Nghệ An.
Mục tiêu đề tài
1.Tìm ra các chủng Clostridium có khả năng cố định nitơ tự do
2.Chọn một chủng có khả năng cố định nitơ tự do lớn nhất để nghiên cứu
đặc điểm hình thái và các yếu tố ảnh hởng đến sinh trởng:nhiệt độ, độ ẩm, pH,
tìm ra các trị số tối u để chủng đó sinh trởng và phát triển tốt .
3.Rèn luyện cho bản thân một số kĩ năng thực hành, thí nghiệm, phơng
pháp nghiên cứu khoa học.

4

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================

Phần II: Tổng luận
I. Sự phân bố cđa vi sinh vËt trong ®Êt:

Khu hƯ vi sinh vËt đất rất phức tạp, có những đặc điểm sinh lý và sinh thái
rất khác nhau. Riêng vi khuẩn đà rất phong phó. Chóng bao gåm vi khn h¸o
khÝ, vi khn kÞ khÝ, vi khn tù dìng, vi khn dinh dìng cacbon, vi khuẩn cố
định đạm...Vi sinh vật sống thành quần thể, giữa loài này và loài khác có tác
động qua lại lẫn nhau, chúng là tác nhân chủ yếu của quá trình chuyển hoá vật
chất trong đất.
Vi sinh vật có mặt trong tất cả các loài vật nhng ở chân đất có đầy đủ chất
dinh dỡng, kết cấu và thành phần cơ giới tốt, có độ ẩm và phản ứng môi trờng
thích hợp thì ở đấy vi sinh vật phát triển nhiều và phong phú về thành phần. Trên
những chân đất khô hạn, lầy thụt thì sự phát triển vi sinh vật bị hạn chế rõ rệt và
tạo thành một khu hệ vi sinh vật đặc biệt: khu hệ vi sinh vËt chÞu chua, khu hƯ vi
sinh vËt kÞ khÝ và vi hiếu khí, khu hệ vi sinh vật phát triển trong môi trờng nhiều
H2, CH4...
Đất trồng lúa nớc vi sinh vật kị khí chiếm u thế. Các loài vi khuẩn sống tự
do, có khả năng cố định đạm nh : Azotobacter , Clostridium pasteurianum cã
nhiỊu trong ®Êt lóa. Hai loại này có đặc điểm khác nhau :Azotobacter đòi hỏi có
ô xi phân tử, có phản ứng với môi trờng trung tính, có đầy đủ lân, Ca, Mg và chất
hữu cơ. Vì vậy trong đất lúa có nhiều vùng không tìm thấy Azotobacter còn vi
khuẩn kị khí Clostridium pasteurianum phân bố nhiều trong đất lúa, số lợng của
chúng có nhiều trong mỗi gam đất, Chúng đà góp phần tích cực làm giàu đạm
cho đất lúa.
ở đất chuyên trồng màu hoặc luân canh 1 vụ lúa, 1 vụ màu có điều kiện
thông khí tốt, vi sinh vật háo khí phát triển mạnh.
5

==========================================================

Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
Quần thể vi sinh vật đất thờng tập trung nhiều ở đất canh tác, nơi tập trung
nhiều rễ cây đợc bố sung nhờ chất dinh dỡng và có chế độ nhiệt , chế độ không
khí thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Các loài vi sinh vật háo khí giảm xuống
theo chiều sâu tầng đất, còn vi khuẩn kị khí phát triển mạnh ở tầng đất sâu 4060cm và trong điều kiện đất thoát nớc mạnh, giµu chÊt dinh dìng.
Thêi tiÕt khÝ hËu cịng chi phèi mạnh mẽ đến quần thể vi sinh vật đất.
Những tháng nóng ẩm có ma rào, ma phùn, cây cối phát triển tốt chính là thời
gian vi sinh vật phát triển mạnh mẽ.
Vi sinh vật đất đặc biệt là vi sinh vËt vïng rƠ cã mèi quan hƯ mËt thiÕt víi
c©y trồng. Thời kì cây ra hoa, bộ rễ hoạt động mạnh tiết ra nhiều chất dinh dỡng
có tác dụng kích thích vi sinh vật phát triển. Vi khuẩn kị khí có khuynh hớng
phân bố xa vùng rễ.
Điều kiện địa hình , khu vực địa lý cũng ảnh hởng không nhỏ ®èi víi vi
sinh vËt ®Êt. Khi ®iỊu kiƯn sinh th¸i thích hợp với cây trồng thì cũng thích hợp
với sự phát triển vi sinh vật đất. Sự tác động của con ngời thông qua việc khai
phá đất đai, thâm canh tăng năng suất cây trồng làm chi phối rất mạnh mẽ tới
khu hệ vi sinh vật đất. Việc cày bừa, xới xáo đất, bón phân làm ải, tới tiêu hợp lý
đà xúc tiến mạnh mẽ sự phát triển của vi sinh vật đất, làm tăng độ phì nhiêu của
đất và tăng năng suất cây trồng.[2]
II. Sơ lợc về vi khuẩn Clostridium

