nghiên cứu mối quan hệ loài của ốc cối (conus spp.) ở vùng biển nam trung bộ, việt nam dựa trên chỉ thị phân tử gen 16s của dna ty thể (16s mt dna)

i


LỜI CẢM ƠN

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Bộ môn Công
nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang. Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này tôi xin
bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đặng Thúy Bình và Ths. Nguyễn Thị
Hải Thanh, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, TP.
Nha Trang - Khánh Hòa đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực
hiện để hoàn thành đồ án.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban giám đốc và các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường,
Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được sử dụng trang thiết bị, hóa
chất và các dụng cụ thí nghiệm.
ThS. Trương Thị Thu Thủy, cán bộ tổ nghiên cứu Bộ môn Công nghệ sinh học
đã giúp đỡ tôi về kỹ thuật và thao tác.
Các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha
Trang đã cung cấp cho tôi những kiến thức nền tảng để hoàn thành đồ án tốt nghiệp
này.
Tập thể lớp 49CNSH và nhóm sinh viên Trường Đại học Nha Trang đã cùng tôi
thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ động viên của gia
đình, bạn bè, người thân, cảm ơn những ý kiến đóng góp và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Xin kính chúc mọi người sức khoẻ, hạnh phúc và thành công.
Nha Trang, tháng 7 năm 2011
Sinh viên thực hiện
Hoàng Thị Lý
ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
I.1. TỔNG QUAN VỀ ỐC CỐI (CONUS.SPP) 3
I.1.1. Phân loại 3
I.1.2. Hình thái 3
I.1.3. Phân bố 5
I.1.4. Đặc điểm sinh học, sinh sản 6
I.1.5. Chế độ dinh dưỡng và phương thức săn mồi 8
I.1.6. Độc tố ốc cối 10
I.1.7. Phân loại độc tố ốc cối conotoxin 14
I.2. TỔNG QUAN VỀ VÙNG NGHIÊN CỨU 16
I.2.1. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường đảo Cù Lao Chàm và
ven bờ Quảng Nam. 16
I.2.3. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường đảo Lý Sơn, Quảng
Ngãi 19
I.2.4. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường vùng ven biển
Sông Cầu, Phú Yên. 20
I.3. CÁC NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN. 23
I.3.1. Giới thiệu về ti thể 23
I.3.1.1. Cấu trúc ti thể 23
I.3.1.2. Chức năng ti thể 24
I.3.1.3. Giới thiệu về hệ gen ti thể 25
I.3.2. Ứng dụng chỉ thị ty thể trong phân loại và xây dựng hệ thống phát sinh
loài của ốc cối 27

I.3.3. Nghiên cứu di truyền ốc cối 28
I.3.3.1. Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa: 28
iii


I.3.3.2. Mối liên hệ giữa phát sinh loài và chế độ dinh dưỡng (Conus spp.) 30
I.3.3.3. Nghiên cứu cấu trúc hệ gen. 31
I.3.3.4. Nghiên cứu di truyền ốc cối ở Việt Nam 32
I.3.3.5. Nghiên cứu di truyền độc tố. 33
I.3.3.6. Nghiên cứu di truyền quần thể ốc cối và động vật thân mềm. 34
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 36
II.1. Đối tượng và địa điểm thu mẫu: 37
II.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: 38
II.4. Tách chiết DNA 39
II.4.1. Tách chiết DNA với bộ kít Wizard® SV Genomic DNA Purification
System 39
II.4.2. Chuẩn bị gel agarose 40
II.4.3. Điện di và đọc kết quả 41
II.5. Phản ứng PCR 41
II.5.1. Cơ sở lý thuyết: 41
II.5.2: Tiến hành thực nghiệm: 42
II.6. Giải trình tự gen 16S mtDNA thu được 43
II.6.1: Cơ sở lý thuyết. 43
II.6.2. Phương pháp tiến hành: 44
II.7. Phân tích đa dạng loài ốc cối. 44
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 48
III.1. KẾT QUẢ 49
III.1.1. Đặc điểm hình thái 49
III.1.2. Tách chiết DNA tổng số 51
III.1.2.1. Lựa chọn vị trí lấy mẫu mô tách chiết 51

III.1.2.2. Tách chiết DNA tổng số 52
III.1.3. Khuếch đại gen 16S mtDNA 53
III.1.4. So sánh trình tự gen 16S mtDNA. 53
III.1.5. Xây dựng cây phát sinh loài 57
III.2. THẢO LUẬN 61

III.2.1. Sự khác biệt về trình tự gen của các nhóm loài ốc cối trên cây phân
loại. 61
III.2.2. Mối quan hệ loài ốc cối dựa trên chỉ thị phân tử 16S mtDNA 62
III.2.2. Mối quan hệ giữa loài và chế độ dinh dưỡng. 65
iv


IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68
IV.1. KẾT LUẬN. 69
IV.2. KIẾN NGHỊ. 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO 72
A. CÁC TÀI LIỆU TRÍCH DẪN TRONG BÁO CÁO 72
B. TÀI LIỆU THAM KHẢO KHÔNG TRÍCH DẪN 76










v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein, rRNA và tRNA
26
Bảng 2.1: Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR 43
Bảng 2.2: Các thông số của quá trình phân tích các trình tự và mô hình tiến hóa
(best-fit models) được lựa chọn bởi phần mềm Modeltest 3.7, sử dụng tính năng
Akaike Information Criterion. 45
Bảng 2.3: Mã số các trình tự gen 16S và chế độ ăn của các loài ốc cối trong nghiên
cứu hiện tại và từ Genbank. (P: ăn cá; P+V: ăn cá và nhuyễn thể; P+V: ăn cá và
giun biển; V: ăn giun biển; M: ăn nhuyễn thể; U: chưa nghiên cứu (unknow)). 46
Bảng 3.1: So sánh tỷ lệ các trình tự giống nhau giữa các loài ốc cối thu thập được
ở vùng biển Nam Trung Bộ Việt Nam 56
Bảng 3.2: Các nhóm loài ốc cối trên cây phân loại từ các phương pháp MP, ML,
BI. Nhóm được phân loại dựa theo chế độ ăn (P: ăn cá, V: ăn giun; M: ăn nhuyễn
thể; U: chưa biết). 59






vi


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình thái ngoài của một số loài ốc cối 10
Hình 1.2. Cấu tạo bên ngoài của ốc cối 4

