thử nghiệm dùng chất kích thích hệ miễn dịch beta - 1,31,6 glucan nhằm nâng cao sức khỏe của cá khoang cổ đỏ (amphiprion frenatusbrevoort, 1856) giống

LỜI CẢM ƠN


Trong thời gian thực tập cũng như hoàn thành cuốn luận văn này, tôi đã
nhận được sự giúp đỡ tận tình của các cơ quan, tổ chức và cá nhân.
Qua đây, cho tôi chân thành cảm ơn tới Bộ môn Bệnh học – Khoa Nuôi
trồng Thuỷ sản – Trường đại học Nha Trang cùng với Phòng Công Nghệ Nuôi
Trồng – Viện Nghiên cứu Biển đã tạo điều kiện cho tôi được thực tập và hoàn
thiện luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn thầy giáo: Ts. Nguyễn Hữu Dũng và Ts. Nguyễn
Thị Thanh Thuỷ đã trực tiếp hướng dẫn tôi với tất cả tấm lòng nhiệt tình trong
thời gian thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn tới các cô, các anh chị ở Phòng Công Nghệ Nuôi
Trồng đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi để tôi hoàn thành trong đợt thực tập qua.
Chân thành cảm ơn tới các bạn bè, những người luôn chia sẽ, động viên
cũng như giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, nơi luôn
luôn bên cạnh tôi để động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quảng đường dài trên
giảng đường nhà trường.
Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Minh Tiến


MỤC LỤC

TRANG

LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG LUẬN 3
1. Hệ miễn dịch của cá 3

2. Tình hình nghiên cứu về sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch trong nuôi
trồng Thủy sản trên thế giới và Việt Nam 4

2.1.
Tình hình nghiên cứu về sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch trong
nuôi trồng thủy sản trên thế giới 4

2.1.1. Chất kích thích hệ miễn dịch - Imumunostimulant 4

2.1.2. Cơ chế tác dụng của Beta - 1,3/1,6 glucan ở cá 7

2.1.3. Thời điểm dùng chất kích thích hệ miễn dịch 9

2.1.4. Kỹ thuật gây miễn dịch 10

2.1.5. Nồng độ và thời gian sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch 11

2.2.
Tình hình nghiên cứu về sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch trong
nuôi trồng Thủy sản ở Việt Nam 11

3. Một số đặc điểm sinh học sinh sản và giá trị kinh tế của cá Khoang Cổ Đỏ12

3.1. Một số đặc điểm sinh học sinh sản của cá Khoang Cổ Đỏ 12

3.2. Giá trị kinh tế 14

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
1. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu 15

2. Bố trí thí nghiệm 15

3. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22
1. Ảnh hưởng của chất kích thích hệ miễn dịch Beta –
1,3/1,6 glucan lên tỷ lệ
sống, hàm lượng đạm và sức đề kháng của cá Khoang Cổ Đỏ từ khi cá đạt 3
ngày tuổi 22

1.1. Biến động yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm 22

1.2. Tỷ lệ sống của cá Khoang Cổ Đỏ từ 3 ngày tuổi 23

1.3. Hàm lượng đạm tổng số của toàn bộ cơ thể cá 25

1.4. Sức đề kháng của cá đối với vi khuẩn Vibrio alginolyticus 26

2. Ảnh hưởng của chất kích thích hệ miễn dịch Beta –
1,3/1,6 glucan lên tốc độ
tăng trưởng, tỷ lệ sống, hàm lượng đạm và sức đề kháng của cá Khoang Cổ Đỏ
từ khi cá đạt 1 tháng tuổi 30

2.1. Biến động yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm 30

2.2. Tốc độ tăng trưởng của cá Khoang Cổ Đỏ 1 tháng tuổi 31

2.3. Tỷ lệ sống của cá Khoang Cổ Đỏ 1 tháng tuổi 34

2.4. Hàm lượng đạm tổng số (mg/g khô) trong toàn bộ cơ thể cá 36

2.5. Sức đề kháng của cá đối với vi khuẩn Vibrio alginolyticus 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 38
1. Kết luận 38