Năm 1893 lần đầu tiên X.N.Vinogradxki phát hiện đợc một loại vi khuẩn
kị khí sống tự do có khả năng cố định nitơ phân tử, đó là Clostridium
pasteurianum.
Tế bào của Clostridium pasteurianum có kích thớc khoảng 2,5-7,5x0,71,3 à có thể đứng riêng rẽ, xếp thành đôi hay xếp thành chuỗi ngắn. Khi còn non
có tế bào chất đồng đều, có khả năng di động. Khi già, tế bào chất có cấu tạo hạt,

tế bào mất khả năng di động. Bào tử thờng có hình bầu dục hay hình kéo dài
6

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
nằm ở giữa hay gần một đầu của tế bào. Bào tử có kích thớc lớn hơn bề rộng của
tế bào dinh dỡng, do đó khi mang bào tử tế bào thờng có hình con thoi. Kích thớc của bào tử khoảng 1,3à.x1,6.à.
Hiên nay ngoài loài Clostridium pasteurianum ngời ta còn nhận thấynhiều
loài Clostridium khác cũng có khả năng cố định nitơ phân tử. đó là các loµi:
C.butyricum, C. butylicum, C. beijerinckia, C ..aceticum, C .multifermentans, C.
Acetobutylicum, C. felsineum, C. kluyveri, C. lactoacetafilum, C.madisonii. Sù
kh¸c nhau vỊ các đặc điểm hình thái và sinh lý giữa các loài này có thể đợc thấy
rõ trong khoá phân loại của Bergey(1965).
Vi khuẩn thuộc loài Clostridium pasteurianum thờng có hoạt tính cố
định cao hơn các loài Clostridium khác. Khi đồng hoá hết 1g thức ăn các bon,
chúng thờng tích luỹ đợc khoảng 5-10mg nitơ. Khả năng cố định nitơ của các
loài trong chi Clostridium còn phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy.
Clostridium có khả năng đồng hoá các monosaccarit, disaccarit vµ mét sè
polisaccarit(nh tinh bét, dextrin). Chóng cã thể đồng hoá cả nhiều rợu bậc cao và
một số hợp chất chứa các bon khác nữa. Khi lên men hidratcacbon, Clostridium
thờng làm tích luỹ axit hữu cơ butanol, etanol, axeton, CO2, H2......Thành phần và
tỷ lệ của các sản phẩm lên men phụ thuộc vào từng loại vi khuẩn cũng nh phụ
thuộc vào hai pha khác nhau của quá trình lên men. Chẳng hạn Clostridium
axetobutylicum thờng làm tích luỹ trong pha đầu axit axetic, axitbutiric và trong
pha sau butanol, axeton và etanol.
Clostridium pasteurianum cũng nh nhiều loài Clostridium có khả năng

cố đinh nitơ khác có thể phát triển đợc trong phạm vi pH khá rộng (pH =4,7-8,5).
Tuỳ từng nghiên cứu mà pH thích hợp nhất đối với sự phát triển của Clostridium
là 5,9-8,3,hay 6,9-7,3. Các nghiên cứu ở Việt Nam cho biết ngay cả những vùng
đất chua, khi không tìm thấy sự phát triển của Azotobacter thì Clostridium vẫn
có mặt với số lợng đáng kể. Nói chung trên mỗi gam đất trồng lúa, trên miền bắc
7

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
nớc ta, số lợng vi khuẩn nhóm này có từ hàng vạn đến từ hàng triệu tế bào. Số lợng của chúng trong vùng rễ cây trồng bao giờ cũng nhiều hơn ngoài vùng rễ.
Clostridium thờng tập trung nhiều trong lớp đất cày nhng ngay ở độ sâu 75cm
vẫn có thể thấy có hàng ngàn tế bào trong mỗi gam đất (Nguyễn Lân Dũng,
1960, 1969).
Bào tử của Clostridium có sức đề kháng rất cao đối với nhiệt độ cao và sự
khô hạn. Một số nghiên cứu cho biÕt bµo tư cđa loµi vi khn nµy cã thĨ sống đợc đến 5 giờ ở nhiệt độ 750C và mét giê ë nhiƯt ®é 800C .Bao tư cđa mét số
chủng Clostridium chịu nhiệt ngay ở nhiệt độ 1000 C vẫn có thể sống đợc
30phút.
Các loài Clostridium hiện diện trong đất ,một số loài trong nhóm này còn
gây bệnh cho ngời và động vật, một số loại khác gây h hỏng thực phẩm khử
sunphur tạo nên màu đen và gây mùi khó chịu Các loài gây ngộ độc thực phẩm
quan trọng là C. botulinum và C. perfringens.[14]
III. Vòng tuần hoàn Nitơ trong tự nhiên

Cây không đồng hoá trực tiếp nitơ hữu cơ. Trong thực tế cây trồng có thể
nhận đợc một nguồn nitơ lớn nhờ quá trình phân giải của vi sinh vật đối với các
chất hữu cơ có mặt trong đất hoặc đa vào đất (phân rác, phân xanh, phân chuồng).