Hình 1.3: Khu vực phân bố của Conus.textile trên thế giới 6
Hình 1.4: Vòng đời của ốc cối 8
Hình 1.5: Phương thức săn mồi dạng móc câu 9
Hình 1.6: Conus purpurascens và phương thức săn mồi dạng móc câu 9
Hình 1.7: Phương thức săn mồi dạng lưới 10
Hình 1.8: Cấu tạo tuyến nọc độc của ốc cối 11
Hình 1.9: Cấu trúc răng kitin điển hình của ốc cối (Flankin và cs, 2007). 14
Hình 1.10: Bản đồ địa lý về sự phân bố các vùng biển Việt Nam 21
Hình 1.11: Cấu trúc ti thể 30
Hình 1.12. DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã
hóa protein 27
Hình 1.13: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile 32
Hình 2.1: Các địa điểm thu mẫu ốc cối Conus spp. (chữ đỏ). 37
Hình 2.2: Quy trình bố trí thí nghiệm. 38
Hình 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR. 42
Hình 3.1. Hình thái vỏ của các loài ốc cối phân bố ở biển Việt Nam 49
Hình 3.2: Ảnh minh họa vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA 51
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số của các mẫu ốc cối 52
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA. 53
vii


Hình 3.5: Cây phát sính loài dựa trên gen 16S mtDNA của ốc cối thu tại vùng biển
Nam Trung Bộ, Việt Nam 60

1


LỜI MỞ ĐẦU
Ốc cối là một trong những họ động vật thân mềm lớn (gồm khoảng 700 loài)
thuộc loài ăn thịt, có nọc độc, phân bố rộng rãi trên thế giới đặc biệt là ở vùng biển
nhiệt đới. Vỏ của các loài ốc cối có màu sắc và hoa văn đẹp nên thường được khai
thác để làm đồ trang sức, mỹ nghệ và các vật phẩm lưu niệm. Ngoài ra, ốc cối còn
là nguồn nguyên liệu sản xuất các loại thuốc chữa các cơn đau mạn tính, ung thư và
nhiều bệnh khác. Các nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng cho thấy độc tố ốc cối
(conotoxin) có hiệu quả giảm đau cao gấp 10.000 lần so với morphine mà không
gây nghiện hoặc các phản ứng phụ - điều khó tránh khỏi với tất cả các loại thuốc
giảm đau hiện nay (Olivera, 1990). Vì những lợi ích về kinh tế và y học đó mà tình
trạng khai thác bừa bãi các loài ốc cối ngày càng gia tăng. Bởi vậy, đòi hỏi các nhà
khoa học phải có các nghiên cứu để bảo tồn một cách hợp lý và đúng đắn nguồn tài
nguyên này. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về sự đa dạng loài của
ốc cối. Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về ốc cối mới chỉ dừng lại ở mức độ
thống kê và mô tả các đặc điểm hình thái giải phẫu. Hiện việc nghiên cứu về ốc cối
ở mức độ phân tử vẫn còn hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu và xây dựng phát sinh chủng

loại các loài ốc cối Việt Nam bằng các phương pháp sinh học phân tử là điều rất cần
thiết. Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “nghiên cứu mối quan hệ loài
của ốc cối (Conus spp.) ở vùng biển Nam Trung Bộ, Việt Nam dựa trên chỉ thị
phân tử gen 16S của DNA ty thể (16S mt DNA)”.
Mục tiêu của đề tài:
- Khảo sát và đánh giá đặc điểm di truyền của loài ốc cối (Conus spp.).
- Bước đầu khảo sát mối quan hệ tiến hóa giữa các loài ốc cối thu được ở Việt
Nam dựa trên phân tích giải trình tự gen 16S của DNA ti thể (Mitochondrial DNA).
Trên cơ sở đó tiến hành xây dựng cây phát sinh loài.



2










I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3


Hình
1.1: Hình thái ngoài c
ủa một số
loài

ốc cối.
(o)
I.1. TỔNG QUAN VỀ ỐC CỐI (CONUS.SPP)
I.1.1. Phân loại
Họ ốc cối Conidae thuộc liên họ Conoidea, bộ Sorbeoconcha, là một trong
những họ có số lượng loài lớn trong ngành động vật thân mềm. Cho đến nay, trên
thế giới người ta đã xác định được khoảng 700 loài, trong đó chủ yếu thuộc giống
Conus.
Hệ thống phân loại của ốc cối như sau:
Giới: Animalia
Ngành: Mollusca
Lớp: Gastropoda