1.1. Tỷ lệ sống của cá 38
1.2. Tốc độ tăng trưởng 38
1.3. Hàm lượng đạm tổng số 38
1.4. Sức đề kháng của cá đối với vi khuẩn
Vibrio alginolyticus
38
2. Đề xuất ý kiến 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC BẢNG
TRANG

Bảng 1: Yếu tố môi trường nước trong quá trình thí nghiệm cá 3 ngày tuổi 22

Bảng 2. Tỷ lệ sống của cá Khoang Cổ Đỏ 3 ngày tuổi trong 25 ngày thí nghiệm 23

Bảng 3: Hàm lượng đạm tổng số cá Khoang Cổ Đỏ sau 25 ngày nuôi 26

Bảng 4: Tỷ lệ tử vong lũy tích và hệ số bảo vệ tương đối (% RPS) của cá Khoang Cổ Đỏ 3
ngày tuổi sau khi gây cảm nhiễm vi khuẩn
Vibrio alginolyticus
27

Bảng 6: Biến động nhiệt độ và độ mặn trong thời gian thí nghiệm cá 1 tháng tuổi
30

Bảng 7: Tốc độ tăng trưởng của cá Khoang Cổ Đỏ 1 tháng tuổi trong thời gian thí nghiệm 32

Bảng 8: Tỷ lệ sống của cá Khoang Cổ Đỏ 1 tháng tuổi trong 21 ngày nuôi 34

Bảng 9: Hàm lượng đạm tổng số (mg/g khô) của cá Khoang Cổ Đỏ 36

Bảng 10: Phân lập vi khuẩn ở cá Cá Khoang Cổ sau 3 tuần gây cảm nhiễm 37

DANH MỤC HÌNH
TRANG

Hình 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của Beta-1,3/1,6 glucan lên tỷ lệ sống,
hàm lượng đạm tổng số và sức đề kháng cá Khoang Cổ Đỏ từ 3 ngày tuổi 17

Hình 2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của Beta-1,3/1,6 glucan lên sinh trưởng,
tỷ lệ sống, hàm lượng đạm tổng số và sức đề kháng của cá Khoang Cổ Đỏ từ 1 tháng
tuổi 19

Hình 3: Hệ thống bể thí nghiệm 20

Hình 4: Cân khối lượng cá 20

Hình 5: Đồ thị biến động nhiệt độ và độ mặn trong thời gian thí nghiệm cá từ 3 ngày tuổi
22

Hình 6: Tỷ lệ sống của cá Khoang Cổ Đỏ 3 ngày tuổi trong 25 ngày đầu 24

Hình 7: Đồ thị tỷ lệ sống của cá Khoang Cổ Đỏ sau khi cảm nhiễm vi khuẩn
Vibrio alginolyticus
28

Hình 8: Đồ thị biến động nhiệt độ và độ mặn trong thời gian thí nghiệm 31

Hình 9: Tốc độ tăng trưởng về chiều dài của cá Khoang Cổ Đỏ 33

Hình 10: Tốc độ tăng trưởng về trọng lượng của cá Khoang Cổ Đỏ 33

Hình 11: Tỷ lệ sống của cá Khoang Cổ Đỏ 1 tháng tuổi trong 21 ngày nuôi. 35












THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

1.

CNNT : Công Nghệ Nuôi Trồng
2.

CFU : Colony Form Unit
3.

NTTS : Nuôi trồng thuỷ sản
4.

h : Giờ
5.

mL : mililít
6.

N : Số con
7.

ppm : part per million
8.

Ts. : Tiến sĩ
9.

TNHH SX & TM: Trách nhiệm hữu hạn sản xuất và thương mại
10.