Quá trình này gọi là quá trình a môn hoá hoặc quá trình thối rữa.
Nếu đất bị ngập nớc và không đủ ôxi thì muối amôn đợc tạo thành sẽ tích
luỹ lại trong đất, nhng nếu trong đất có đầy đủ ôxi thì NH3 sẽ đợc oxi hoá thành
nitrit rồi tiếp đó sẽ ôxi hoá thành nitrat (Quá trình nitrat hoá) Nitrat là một trong
những dạng hợp chất nitơ đợc cây trồng hấp thụ một cách dễ dàng.
Ngợc lại với quá trình nitrat hoá là quá trình phản nitrat hoá, tức là quá
trình khử nitrat thành nitơ phân tử. Bên cạnh quá trình phản nitrat hoá do vi sinh
vật còn có một quá trình phản nitrat hoá hoàn toàn hoá học (Phản ứng giữa
8

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
HNO2với axit amin hoặc amit). Sau quá trình phản nitrat hoá, nitrat sẽ chuyển
thành nitơ phân tử bay vào không khí.
Những tổn thất về nitơ do quá trình phản nitrat hoá gây nên đợc bù đắp lại
nhờ một quá trình sinh học đặc biệt gọi là quá trình cố định nitơ, tức là quá trình
chuyển hoá nitơ phân tử thành các hợp chất chứa nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả
năng thực hiện quá trình này đợc gọi là các vi sinh vật ccố định nitơ, chúng có tác
dụng làm giàu thêm nguồn dự trữ thức ăn nitơ trong đất.

_

_
n_ n

n2

Tự do trong không khí

Sự phân giải

Động vật và
thực vật

Protein của xác hữu cơ

Thực vật

n2o

Nấm và vi khuẩn phân
giải xác hữu cơ

Cây họ
đậu

Amon

nh3
Đồng hoá
amon hoá
Nitrit
-

no2
Khử nitrat

Nitri

-

Nitrat

3

no

no2
Nitrat hoá

Hình 1: Chu trình nitơ trong tự nhiên
IV. Cơ chế của quá trình cố định Nitơ phân tử

Trong công nghiệp sản xuất phân hoá học việc chuyển hoá N2 thành
các dạng hợp chất của nitơ (muối amôn, urê, nitrat) cần tiêu tốn nhiều năng lợng. Số năng lợng để tổng hợp một tấn NH3 tơng đơng với số năng lợng sinh
ra khi đốt cháy 5 tấn than đá. Trong khi đó các vi sinh vật cố định nitơ bằng
một cơ chế nào đó đà thờng xuyên chuyển hoá đợc N2 thành các hợp chất chứa
9

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
nitơ ngay trong điều kiện bình thờng về áp suất và nhiệt độ. Nếu khám phá ra

đợc cơ chế quá trình cố định nitơ ở vi sinh vật thì rõ ràng sẽ mở ra một triển
vọng hết sức to lớn đối với việc cải tiến toàn bộ quá trình sản xuất phân nitơ
hoá học.
Đa số nghiên cứu đều cho thấy rằng:Quá trình cố định nitơ sinh học là
một quá trình khử N2 thành NH3 dới tác dụng cđa men nitrogenaza sinh ra bëi
vi sinh vËt.
Nitrogenaza cã thĨ thu đợc từ dịch chiết vô bào lấy từ tế bào của các vi
sinh vật cố định nitơ .
Nitrogenaza là một hệ phức enzim. Chúng cấu tạo bởi 2 thành phần đó
là prôtêin có phân tử nhỏ.
Một thành phần gọi là prôtêin sắt còn gọi là nitrogenaza khử hay thành
phần II. Một thành phần khác gọi là prôtêin sắt-Molipden hay còn gọi là
thành phần I.
Thành phần II đợc nghiên cứu ở Clostridium pasteurianum gồm 2 tiểu
phần đồng nhất, mỗi tiểu phần có khối lơng 29.000, ở giữa có một trung tâm
chứa 4 nguyên tử Fe và 4 nguyên tử S không ổn định với axit. Thành phần
I(Mo-Fe prôtêin ) ở Clostridium pasteurianum phức tạp hơn có khối lợng
phân tử chung là 220.000 gồm 2 nguyên tử Mo, khoảng 30 nguyên tử Fe và
nhiều nguyên tử S không ổn định với axit. Chúng có cấu tạo bởi 4 tiểu phần
gồm 2 loại, mỗi loại có khối lợng phân tử là 50 và một loại có khối lợng phân
tử là 60.000 Dalton. Mỗi loại gồm hai tiểu phần.
Nitrogenaza không chỉ xúc tác việc khử N2 thành NH3 mà còn có thể
xúc tác việc khử CH3 CN, HCN, NH3,N2 O, C2H2...thành các sản phẩm tơng
ứng.
Phản ứng khử N2 dới sự xúc tác của nitrogenaza có thể biểu thị vắn tắt
nh sau:
10

==========================================================
Phạm Thị Lê

Kho¸ ln tèt nghiƯp
==========================================================
Nitrogenaza
N2 + 6e + 12ATP + 12 H2O