Liên họ: Conoidea
Họ: Conidae
Phân họ: Coninae
Giống: Conus
(

I.1.2. Hình thái
Hiện nay, các nhà khoa học đã
xác định được khoảng 500-700 loài ốc
cối (Conus spp). Những loài này đều có
đặc điểm chung là có màu sắc sặc sỡ với
những hoa văn rất đẹp. Vỏ thuôn dài,
dày, bằng đá vôi, chắc, nặng, xoắn theo
chiều kim đồng hồ (hình thái ngoài của
các loài ốc cối được minh họa ở hình
1.1). Đầu có 1 xúc tu (râu), toàn thân liền
trong vỏ bao bọc bởi một lớp nhầy.
Thức ăn của chúng là các loài
giun biển, động vật thân mềm và các
4


loài cá nhỏ. Vì chúng chuyển động rất chậm nên khi bắt một số con mồi di chuyển
nhanh như cá chúng sử dụng độc tố để tấn công con mồi. Chúng tấn công con mồi
bằng việc bắn mũi tên nhỏ có chất độc vào con mồi. Do cấu tạo vỏ của chúng có kẽ
hở rộng nên chúng có thể thò vòi tiếp xúc với con mồi ở phạm vi khá rộng, dễ gây
nguy hiểm cho con mồi. Khi con vật phóng mũi tên (răng kitin) chích vào con mồi,
vòi thò ra và một bộ phận hình mũi tên đâm con mồi, rồi phóng chất độc vào. Nọc
độc là một hỗn hợp chứa nhiều loại phân tử protein độc, trong đó mỗi loại phân tử
chứa hàng trăm chất độc, khiến cho con mồi không thể kháng cự được.

Cấu tạo bên ngoài của ốc cối được chú thích (hình 1.2):

















Hình 1.2. Cấu tạo bên ngoài của ốc cối.
(
Cấu tạo bên ngoài của ốc cối gồm những bộ phân sau:
5


1) Vòi hút (Proboscis): Vòi hút là vũ khí săn mồi của ốc cối. Độc tố được tiêm vào
con mồi bằng các răng chứa trong túi răng chitin. Vòi hút có thể duỗi dài ra gấp 2
lần cơ thể ốc cối.
2) Súc tu (Siphon): siphon của ốc có chức năng như mũi. Đó là một túi có thể duỗi
dài ra và phát hiện con mồi trong môi trường nước xung quanh. Nó cũng góp phần
đưa nước đến mang giúp cho quá trình hô hấp.

3) Mắt (eye stalks): Ốc cối có 2 mắt, nằm ở 2 bên miệng. Hiện tại vẫn chưa biết
được về khả năng nhìn của ốc cối hay câu hỏi đặt ra là liệu có đủ ánh sáng ở các
vùng biển sâu hay không?
4) Miệng: Ốc cối có miệng có thể mở rộng ra phía trước để nuốt con mồi. Hệ thống
cơ có thể co duỗi để đưa miệng vào trong vỏ. .
5) Chân (foot): Chân có cấu tạo bằng cơ giúp ốc cối di chuyển trên các bề mặt
Operculum: vảy ốc.
I.1.3. Phân bố
Các loài ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng biển nhiệt đới và vùng biển ấm
như Philíppin, Indonesia, Australia, Mexico, Florida, Hawaii…Tuy nhiên, các
nghiên cứu cũng cho thấy một số loài có thể thích ứng với sự thay đổi của điều kiện
môi trường như ở vùng biển nóng mũi Cape, Nam Phi hay vùng biển lạnh phía Tây
Califonia, Hoa Kỳ. Hầu hết các loài ốc Conus nhiệt đới sống trong hoặc gần các rạn
san hô, trong khi các loài cận nhiệt đới được tìm thấy chủ yếu tại vùng dưới triều ở
độ sâu từ 10-30m và dưới các tảng đá ở vùng triều nông (Stewart và Gilly, 2005).
Giống ốc cối thường phân bố ở vùng vĩ độ giữa 40
0
Bắc và 40
0
Nam, chủ yếu
ở các vùng biển: Ấn Độ - Thái Bình Dương, Panamic, Caribbean, Peru, Patagonic,
Tây và Nam Phi và Địa Trung Hải (hình 1.3). Một số loài có thể phân bố ở vĩ độ
trên 40
0
như ở Nam Phi, Nam Australia, Nam Nhật Bản và biển Địa Trung Hải.
Nhìn chung, ốc cối xuất hiện ở hầu hết các vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới,
nhưng đa dạng loài chủ yếu tập trung ở vùng biển Ấn Độ Dương đến Tây Thái Bình
Dương. Chúng đạt đến mật độ tối đa là 40 cá thể/m
2
, nhưng thường có số lượng ít

phong phú hơn (Kohn và cs, 2001).
6












Hình 1.3: Khu vực phân bố của Conus textile trên thế giới (chấm vàng)
(
Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thuộc khu vực
Nam Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các hải đảo (như Trường Sa,
Hoàng Sa, Côn Đảo, )
I.1.4. Đặc điểm sinh học, sinh sản
 Tuổi thọ, kích cỡ và trọng lượng
Vòng đời của ốc cối kéo dài khoảng 10-15 năm trong tự nhiên cũng như
trong điều kiện nuôi nhốt, dựa vào chỉ tiêu sinh trưởng của vỏ. Chúng có thể đạt đến
kích cở chiều dài tối đa là 23 cm, nhưng hầu hết các loài đều có kích thước nhỏ
dưới 8cm và khối lượng dưới 100g (Röckel và cs, 1995).
 Tập tính sống.
Ốc cối thường sống đơn lẻ, nhưng một số loài được tìm thấy với số lượng
lớn ở một số khu vực riêng biệt.
Phần lớn các loài ốc cối săn mồi vào ban đêm. Mặc dù chúng có cuống mắt
nhưng tầm nhìn của chúng rất kém, và chúng được cho là sử dụng khả năng cảm

nhận hóa học để tìm kiếm con mồi. Mặc dù một số loài có thể thích nghi với vùng
nước lạnh, và một số loài, bao gồm các loài có vỏ lớn có thể tìm thấy ở độ sâu 
100m, ốc cối đa dạng nhất ở vùng nước nông nhiệt đới. Trên một triền san hô ở
7