RPS : Relative Percent Survival (%)

LỜI MỞ ĐẦU


Bệnh nhiễm khuẩn là nguyên nhân chính dẫn đến sự tổn thất lớn trong
nuôi trồng thủy sản. Nhìn chung, các phương pháp phòng trị bệnh bằng hóa chất
hay vaccine đã mang lại hiệu quả nhất định trong phòng trị bệnh nhiễm khuẩn
cho tôm cá nuôi. Tuy nhiên, các phương pháp này thường ảnh hưởng xấu đến
môi trường bởi sự tích tụ của chúng trong nước và trên nền đáy. Thêm nữa, việc
dùng kháng sinh và hóa chất có thể gây nên những dòng vi khuẩn kháng thuốc
dẫn đến chi phí tốn kém mà hiệu quả lại không cao.
Chất kích thích hệ miễn dịch có tác dụng tăng cường hoạt động hệ miễn
dịch tự nhiên khi được áp dụng một mình hoặc có thế kích thích đồng thời hệ
miễn dịch tự nhiên và hệ miễn dịch đặc hiệu khi nó được đi kèm với vaccine
hoặc khi cá bị viêm nhiễm (Philip et al, 2001). Gần đây việc dùng chất kích thích
hệ miễn dịch có nguồn gốc tự nhiên ngày càng được xem là một giải pháp an
toàn và bền vững trong việc nâng cao sức khỏe và phòng bệnh cho đối tượng
nuôi thuỷ sản bởi nó không gây ô nhiễm môi trường, chi phí thấp lại dễ áp dụng.
Cho đến nay, Beta glucan được coi là chất kích thích hệ miễn dịch có hiệu quả
nhất đối với tôm, cá nuôi và nó được sử dụng như một thành phần quan trọng
trong thức ăn nuôi tôm công nghiệp (Lall và Olivier, 1995). Tuy nhiên, việc xác
định liều dùng, thời gian và phương pháp sử dụng hợp lý của Beta glucan đối với
từng đối tượng nuôi vẫn chưa được nghiên cứu nhiều ở nước ta.

Cá Khoang Cổ Đỏ
Amphiprion frenatus là
loài cá cảnh phổ biến ở Việt
Nam, tuy ít có giá trị về mặt thực phẩm nhưng nhờ màu sặc sỡ, khả năng thích
nghi cao trong điều kiện nuôi nhốt và đặc điểm đặc trưng là luôn sống cộng sinh
cùng Hải quỳ nên loài cá này đã được thị trường cá cảnh ở trong nước cũng như
trên thế giới rất ưa chuộng. Cá đã được Phòng Công Nghệ Nuôi Trồng (CNNT)
nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản và bước đầu thử nghiệm sinh sản nhân tạo
thành công. Hiện nay Phòng đang tiếp tục thực hiện đề tài “Hoàn thiện quy trình
sản xuất giống và nuôi thương mại cá Khoang Cổ Đỏ”. Tuy nhiên, tỷ lệ sống của
đàn cá giống vẫn chưa ổn định. Mặt khác, trong điều kiện nuôi giữ, ngay cả cá
trưởng thành cũng có thể bị sốc trước sự thay đổi điều kiện môi trường và thường
chết nhiều nhất vào thời gian cá được chuyển từ ngoài tự nhiên vào môi trường
nuôi giữ. Do vậy việc thử nghiệm dùng chất kích thích hệ miễn dịch để nâng cao
sức khỏe cho loài cá này là nội dung cần thiết nhằm đưa ra được phương pháp
phòng bệnh hiệu quả và bền vững trong sản xuất giống nhân tạo và nuôi thương
mại các đối tượng này.
Xuất phát từ thực tiễn trên, được sự đồng ý chấp thuận của Phòng CNNT , Viện
Nghiên cứu Biển và theo sự phân công của Bộ môn Bệnh Học – Khoa Nuôi trồng
Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang tôi đã thực hiện đề tài: “Thử nghiệm
dùng chất kích thích hệ miễn dịch Beta - 1,3/1,6 glucan nhằm nâng cao sức
khỏe của cá Khoang Cổ Đỏ (
Amphiprion

frenatus
Brevoort, 1856) giống.
Mục tiêu của đề tài:
- Bước đầu đánh giá hiệu quả của chất kích thích hệ miễn dịch Beta glucan
lên sức khỏe của cá Khoang Cổ Đỏ trong điều kiện nuôi giữ.
- Tạo tiền đề cho việc nghiên cứu sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch

Beta glucan nhằm nâng cao tỷ lệ sống của đàn cá giống trong sinh sản nhân tạo
và nuôi thương mại cá Khoang Cổ Đỏ.
Nội dung nghiên cứu đề tài:
1.