2NH4++ 12ADP + 12Pi + 4H+

Ngêi ta cho r»ng qu¸ trình khử này bao gồm nhiều phản ứng kế tiếp
nhau và sử dụng năng lợng của ATP.
2H+. ATP
N2

2H+.ATP
[NH = NH]

+2H. ATP
[NH2 -NH2]

2NH3

Sơ đồ giả thuyết về trung tâm hoạt động của nitrogenaza đợc trình bày
nh sau:
Electron của các chất khử (feredoxin, ditionit)đi vào trung tâm có chứa
Fe của thành phần en zim II(prôtêin -Fe)và tiếp tục chuyển cho thành phần en
zim I(prôtêin -Fe-Mo).Electron đà hoạt hoásẽ đi theo mạch nguyên tử Fe để
đến Mo ở bên trong "hạt. Tại đây Mo sẽ bị khử và nhờ đó có khả năng phẳn
ứng nhanh chóng với N2. Phân tử N2 đi qua một khe có kích thớc khoảng 4-5
Ao tức là tơng ứng với chiều dài của phân tử N2 vào bên trong men và đợc hoạt

hoá ở đấy.
Kết quả của quá trình Nitrogen hoạt hoá và hấp phụ hoá học Nitơ sẽ làm
dứt 2 dây nối trong số dây của phân tử N2. Năng lợng tiêu phí là 7,8x105J/mol.
Dây nối thứ 3 sẽ cắt đứt khi tiếp xúc với hidro đà đợc hoạt hoá nhờ các men
đehirogenaza và hệ thống hidrogenaza.
Sau đó NH3 hoặc các sản phẩm khử khác đợc sinh ra sẽ liên kết với các
ketoaxit để tạo thành axitamin [2].
Hiệu suất của quá trình cố định đạm ở loại kị khí cao hơn so với loại
hiếu khí. Khi sử dụng hết 1g thức ăn cacbon Clostridium pasteurianum thờng
chuyển hoá đợc một lợng N2 ít hơn Azotobacter khoảng 4- 7 lần . Trong khi
11

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
đó khi phân giải thức ăn cacbon Clostridium pasteurianum nhận đợc số năng
lợng ít hơn Azotobacter đến 45 lần. Nh vậy nếu tính theo một đơn vị năng lợng đà nhân đợc thì loại kị khí cố định đạm đợc nhiều hơn loại hiếu khí tới 610 lần. [6]
V. Sử dụng các vi sinh vật có khả năng cố định Nitơ
trong nông nghiệp.

Vi sinh vật cố định nitơ đóng vai trò rất quan trọng trong việc thực hiện
vòng tuần hoàn nitơ trong nông nghiệp.
Các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do(háo khí và kị khí) có khả năng làm
giàu thêm hàng năm khoảng 15-16kg nitơ cho mỗi ha đất đai(tơng đơng với
75-300kg đạm sun phát). Các loại tảo lam sống trong ruộng lúa cũng có khả
năng đem lại cho mỗi ha đất mỗi năm khoảng 15-80 kg nitơ. Một hecta trồng
cây bộ đạu mỗi năm có thể cố định từ 50-600kg nitơ. Để tăng khả năng cố

định nitơ của vi khuẩn nốt sần ngời ta đà tiến hành nuôi cấy vi khuẩn nốt sần
tạo ra chế phẩm Nitragin để bón vào đất hay tẩm hạt giống các cây thuộc bộ
đậu tơng ứng trớc khi gieo trồng, Nitragin có khả năng làm nâng cao năng suất
cây bộ đậu khoảng 10-15%. [2]
Chế phẩm Azotobacter còn gọi làAzotobacterin. Đối với các loại đất có
chứa nhiều chất hữu cơ, dễ hấp thụ Azotobacterin có thể làm tăng năng suất
khoảng 6-10% sản lợng cây trồng.Là loại phân có chứa vi sinh vật trực tiếp
hút nitơ của không khí chuyển hóa vào đất thông qua vi sinh vật tự dỡng háo
khí ,nghĩa là làm thức ăn cho chính vi sinh vật đó sau khi chết để lại chất dinh
dỡng hữu cơ ,đạm dễ tiêu cho đất . Vì vậy điều kiện để vi sinh vật này hoat
động là khá nghiêm ngặt :đất phải chua, lợng lân dễ tiêu,chất hữu cơ ,một số
nguyên tố vi lợng phải khá dồi dào. Kĩ thuật phổ biến vẫn thờng ngâm với hạt
giống trớc khi gieo .Tại Việt Nam cũng đà áp dụng thử phân Azotobacterin
nhng cha có hiệu quả rõ rệt.
12

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
ĐÃ có rất nhiều thí nghiệm sử dụng chế phẩm Clostridium
pasteurianum (dịch nuôi cấy hoặc dịch nuôi cấy trộn với đất đà khử trùng) để
bón cho cây trồng. Trong một số trờng hợp đà thu đợc những hiệu quả dơng
tính khá rõ rệt(nhất là khi phối hợp với Azotobacterin ). Tuy nhiên hiệu quả
nay thờng không ổn định và cho đến nay ngời ta vẫn cha giải thích đợc một
cách dứt khoát là trong trờng hợp có tác động dơng tính thì chủ yếu là do sự cố
định nitơ hoặc là do tích luỹ những chất có hoạt tính sinh học cao.[3]