trung tâm vùng biển Ấn Độ- Thái Bình Dương, hơn 30 loài ốc cối khác nhau đã
được tìm thấy (Kohn và cs, 2001).
Trong số khoảng 700 loài ốc cối tìm thấy, thì chỉ có Conus geographus là
loài duy nhất gây tử vong cho con người khi chạm phải (Conus gepgraphus xuất
hiện chủ yếu ở vùng biển Australia). Theo thống kê có khoảng một phần tư trường
hợp người bị tử vong khi bị ngộ độc do C. geographus, nhưng thực tế thì rất ít gặp
chúng trong tự nhiên (Fegan và Andresen, 1997). Và chỉ có khoảng 36 trường hợp
bị ngộ độc do loài trên trong báo cáo y học (Olivera, 2002). Triệu chứng khi bị ngộ
độc còn tùy thuộc vào từng loài ốc cối, có thể bị những vết thương rất nặng, hay tê
liệt lan rộng, đến tê liệt hoàn toàn cơ thể (McIntosh và Jones, 2001). Hầu hết các
loài giun biển hay nhuyễn thể đều vô hại với con người. Nhưng các loài ăn cá đều
gây tử vong cho động vật có xương sống (Olivera, 2002). Trong tự nhiên, các loài
ốc cối thường không hung dữ, chúng thường chỉ tấn công với mục đích tự vệ. Các
vụ tai nạn chủ yếu xãy ra ở vùng da cơ thể bị tổn thương khi tiếp xúc với ốc cối,
hoặc do dùng tay không có vật bảo hộ để bắt ốc cối.
 Đặc điểm sinh sản.
Sinh sản của ốc cối vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi, nhưng hầu hết các
loài này đều có sự phân chia giới tính và thụ tinh trong (hình 1.4). Trứng được đẻ
một lần trong năm. (Kohn, 1961). Mỗi trứng được bao bọc bởi nhiều nang trứng,
mỗi nang trứng lại chứa rất nhiều trứng khác nhau. Ấu trùng và con non của ốc cối
thường có 2 hình thức chính: Dạng ấu trùng Veliger (ấu trùng bơi lội tự do), và
dạng con non Veliconcha (có hình dáng gần giống cá thể trưởng thành). Thời kì đầu
của quá trình phát triển thường bị hạn chế, bởi số lượng ấu trùng bị hao hụt rất
nhiều. Do đó, trong quá trình ương nuôi ốc cối thường gặp nhiều khó khăn. Thời kì

ấu trùng sống ngoài khơi thường kéo dài khoảng từ 1 đến 50 ngày. Vòng đời của ốc
cối kéo dài khoảng 10 – 15 năm trong tự nhiên, cũng như trong điều kiện nuôi nhốt.


8












Hình 1.4: Vòng đời của ốc cối

I.1.5. Chế độ dinh dưỡng và phương thức săn mồi
Ốc cối là động vật ăn thịt (canivorous), chúng ăn mồi sống. Thức ăn chính
của chúng là các loài cá nhỏ (được gọi là piscivorous), giun biển (được gọi là
vermivorous), nhuyễn thể (được gọi là molluscivorous), và ngay cả các loài ốc cối
khác (Terlau và Olivera, 2004;Olivera và cs, 2002). Chúng có một cơ quan bắt mồi
chuyên biệt là dải răng kitin. Răng kitin của ốc cối hõm sâu và có gai, giống như
những cây lao thu nhỏ (chiều dài của răng thường khoảng vài mm, nhưng đôi khi có
thể lên tới 10mm). Khi ốc cối nhận ra đối tượng vòi của chúng kéo dài ra, và nhờ
lực co cơ những mũi tên từ ống vòi được phóng rất nhanh, kèm theo một lượng lớn
độc tố được phóng thích, làm tê liệt con mồi nhanh chóng. Sự tấn công này chỉ xảy
ra trong khoảng một phần nghìn giây. Chất độc sẽ làm tê liệt con mồi và gây tử

vong cho đối tượng trong thời gian rất ngắn. Độc tố ốc cối chứa đựng hàng trăm các
hợp chất khác nhau và khác biệt giữa các loài khác nhau. Các nhà khoa học cũng
chỉ ra rằng, độc tố ốc cối cũng thay đổi tùy theo khẩu phần ăn, tùy theo mùa, và tùy
theo từng vùng địa lí khác nhau.
Đối với loài ăn cá chúng có 2 phương thức săn mồi: săn mồi dạng móc câu (hook
and hunting) và săn mồi dạng lưới (net hunting).
- Săn mồi dạng móc câu: chúng phóng răng kitin có móc gai để giữ chặt đồng
thời tiêm chất độc vào con mồi, vòi hút được sử dụng như 1 cần câu cá (hình 1.5).
9


Ống siphon của chúng được xem là cái mũi để tìm kiếm con mồi xung quanh vùng
nước. Nếu phát hiện mồi chúng sẽ mở rộng vòi (vòi có thể mở rộng gấp đôi chiều
dài cơ thể) trong vòi có lao móc chứa nọc độc sẽ bắn vào cơ thể con mồi. Nọc độc
từ lao móc là hỗn hợp của nhiều chất độc khác nhau sẽ xâm nhập vào cơ thể và làm
tê liệt con mồi, ban đầu con mồi sẽ co giật mạnh vài giây sau đó bất động và cứng
đờ. Răng kitin có các gai móc buộc chặt con mồi vào vòi của nó, con mồi nhanh
chóng được cuốn vào miệng để ốc có thể ăn. Càc loài ốc săn mồi theo cách này cần
con mồi trở nên cứng đờ để có thể dễ dàng nuốt chúng.