Ảnh hưởng của chất kích thích hệ miễn dịch Beta – 1,3/1,6 glucan lên
tỷ lệ sống, hàm lượng đạm và sức đề kháng của cá Khoang Cổ Đỏ từ khi cá đạt 3
ngày tuổi
2.

Ảnh hưởng của chất kích thích hệ miễn dịch Beta – 1,3/1,6 glucan lên
tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống, hàm lượng đạm và sức đề kháng của cá Khoang
Cổ Đỏ từ khi cá đạt 1 tháng tuổi
Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài: góp phần đưa ra được phương
pháp phòng bệnh hiệu quả và bền vững trong sản xuất giống nhân tạo và nuôi
thương mại các đối tượng này.
Do thời gian và kiến thức còn hạn chế, do vậy báo cáo này không thể
tránh khỏi những thiếu sót nhất định. Rất mong được sự góp ý chân thành của
quý thầy cô cùng với tất cả bạn bè.

Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Minh Tiến
Nha Trang, tháng 12 năm 2007





CHƯƠNG 1: TỔNG LUẬN
1. Hệ miễn dịch của cá

Hệ miễn dịch được định nghĩa là một hệ thống tự hoàn thiện trong cơ thể
sống nhằm giúp cơ thể tự bảo vệ và sinh tồn. Cá là một trong những động vật có
xương sống nguyên thủy nhất và được coi là trung gian giữa động vật có xương
sống và động vật không có xương sống. Để có thể tồn tại trong môi trường nước
nơi chứa nhiều loại tác nhân gây bệnh, đặc biệt là các loại vi sinh vật đa dạng về
đặc tính, kích thước và hình dạng, cá phải thích nghi tốt để đương đầu với những
thách thức của môi trường. Thông thường cơ chế bảo vệ của cá có thể được phân
làm 2 loại: Cơ chế bảo vệ tự nhiên (bẩm sinh) hay còn gọi là cơ chế bảo vệ
không đặc hiệu (non-specific) và cơ chế bảo vệ đạt được do sự thích nghi với
môi trường sống hay còn gọi là cơ chế bảo vệ đặc hiệu (specific). Hai cơ chế này
luôn hoạt động trong mối quan hệ qua lại và hỗ trợ lẫn nhau.
Cơ chế bảo vệ cơ bản và quan trọng nhất ở cá chính là cơ chế bảo vệ tự
nhiên. Sự miễn dịch tự nhiên của cá được xem như một khả năng bẩm sinh, giúp
cá tự tạo ra kháng thể tự nhiên chống lại các tác nhân gây bệnh mà không cần có
sự kích thích của chúng. Đó là kết quả thích nghi của nhiều thế hệ cá sống chung
với những tác nhân gây bệnh vốn có trong môi trường (Post, 1987).
Cơ chế hoạt động của hệ miễn dịch tự nhiên bao gồm bảo vệ cơ học như
da, vảy và chất nhày; bảo vệ bởi thể dịch trong tế bào và trong máu như các hệ
men (lysozyme, complement system), các loại đạm (C-reactive protein,
transferrin, interferons) và bảo vệ bởi các tế bào bạch cầu, thực bào
(macrophages và neutrophils) (Fletcher, 1986). Dịch tế bào và huyết thanh cá
cũng chứa rất nhiều các chất ức chế men có tác dụng bảo vệ cơ thể chống lại sự
tự tiêu hóa đồng thời chúng cũng đóng vai trò quan trọng trong việc trung hòa
các men do tác nhân gây bệnh sinh ra (Roberts, 2001).