13

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================

Phần III: Địa điểm, thời gian và phơng pháp
nghiên cứu
I. Địa điểm nghiên cứu:

Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trờng Đại học Vinh
II. Thời gian nghiên cứu:

Từ tháng 9 năm 2006 đến tháng 4 năm 2007
III. Phơng pháp nghiên cứu

3.1 Phơng pháp điều tra
Dùng phiếu điều tra để tra khảo tình hình sản xuất kết hợp vói phỏng vấn
các hộ đển hình về chế độ đầu t ,phân bón những nhận xét về đất trồng ,kỹ thuật
canh tác
3.2. Thu mÉu vi sinh vËt
Khi ph©n lËp vi sinh vËt từ đất hay tính số lợng vi sinh vật của đất thì
việc lấy mẫu đợc tiến hành nh sau:
Dùng dao vô trùng lấy 1 kg đất ở độ sâu 0-30cm thuộc 5 chỗ khác nhau
theo phơng pháp đờng chéo rồi trộn lại với nhau, lấy giấy bóng mờ đà khử
trùng để đựng đất, loại bỏ rễ cây và vật lạ. Ghi nhÃn, bảo quản và phân tích tại
phòng thí nghiệm.[10]

3.3. Phơng pháp phân lập vi sinh vật
Cân 1 kg đất đà đồng đều +10ml nước cất
(vô trùng)
Lắc 10-15 phút
Để lắng
Lấy 1ml+ 9ml nước cất (Pha loÃng
thập phân đến 10-4-10-5)
Lấy 0,1 ml ở các nồng độ pha loÃng
khác nhau cấy vào môi trường
14

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
Vi sinh vật đợc nuôi trong môi trờng Vinograxki gồm:
(NH4)2SO4 2g
NaCl

2g

K2HPO4

1g

FeSO4

0,1g

MgSO4

0,5g

CaCO3(MgCo3) 1g
Nớc :1l
Cân chính xác các thành phần
của môi trường
Hoà tan đun sôi
điều chỉnh pH
Cho vào bình tam giác
ống nghiệm, petri

Khử trùng ở 1atm
thời gian 30 phút
Bảo quản tủ lạnh

Dùng trang thuỷ tinh phân phối đều huyền phù vi sinh vật lên trên bề
mặt thạch. Sau đó đặt vào tủ ấm nuôi 30oC trong 3- 5 ngày. Khuẩn lạc xuất
hiện, theo dõi thờng xuyên. Chọn các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái khác
nhau đứng riêng rẽ. Dïng que cÊy lÊy mét Ýt vi sinh vËt ë khuẩn lạc vi sinh vật
đó cấy lên ống thạch nghiêng, đem nuôi ở nhiệt độ 30-350C
15

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp

==========================================================
Sau thời gian nuôi cấy cần kiểm tra lại độ thuần chủng của giống vi sinh
vật đà mäc trong tõng èng nghiÖm ,nÕu trong tõng èng nghiÖm mọc chủ yếu là
giống vi sinh vật cần tìm nhng có lẫn chút ít loại vi sinh vật khác thì có thể
dùng phơng pháp cấy rải nh sau :
Để thu đợc các khuẩn lạc riêng biệt đem que cấy vô trùng chạm nhẹ lên
môi trờng thạch nghiêng hoăc môi trờng lỏng ,cấy ríc rắc vuông góc lên
mặt thạch của hộp petri.Sau đó chọn khuẩn lạc mọc tốt của vi sinh vật cần tìm
đem cấy vào ống nghiệm chứa môi trờng lỏng .[7]
3.4. Phơng pháp theo dõi (theo dõi các chỉ tiêu sinh trởng và phát
triển)
3.4.1.Thời gian mọc của vi khuẩn
Sau khi cấy dịch huyền phù vào môi trờng thạch, theo dõi thờng xuyên sự
xuất hiện của khuẩn lạc cho đến khi không xuất hiện các khuẩn lạc mới. Vì mỗi
loài có có một tốc độ sinh trởng và phát triển không giống nhau.
3.4.2.Theo dõi sự sinh trởng:
Nuôi trong đĩa petri, ®o kÝch thíc (φ) cđa khn l¹c b»ng thíc ®o
palmer trong thêi gian 24 giê hc 48 giê hc 72 giờ.
Từ đó tốc độ sinh trởng theo Blachman(1981)
Wt-Wo
P=

x100%
Wo

Trong đó:

Wo là số đo lần đầu
Wt là số đo lần sau tại thời điểm t

3.4.3.Tìm hiểu các đặc điểm của các khuẩn lạc
Vi sinh vật phát triển trên môi trờng đặc sẽ hình thành các khẩn lạc đặc trng cho loài đó. Vì vậy việc miêu tả các khuẩn lạc là một trong các công việc rất
cần thiết đối với công tác định tên loài vi sinh vật nghiên cứu.
16