Hình 1.5: Phương thức săn mồi dạng móc câu

Hình 1.6: Conus purpurascens và phương thức săn mồi dạng móc câu
( />1385-6-0)
b

a

c

d
10


Vòi của con ốc phóng vào cá một cây lao móc giống như răng, cái mà hõm
sâu và có gai ở phía đầu của vòi hút (1.6a). Sau khi tiêm nọc độc (1.6b) cá bị cố
định trong khoảng một vài giây (1.6c) và được nuốt bởi miệng của con ốc (1.6d)
(Terlau và cs, 1996).
- Săn mồi dạng lưới: Một hoặc nhiều con mồi bị bắt giữ thông qua vòi được
mở rộng như lưới sau đó tiêm chất độc vào chúng thông qua các gai móc để làm tê
liệt con mồi (hình 1.7). Một số loài có vòi hút ở ngoài giống như ngón tay làm con
mồi nhầm tưởng là hải quỳ. Phần miệng mở rộng trông giống như một cái bát san
hô hoặc nơi trú ẩn trên rạn san hô. Ở các loài săn mồi theo cách này độc tố của

chúng gây ra dạng tê liệt mềm, quá trính tiêu hóa con mồi sẽ kéo dài từ vài giờ đến
vài ngày.















Hình 1.7: Phương thức săn mồi dạng lưới.

I.1.6. Độc tố ốc cối
Ốc cối là động vật ăn thịt (canivorous), chúng ăn mồi sống. Thức ăn chính
của chúng là các loài cá nhỏ (piscivorous), giun biển (vermivorous), nhuyễn thể
(molluscivorous), và ngay cả các loài ốc cối khác ( Terlau và Olivera, 2004; Olivera
và cs, 2002). Do di chuyển chậm nên khi bắt một số con mồi di chuyển nhanh như
cá, chúng sử dụng độc tố để tấn công, làm tê liệt con mồi. Độc tố ốc cối (conotoxin)
11


là những đoạn peptide nhỏ dài 12 - 46 acid amin (aa), giàu liên kết disulfide (S-S).
Chúng được tiết ra từ cơ quan miệng có răng sừng dạng kim và một ống xoắn gắn

với một túi chứa dạng bầu có thể co bóp. Cơ quan đó chính là tuyến độc. Tuyến độc
tiết ra nọc độc giúp chúng bắt những con mồi xa dễ dàng bằng cách tấn công làm tê
liệt con mồi, mặt khác tuyến độc còn là vũ khí giúp chúng tự vệ cũng như tiêu diệt
kẻ thù.
 Cấu trúc tuyến nọc độc:
Tuyến nọc độc của ốc cối gồm các bộ phận : túi nọc độc, ống dẫn độc, vòi hút,
túi răng kitin (như miêu tả ở hình 1.8)
















Hình 1.8: Cấu tạo tuyến nọc độc của ốc cối
(theo Olivera, 1999, có bổ sung).

- Túi nọc độc: hình lưỡi liềm, màu trắng sữa, nằm vuông góc với trục của cơ
thể, lõm về phía đỉnh vỏ, lồi ra về phía ngược lại. Túi nọc độc là cơ quan lớn nhất
trong tuyến nọc độc, có chức năng tiết ra độc tố, đồng thời tạo ra áp lực khi bơm
độc tố vào con mồi.

- Ống dẫn độc: là đường dẫn chính trong tuyến nọc độc, có vai trò dẫn chất
độc từ túi nọc đi tới răng kitin để tiêm vào con mồi, có màu vàng nhạt, trong cơ thể
Ống dẫn
đ
ộc

Túi n
ọc
đ
ộc

Túi răng
kitin

Vòi hút
12


ốc nó cuộn thành bó nằm trong phần lõm của túi nọc độc nằm ở mặt phải và phía
sau của hầu.
- Vòi hút : là phần cuối cùng của tuyến nọc độc, rỗng phía trong, hình chóp
cụt, lớn hơn ở phần nối với hầu, nhỏ hơn đối với phần còn lại, có khả năng thay đổi
kích thước và độ đàn hồi rất tốt. Khi tấn công con mồi, vòi hút sẽ phình to lên hút
con mồi vào bên trong đưa đến nhánh ngắn của túi răng kitin và răng kitin được
phóng vào, tiếp đến chất độc sẽ được bơm đầy làm tê liệt con mồi. Cấu trúc mô học
của vòi hút là lớp tế bào cơ vân, chính cấu trúc này giải thích cho khả năng đàn hồi
và sức chứa đựng lớn.
- Túi răng kitin (dải răng kitin) : chứa các răng kitin. Dải răng này bao gồm
hai nhánh như hai cánh tay. Nhánh dài có màu đỏ ở phần nối với ống dẫn và vàng
nhạt ở phần còn lại, nhánh còn lại trong suốt. Phía cuối túi răng kitin này có tế bào

odontoblast (tế bào tạo răng) có vai trò tạo ra các răng kitin. Các răng kitin ban đầu
mềm sau đó trở nên cứng khi chúng di trú từ nhánh dài đến nhánh ngắn. Quá trình
đi tới nhánh ngắn răng kitin đi song song dọc theo túi. Chỉ một răng kitin trưởng
thành, cứng lên và đi về phía hầu chuẩn bị cho việc tấn công.
- Răng kitin: Răng kitin của Conus spp. giống như kim tiêm trong suốt, khi
tiêm vào cơ thể con mồi răng kitin sẽ được giữ lại trong cơ thể, răng này có vai trò
trực tiếp đưa chất độc vào cơ thể con mồi. Trên răng có các ngạnh để giữ răng kitin
lại trong con mồi. Tùy từng loài sẽ có kích thước răng kitin khác nhau. Có những
loài răng là những kim tiêm rất nhỏ yếu, có loài răng kitin lại rất cứng và chắc. Các
ngạnh của kim tiêm giống như các ngạnh của lưỡi câu. Tất cả răng kitin các loài ốc
cối có ngạnh đầu, một số có ngạnh thứ hai, ngoài ra còn tìm thấy một số rất ít loài
có ngạnh thứ ba. Lưỡi răng kitin có vai trò cắt và mở rộng diện tích tiếp xúc khi
phóng kim tiêm vào con mồi. Đường răng cưa là một dãy răng nhỏ chạy dọc phía
trong thân răng kitin từ ngạnh đầu xuống gần giữa răng kitin. Các răng nhỏ này có
kích thước lớn dần từ đỉnh đến giữa thân răng kitin. Hầu hết tất cả các loài có một
hàng răng nhỏ, chỉ một số ít có hai hàng, một số loài không có đường răng cưa này.
13


Hình thái của răng chitin có thể biến đổi rất lớn giữa các loài và nó quan hệ mật
thiết với các loại thức ăn (Endean và Rudkin, 1965).
Tùy thuộc vào loại con mồi mà phương thức tấn công bằng răng kitin cũng
khác nhau, loài ăn cá chỉ dùng một răng để bắt con mồi, trong khi đó, loài ăn
nhuyễn thể tiếp tục tiêm độc tố vào con mồi sau khi tấn công. Quan sát cho thấy loài
ăn nhuyễn thể có thể dùng đến nửa túi răng kitin để bắt một con mồi (Terlau và
Olivera, 2004). Đối với loài ăn cá thường có 2 dạng răng phổ biến dạng thứ nhất có
răng dài, đường răng cưa ở phía trước, chân hơi mở rộng, có 1 lưỡi nhỏ trên đỉnh ở
một mặt và ngạnh ở trên mặt khác, dạng thứ 2 có chiều dài ngắn hơn dạng thứ nhất,
nhưng thiếu đường răng cưa, chân hơi mở rộng, đỉnh có 2 ngạnh đối diện nhau,
ngạnh thứ 3 rất lớn và nhô ra ngoài (Duda và Paulumbi, 2001).

Franklin và cs (2007) nghiên cứu hình thái răng kitin của một số loài ốc cối ở
các vùng ven biển Ấn Độ, kết quả cho thấy sự khác biệt trong cấu trúc răng kitin ở
các loài này và họ đã phân loại các loài nghiên cứu làm ba nhóm: ăn cá, ăn nhuyễn
thể, ăn giun biển. Nghiên cứu còn cho thấy cấu trúc răng kitin sẽ chuyên biệt cho
từng loại con mồi và rất có giá trị trong việc phân loại các loài ốc cối (Franklin và
cs, 2007). Cấu trúc răng kitin của ốc cối được mô tả ở hình 1.9.
Các loài ốc cối cung cấp nguồn dược phẩm quan trọng trong tự nhiên. Mặc
dù vậy, cho đến nay, các nhà khoa học chỉ mới chiết xuất và phân tích được khoảng
100 độc tố từ nguồn tiềm năng chứa tới ~70.000 peptide độc tố ốc cối. Trong đó,
95% nghiên cứu chỉ được thực hiện trên 3 loài trong số 700 loài ốc cối (Espiritu và
cs, 2001; Chivian và cs, 2003). Vì vậy, các nghiên cứu nhằm khám phá các độc tố
mới vẫn đang được tiếp tục tiến hành. Do các loài ốc cối có quan hệ gần gũi thường
chứa các peptide độc tố giống nhau. Bởi vậy, các nghiên cứu phát sinh chủng loại
ốc cối góp phần quan trọng làm sáng tỏ quan hệ loài và phát hiện các độc tố mới.





14

Hình 1.9: Cấu trúc răng kitin điển hình của ốc cối (Flankin và cs, 2007).

I.1.7. Phân loại độc tố ốc cối conotoxin
Tùy thuộc vào khả năng gây tử vong, mỗi loại peptide của độc tố ốc cối
thuộc loại conotoxin (gây tử vong) hoặc conopeptide (không gây tử vong). Mỗi loại
độc tố ốc là một dãy duy nhất chứa trên 100 loại peptide khác nhau. Khi giải mã
gen, người ta thấy rằng các conotoxin là các propeptide, sau đó chúng được enzyme
endoprotease phân cắt để tạo thành các peptide độc cuối cùng. Các peptide này có
kích thước nhỏ, tương đối dễ tổng hợp, cấu trúc ổn định tác dụng vào các mục tiêu
chuyên biệt làm cho chúng trở thành các đầu dò (probe) lý tưởng trong dược học.
Một điều rất ngạc nhiên là đa số các độc tố ốc có liên quan đến sự giảm đau đớn và
được dùng trong trị liệu giảm đau. Người ta ước lượng có khoảng trên 50.000 đến
100.000 loại conopeptide nhưng chỉ mới khoảng 0,1% được đặc trưng hóa về được
học. Chính số độc tố lớn lao này tác dụng lên các kênh canxi (ω-conotoxin), natri
(µ-, µO-, δ- conotoxin) và kali (κ- conotoxin), chất vận chuyển norepinephrine (χ-
conopeptide), thụ thể (receptor) acetylcholine nicotinic (α- conotoxin), α
1
-
adrenoceptor (ρ- conopeptide), thụ thể NMDA (conantokins), thụ thể vasopressin
(conopressin) và thụ thể neurotensin (contulakins).
Gai trư