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
Tìm hiểu các đặc điểm của khuẩn lạc: Màu sắc, hình dáng, bề mặt, cấu trúc,
bờ khuẩn lạc.
3.4.4. Thử hoạt tính cố định nitơ của các chủng
+Thử định tính
Từ các chủng đà phân lập đợc, dùng que cÊy lÊy mét Ýt chđng cho vµo èng
nghiƯm chøa 2 ml nớc cất. Sau đó cho thuốc thử Nessle vào:
Xuất hiện màu vàng cam(dơng tính :+)
Không xuất hiện màu vàng cam(âm tính:-)
+Thử định lợng(amôn)
Từ các chủng có kết quả (+) ở trên. Dùng que cấy lấy một ít chủng đem
nuôi trong èng nghiƯm chøa 5ml m«i trêng Vinograxki láng. Sau khoảng 3-5
ngày đem đo trên máy quang phổ CELCIN của Mỹ:
Tìm ra đợc chủng có có hàm lợng NH+4 lớn nhất
-Pha dung dịch chuẩn NH4Cl 0,001 mg/ml
Cân 0,3820g NH4Cl pha trong 1l ta đợc 0,1mgN/ml
Lấy 50 ml dung dịch này pha trong 500ml ta đợc dung dịch 0,01mgN/ml
3.5. Xác định số lợng vi sinh vật theo phơng pháp CFU(colonyforming unit)
- Từ mẫu ban đầu sau đó pha loÃng theo dÃy thập phân
- Cấy vào môi trờng thạch đà vô trùng

- Nuôi ở 30Otrong 3- 5 ngày
- Xác định số lợng khuẩn lạc trên đĩa petri
- Tính số lợng tế bào theo công thức
N
A(CFU/g hay CFU/ml) =
n1Vf1+....+niVfi

17

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
Trong đó:

A: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g

hay 1 ml mẫu.
N: Tổng số khuẩn lạc đếm đợc trên các đĩa ®· chän
(25-250 khuÈn l¹c) theo FDA(Food and Drug Asministration )
ni: Số đĩa cấy tại độ pha loÃng thứ i
V: Thể tích dịch mẫu (ml)cấy vào trong mỗi đĩa
fi: Độ pha loÃng tơng ứng.[14]
3.6. Các yếu tố ảnh hởng đến sinh trởng
3.6.1. ảnh hởng của độ ẩm
Đất mới lấy về làm sạch bằng cách sấy khô.Dùng nớc cất vô đạm cho vào,
điều chỉnh độ ẩm
Xác định độ ẩm của đất bằng máy Humiditi/Thermometer.HANA. Hig

161C của Anh
Xác định hàm lợng NH+4 ở độ ẩm khác nhau trong các ngày khác nhau.
- Phơng pháp xác định NH+4theo Kjendahl Nessler và Sapiro-1972.[12]
Cân 10 g đất tơi +100ml KCl 0,1N cho voà bình tam giác 250ml dịch lọc vào
bình định 25 ml, thêm 1ml dung dịch Seignetle (Tactrat kép K-Na)50%
+1ml dung dịch Nessle định lợng trên vạch rồi so màu trên máy. Xác định
nồng độ C bằng cách so sánh với đồ thị nồng độ chuẩn.
- Tính kết quả:
CxVxV2 x K
NH (mg/100gđất) =

x 100%

+
4

WxV1
Trong đó:
V: Số ml dung dịch chiết rút(100ml)
V1: Thể tích đem so màu(5ml)
18

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
V2: Thể tích hiện màu(25ml)
W: Khối lợng đất cân:10g

C:Nồng độ so màu(mg/ml)
K: Hệ số khô kiệt
- Thang tiêu chuẩn:
Lấy 10 bình định mức 25 ml lần lợt cho vào các thể tích khác nhau dung
dịch NH4Cl 0,01mg/ml tiªu chuÈn 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16,ml.
Thêm vào mỗi bình 1ml dung dịch Seignetle +1ml Nessle định mức đến
vạch so màu.
Tiến hành so màu nh mẫu nghiên cứu.
3.6.2. ảnh hởng pH
Cho mỗi công thức thí nghiÖm mét Ýt vi sinh vËt nh nhau cïng mét môi trờng đà vô trùng, điều chỉnh pH ở các công thức khác nhau (pH=5, pH=6, pH=7,
pH=8, pH=9). Sau đó nuôi cùng một nhiệt độ là 300C.
Từ đó xác định hàm lợng NH+4 ở các công thức bằng phơng pháp so màu
với thuốc thử Nessle.
3.6.3. ảnh hởng nhiệt độ.
Để theo dõi ảnh hởng của nhiệt độ đến khả năng đồng hoá của nitơ ta cho
mỗi công thức thí nghiệm một ít vi sinh vật vào cùng một môi trờng. Sau đó đem
nuôi các điều kiện nhiệt độ khác nhau 200C, 300C, 400C, 500C.
Xác định NH+4 ở các công thức bằng phơng pháp so màu với thuốc thử
Nessle.
3.6.4. ảnh hởng thời gian đến khả năng đồng hoá Nitơ
Qua theo dõi pH,nhiệt ®é ,®é Èm ë c¸c thêi gian kh¸c nhau .Tõ ®ã rót ra
thêi gian tèt nhÊt cho sù cè ®Þnh nitơ
3.7. Phơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đợc xử theo phơng pháp toán học thống kê
19