ớc

Gai th
ứ 3

Gai th
ứ 2

Lư
ỡi

Thân

răng

Khớp đáy
Dây
ch
ằng


Eo
Thân răng
Lưỡi
kim

C
ựa
đáy

15


Độc tố ốc cối được phân ra thành 6 superfamily (A-, M-,O-, P-,S- và T) dựa
trên khung cystein của chúng, sự tương đồng của trình tự pre-pro của gen, kiểu cuộn
và tác dụng sinh lý. Chúng được biết có hoạt tính antinoceptive, chống động kinh,
bảo vệ tim, bảo vệ thần kinh, do đó chúng trở nên các công cụ hữu ích trong nghiên
cứu ung thư, neuromuscular và rối loạn tâm lý (Bingham, 2010).
Superfamily A gồm 4 họ độc tố: α-, αA-, κA- và ρ-conotoxin. Trong đó α-,
và αA-conotoxin là các nAChR đối kháng, κA- conotoxin tấn công vào các kênh
K
+
trong khi ρ-conotoxin là các antagonist ưa thích tấn công vào các a
1B

adrenoceptor. α-conotoxin làm ngăn cản các thụ thể acetylcholine nicotinic
(nAChR). Các α-conotoxin có chứa từ 12 đến 25 acid amin và có 4 cystein, tạo nên
hai liên kết disulfid. α-conotoxin SII có chứa 6 cystein và 3 liên kết disulfid. Việc
ức chế các thụ thể này cho thấy có liên quan trúc tiếp đến việc học, antinoception,
nghiện nicotin, và rối loạn thần kinh thuộc bệnh Parkinson và Alzheimer.
Superfamily M nhỏ hơn, có hai họ là µ- và ψ-conotoxin. Psi (ψ)-conotoxin
tấn công vào kênh nAChR, không cạnh tranh trong khi mu (µ)-conotoxin làm nghẽn
kênh natri phụ thuộc điện thế (voltage) Na
v
trong các tế bào excitable như cơ, tim,
mô cơ xương và mô thần kinh. Với kích thước trung bình, 22 acid amin, µ-
conotoxin có 6 cystein và 3 liên kết disulfid.
Superfamily O là lớn nhất và có 5 họ: µO-, δ-, ω-, κ- và γ-conotoxin. Cả hai
họ µO- và δ-conotoxin tấn công kênh Na
v

( khác vùng với µ-conotoxin) trong khi
các họ khác tương ứng tấn công các kênh Ca
2+
, kênh K
+
và kênh Pacemaker. δ-
conotoxin có chứa khoảng 30 acid amin và có bản chất kỵ nước mạnh.
Superfamily P chỉ chứa một họ có tính ức chế cystein knot motif, gây chứng
co cứng cơ. Các độc tố này gây chứng liệt cơ ( spastic paralysis) nhưng phân tử của
chúng vẫn chưa xác định được. Một ví dụ của conotoxin gây liệt cơ là Tx9a, là một
peptid chứa acid glutamic gamma carboxy được tìm thấy trong độc tố của loài ốc ăn
nhuyễn thể là Conus textile. Sự biến đổi sau khi phiên dịch mã (post-translational
16


modifications, PTMs) trong các conotoxin là phổ biến và thay đổi; đặc điểm này
làm làm tăng tính đa dạng sinh học và khả năng tấn công mục tiêu.
Superfamily S cũng chỉ có một họ, tách ra từ Conus geographus, cũng chưa
được biết rõ. Họ σ-conotoxin có peptide khá lớn, 41 acid amin, chứa 8 cystein và 4
liên kết disulfid. Họ này có đặc điểm hóa học rất khác so với các họ đã nói trên.
Chúng là antagonist của thụ thể 5HT
3
, có đáp ứng kích thích kéo theo trong neuron
khi serotonin liên kết (5-hydroxytryptamine).
Cuối cùng là superfamily T bao gồm hai họ là τ- và χ-conotoxin. Các peptide thuộc
các họ này có 4 cystein và hai liên kết disulfid. τ-conotoxin ức chế kênh Ca2+ pre-
synap trong khi χ-conotoxin ức chế NET.
Các lớp nhỏ hơn của các conopeptide không được xếp vào các superfamily nói trên.
Chúng hoặc là chỉ chứa một liên kết disulfide hoặc có bản chất tuyến tính không
chứa cystein.

I.2. TỔNG QUAN VỀ VÙNG NGHIÊN CỨU
(bản đồ địa lý về sự phân bố các vùng biển Việt Nam được mô tả ở hình 1.10)
I.2.1. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường đảo Cù Lao Chàm
và ven bờ Quảng Nam.
Quảng Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, chỉ có 2 mùa là mùa mưa và
mùa khô, chịu ảnh hưởng của mùa đông lạnh miền Bắc. Nhiệt độ trung bình năm
20-21
o
C, không có sự cách biệt lớn giữa các tháng trong năm. Lượng mưa trung
bình 2000-2500mm, nhưng phấn bố không đều theo thời gian và không gian, mưa ở
miền núi nhiều hơn đồng bằng, mưa tập trung vào các tháng 9 - 12, chiếm 80%
lượng mưa cả năm.
Nhiệt độ nước biển dao động trong khoảng từ 22,5 – 30,5
o
C. Nhiệt độ nước
biển cao nhất thường xảy ra vào tháng 7, 8 hàng năm, nhiệt độ nóng nhất ghi nhận
được là 30,8
o
C (tháng 7 năm 2002).
17


Cù Lao Chàm là một cụm đảo xã đảo Tân Hiệp, thành phố Hội An, tỉnh
Quảng Nam, nằm cách bờ biển Cửa Đại 15km. Cù Lao Chàm bao gồm 8 đảo: Hòn
Lao, Hòn Dài, Hòn Mồ, Hòn Khô mẹ, Hòn Khô con, Hòn Lá, Hòn Tai, Hòn Ông.
Do địa thế các đảo chụm lại với nhau tạo thành vịnh kín, đồng thời cũng là bức
tường bảo vệ các rạn san hô, nhờ thế mà nơi đây tạo thành hệ sinh thái, nó còn là
nơi trú ngụ của nhiều loài ốc như ốc đụn, ốc cối.
Các hệ sinh thái bãi triều ven bờ Quảng Nam: Theo kết quả nghiên cứu của

Tống Phước Hoàng Sơn (2007). Khu vực ven bờ Quảng Nam bao gồm các hệ sinh
thái vùng triều chính sau:
- Bãi triều phía ngoài cửa sông Thu Bồn (Cửa Đại), có diện tích 420 ha là
khu vực quá trình xói lở bồi tụ xảy ra thường xuyên, bãi triều không ổn định khó
có khả năng làm nơi cư trú cho hải sâm.
- Bãi triều phía ngoài Cửa Lỡ (Vụng An Hòa), có diện tích 365 ha, cũng chịu
tác động bồi xói thường xuyên bãi triều không ổn định khó có khả năng làm nơi cư trú
cho hải sâm.
- Bãi Ngang, cát sạch kéo dài gần 30km, dọc 6 huyện ven biển thuộc tỉnh
Quảng Nam. Là khu vực cát trắng, sạch, nguồn dinh dưỡng hữu cơ ít cung cấp cho
bãi, bãi biển dốc, khó tạo nơi cư trú cho hải sâm.
Rạn san hô ở mũi An Hòa: Trên cơ sở tài liệu các chuyến khảo sát 7-8/1999 (Trịnh
Thế Hiếu và cs. 1999) cho thấy, trong khu vực biển An Hòa có 2 kiểu rạn chính là:
kiểu rạn riềm ven các đảo và kiểu rạn nền, thuộc nhóm rạn hở. Thành phần và độ
phủ của san hô trên các kiểu rạn cũng khác nhau, trong đấy kiểu rạn nền (gồm bãi
cạn trước cửa vụng An Hoà, bãi cạn Rạn Lớn) có thành phần đa dạng hơn và độ phủ
cao hơn. Riêng tại bãi cạn Rạn Lớn, độ phủ trung bình của san hô thường từ 30-
35%, nhiều nơi có độ phủ san hô đạt 100%, với nhiều hang động, là nơi trú ngụ của
nhiều loài thủy sản.
I.2.2. Đặc điểm điều kiện tự nhiên và sinh thái môi trường vịnh Vân Phong
Vịnh Vân Phong nằm cách xa Nha Trang về phía Bắc hơn 30km theo đường
chim bay, 60km theo đường bộ và 40 hải lý theo đường biển. Vịnh Vân Phong nằm
18


giới hạn trong khoảng 109
o
10’ - 109
o
26’ kinh độ Đông và 12

o
29’ - 12
o
48’ vĩ độ
Bắc. Đây là một vịnh lớn, sâu và tương đối kín của Việt Nam. Tổng diện tích của
vịnh khoảng 46.000ha trong đó diện tích mặt nước khoảng 41.000ha, diện tích các
đảo khoảng 5.00ha (bao gồm đảo Hòn Lớn, Hòn Bịp, Hòn Mỹ Giang, Hòn Hèo và
các đảo nhỏ khác ở Bắc và Tây Bắc Hòn Lớn). Phần diện tích có độ sâu nhỏ hơn
10m là 16.750 ha chiếm hơn 36 %, còn lại 64% diện tích của vịnh có độ sâu từ
10m – 40m .
Vịnh Vân Phong nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa Nam
Trung Bộ với hai mùa gió chính thịnh hành trong năm (gió mùa Đông Bắc và gió
mùa Tây Nam) và chịu ảnh hưởng mạnh bởi chế độ gió địa phương (gió Tu Bông
khô lạnh, gió tây khô nóng và cả gió đất biển). Đây là vùng có độ ẩm, lượng mưa
thấp và số giờ nắng cao nhất tỉnh Khánh Hòa.
Nhiệt độ nước biển dao động trong khoảng từ 23,8 – 30,6
o
C. Là khu vực có
chế độ nhiệt cao hơn hẳn so với các khu vực khác thuộc Trung Bộ. Nhiệt độ nước
biển cao nhất thường xảy ra vào tháng 5 – 9 hàng năm, bao gồm hai đỉnh tháng 5-6
và đỉnh tháng 9, trong đó đỉnh tháng 5-6 thường là cực trị chính. Nhiệt độ nóng nhất
ghi nhận được là 30,6
o
C (tháng 5 năm 2006). Mùa khô kéo dài từ tháng 10 đến
tháng 3 năm sau tương ứng với thời kỳ rét và khô, lượng mưa không đáng kể, nhiệt
độ nước giảm thấp vào tháng 1 đến tháng 3 hàng năm, nhiệt độ thấp nhất ghi nhận
được vào tháng 1 năm 2006 là 23,6
o
C.
Lượng mưa cao nhất thường xảy ra vào tháng 10, 11. Lượng mưa cao nhất

(19,4mm/ngày) được ghi nhận vào tháng 11 năm 2007. Ngoài ra lượng mưa còn có
một đỉnh phụ thứ hai xảy ra vào tháng 5, 6 hàng năm được gọi là mưa tiểu mãn.
Điểm đặc biệt cần chú ý là đôi khi tuy được là mưa tiểu mãn nhưng lượng mưa vào
thời này đôi khi vượt quá lượng mưa vào tháng 10, 11 hàng năm.
Lượng mưa thấp nhất, trùng với thời kỳ hạn hán thường xảy ra vào tháng 12
đến tháng 3 năm sau. Thời kỳ này thường ghi nhận lượng mưa cực kỳ nhỏ, hầu như
không đáng kể hàng năm.