==========================================================
Phạm Thị Lê

Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
-Xác định trung bình cộng:
1 n
X = Xi
n i=1
Trong đó: X: Trị số trung bình cộng
Xi: Giá trị thứ i của dÃy biến số
n: Số lần xuất hiện dÃy biến số
- Xác định độ lệch chuẩn
n

=
Trong đó:

( Xi X )

2

i =1

n

X : Giá trị trung bình
Xi : Giá trị từng phần
n

: Số lần thực hiện

20

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================

Phần IV: Kết quả nghiên cứu
Chơng I: Đặc điểm của vi khuẩn clostridium
I. Tình hình sản xuất ở địa phơng

1. Địa điểm:
Đất trồng lạc - xóm 17 - Nghi Liên - Nghi Lộc - Nghệ An
2. Loại đất:
Là đất trồng lạc truyền thống , kết hợp với luân canh lạc -ngô -vừng ,vụ
chính từ tháng 12- tháng 4 âm lịch .
Địa hình bằng phẳng ,đất cát pha gi÷ Èm kÐm ,pH trung tÝnh
3. DiƯn tÝch: 500m2
4. Kü thuật:
- Kỹ thuật làm đất: Làm 3 lần : Cày vỡ, cày trở, cày vọc, sau đó chia
luống, mỗi luống 1-1,5m
Bón phân:

Phân chuồng 3 -4tạ phân/sào
Phân NPK 15-20kg/sào. Tỷ lệ N:P:K là 10:8:5
Bón vôi: 20 - 30kg/sào

Rắc tung phân sau đó tiến hành xới xáo để trộn đều phân vào ®Êt
- Kü thuËt trØa l¹c: Gièng l¹c L14, l¹c Trung Quốc. Với kỹ thuật trồng lạc

phủ ni lông ,phun thuốc trừ cỏ
Mỗi mét chia 5 hàng, mỗi hàng cách 20 - 25cm, mỗi khóm(cây)cách 10 15cm.
- Kỹ thuật chăm sóc: Lạc khoảng 3 lá bón thêm đạm: 2kg/sào
Khi lạc 4-5 lá thì làm cỏ.
Khi lạc ra hoa bón thêm 4-5kg kali/sào, 2kg đạm/sào, làm sơ cỏ vun gốc
Khi lạc ra hoa nhiều phun chất kích thích và bón 10kg vôi/sào
5. Năng suất: Bình quân 1,5tạ/sào
21

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
II. Phân lập vi khuẩn Clostridium

1.Đặc điểm Clostridium.
Giống Clostridium là các vi khuẩn gram dơng, hình que, kị khí, sinh bào
tử phần lớn di động, có thể thuỷ giải sacchoride và prôtêin. Trong các hoạt động
thu nhận năng lợng, những loài thuỷ giải sacchoride có thể lên men loại đờng
polisacchoride tạo thành axetic acid, butiric và rợu. Nhiều loài có thể thuỷ giải
prôtêin và chuyển hoá không hoàn toàn các axit amin tạo thành mùi rất khó chịu
trong sản phẩm. Hầu hết giống Clostridium thuộc nhóm a nhiệt vừa, tuy nhiên
có một số loài thuộc nhóm a nhiệt và một số loài khác thuộc nhóm a lạnh.
[12].Có nhiều loài Clostridium đà đợc chứng minh là có khả năng cố định nitơ
phân tử. Trong đó loài có hoạt tính cố định nitơ cao nhất là Clostridium
pasteurianum. Tế bào Clostridium pasteurianum có kích thớc khoảng 0,71,3x2,5-7,5à. Chúng có thể đứng riêng, xếp thành đôi hay chuỗi ngắn. Khi còn
non chúng có chu mao và có khả năng di động, tế bào có cấu tạo đồng nhất. Khi
già tế bào có cấu tạo lổn nhổn(chứa các hạt dữ trữ loại tinh bột) . Tế bào mất khả

năng di động. Bào tử có kích thứơc 1,3x1,6à, thờng có hình bầu dục hay hình
kéo dài nằm ở giữa hoặc một đầu của tÕ bµo. Bµo tư cã kÝch thíc lín vµ réng hơn
tế bào dinh dỡng, do đó khi mang bào tử tế bào có hình con thoi. Khuẩn lạc
trắng, phẳng và sáng.[10].

H.2- vi sinh vât cố định ni tơ tự do thuộc giống

clostridium

22

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
Clostridium có thể đồng hoá các nguồn thức ăn nitơ vô cơ và hữu cơ. về
thức ăn cacbon, chúng có thể sử dụng nhiều loại hợp chất khác nhau. So với
Azotobacter chúng ít mẫn cảm hơn đối với K, P, Ca và có tính ổn định cao hơn
đối với pH thấp hoặc cao của môi trờng.
Clostridium phát triển thích hợp trong những đất có độ ẩm vào khoảng
60-80% so với độ ẩm tuyệt đối. Chúng phát triển tốt trong các lớp đất cày vì ở
trong đó có các chất hữu cơ phong phú.
Chỉ có loại Clostridium a ẩm mới có khả năng đồng cố định nitơ phân tử,
chúng tốt nhất ở nhiệt độ 25-300C.
2. Quy trình phân lập.
Để có các chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành phân lập theo quy trình sau:

Cân chính xác các thành phần của môi trờng

Đun sôi, điều chỉnh pH=7
Cho vào 1/3 bình tam giác
Cho vào petri
Cấy dịch đà pha loÃng ở các nồng độ khác nhau
Dùng trang thuỷ tinh trang đều
Nuôi ở tủ ấm 300C trong 5-7 ngày
(Khi có các khuẩn lạc)
Quan sát và chụp ảnh
23

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
3. Kết quả
Với phơng pháp đó theo dõi sau 48 giờ mỗi lần thời gian xuất hiện của
khuẩn lạc đợc trình bày ở bảng 1 nh sau:
Bảng 1.1: Số khuẩn lạc xuất hiện
Ngày cấy

13/10/2006

Số thí
nghiệm
1
2
3
4

5

Ngày và số khuẩn lạc (CFU)
14/10
16/10
18/10
20/10
108
289
342
297
93
246
364
285
11
105
181
120
18
162
223
167
10
76
112
94

Nhận xét :
Qua bảng 1.1 ta thấy: Sau thời gian 1 ngày các khuẩn lạc xuất hiện, số

khuẩn lạc tăng nhanh sau 5 ngày nuôi cấy. Sau đó số lợng giảm dần do một số
chủng bị chết đi. Nh vậy số khuẩn lạc đạt đợc nhiều nhất sau 5 ngày nuôi cấy
trên môi trờng thạch. Sau đó chọn các khuẩn lạc đứng riêng rẽ cấy ra các chủng
vào ống nghiệm chứa môi trờng thạch để có đợc các chủng thuần khiết.
ảnh 3: Chủng C1, C2 đà phân lập
Với các nhóm vi sinh vật thuộc nhóm kị khí thì sự có mặt ô xi phân tử là
có hại. Chúng không sinh trởng đợc trong môi trờng đặc hoặc bán đặc khi để
trong không khí hay không khí có chứa 10% CO2. Chúng chỉ sinh trởng đợc
trong những nơi không có ô xi, quá trình lên men, quá trình phôt phoril hoá
quang hợp quá trình mê tan.[3]
Để miêu tả vi sinh vật và để sau này định tên chúng, ta chỉ cần qua sát sự
sinh trởng của vi sinh vật cần nghiên cứu dọc theo dấu vết cấy chích sâu trên môi
trờng thạch đứng hoặc sau khi cấy vào môi trờng thạch lúc còn cha đông lại. Vi
sinh vật hiếu khí bắt buộc sinh trởng trên bề mặt và lớp trên cùng của môi trờng,
vi sinh vật vi hiếu khí sinh trởng cách bề mặt một chút.Vi sinh vật kị khí không
24

==========================================================
Phạm Thị Lê


Khoá luận tốt nghiệp
==========================================================
bắt buộc phát triển dọc theo chiều dày của môi trờng. Vi sinh vật kị khí bắt buộc
chỉ phát triển ở đáy của môi trờng[11]
ảnh 5: Các chủng phát triển trong môi trờng thạch sâu
II. Đặc điểm của khuẩn lạc.

Khi nuôi cấy trên môi trờng đặc có các khuẩn lạc đặc trng xuất hiện, các
đặc điểm khuẩn lạc đó nh sau:

Bảng 1.2: Đặc điểm của các khuẩn lạc
Đặc điểm
- Màu sắc

C1

Các khuẩn lạc
C3

C2

- Trắng đục

- Trắng, đục

-Hình dạng

- Trắng đục,
nhạt
- Tròn, đều, lồi - Tròn,đều,lồi

- Bờ khuẩn
lạc
- cấu trúc

- Mép bằng
phẳng
- Đồng nhất

- Tròn, đều,

lồi
- Mép hơi - Mép bằng
viền
phẳng
- Đồng nhất
- Đồng nhất

C4

C5

- Vàng

- Trắng đục nhạt

- Tròn, đều, lồi

- Mỏng, sát mặt
thạch
- Mép không bằng
phẳng
- Không đồng nhất

- Mép bằng
phẳng
- Đồng nhất

ảnh 2: khuẩn lạc chủng C1đà phân lập
ảnh 6: khuẩn lạc chủng C4 đà phân lập

Chơng II: Sinh trởng và hoạt tính cổ định nitơ của các
chủng
25

==========================================================
Phạm Thị Lê