2. Tình hình nghiên cứu về sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch trong nuôi
trồng Thủy sản trên thế giới và Việt Nam
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của nghề nuôi trồng thủy sản cả về quy
mô lẫn mức độ thâm canh, tình hình dịch bệnh trên các đối tượng nuôi thủy sản

ngày càng nghiêm trọng, đòi hỏi phải có các biện pháp phòng bệnh hữu hiệu
nhằm giảm bớt thiệt hại cho các nhà sản xuất. Imumunostimulants- chất kích ứng
hệ miễn dịch tự nhiên hiện nay đang là chất được sử dụng rộng rãi trên thế giới
để tăng cường khả năng đề kháng bệnh cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản.
2.1.

Tình hình nghiên cứu về sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch trong
nuôi trồng thủy sản trên thế giới.
2.1.1. Chất kích thích hệ miễn dịch - Imumunostimulant
Imumunostimulants: là những hợp chất sinh học hoặc tổng hợp nhân tạo
có khả năng làm tăng cường hệ thống miễn dịch không đặc hiệu của động vật
(Trích từ Fenichel và Chirigos, 1984).
Một số Imumunostimulant là chế phẩm chiết từ vách tế bào vi khuẩn
Steptococcus pyogenes, Mycobacterium spp, Norcadia rubrata,
Propionibacterium sp
, tế bào đã được giết chết và làm khô của
Mycobacterium
tuberculosis
hòa trong dầu (Freund adjuvant). Các chất hoạt tính của chế phẩm
vách tế bào vi khuẩn là lipopolysaccharide (LPS), lipopeptides, muramylpeptide,
acyloligopeptide và một số peptide khác.
Imumunostimulants là nhóm các chất (bao gồm cả một số chất bổ trợ) có
khả năng làm gia tăng sức đề kháng bệnh truyền nhiễm, không phải bằng việc gia
tăng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, mà là bằng việc tăng cường cơ chế miễn dịch
tự nhiên, đặc biệt là hệ thực bào. Khả năng đề kháng này không đặc hiệu, không
có ký ức miễn dịch và thời gian bảo vệ tương đối ngắn. Tuy nhiên,
imumunostimulant hiện có ý nghĩa rất lớn và được sử dụng khá rộng rãi trong
nghề nuôi trồng thủy sản trên thế giới nhằm gia tăng khả năng đề kháng bệnh cho
các đối tượng nuôi trồng khi chưa có vaccine thích hợp [Đỗ Thị Hoà et al, 2004].
Imumunostimulants tăng cường sức đề kháng của cá bằng cách điều chỉnh cơ

chế bảo vệ của cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh. Các chất này có thể được phân
chia theo các nhóm khác nhau dựa vào chức năng hoặc nguồn gốc của chúng như
nguồn gốc tự nhiên ( vi khuẩn, nấm, dịch chiết động , thực vật…) hoặc nhân tạo.
FK_156 là một peptid có khả năng tăng cường sức đề kháng cho chuột thí
nghiệm chống lại các bệnh do vi khuẩn khi tiêm hoặc cho ăn. Kitao và Yoshida
(1986) thông báo rằng khi tiêm FK-156 cho cá hồi Ráng
Oncorhynchus mykiss
1
ngày trước khi gây nhiễm cá với vi khuẩn
Aeromonas salnonicida
thì sức đề
kháng vi khuẩn của cá thí nghiệm tăng lên đáng kể. Hiệu quả bảo vệ này vẫn
được duy trì vào ngày thứ 7 sau khi tiêm, tuy có thấp hơn so với lần gây
nhiễm trước đó. Cơ chế của hiệu quả bảo vệ này thể hiện ở sự gia tăng hoạt
tính thực bào và cũng có hiệu quả cả ở nhóm cá thí nghiệm bị gây ức chế miễn
dịch [Đỗ Thị Hoà et al, 2004].
Ete (dịch chiết từ động vật xoang tràng ở biển
Ecteinascidia turbinata
) có
khả năng tăng đề kháng không đặc hiệu đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh, kể
cả
Aeromonas hydrophila
, ở cá Chình thí nghiệm bằng phương pháp tiêm (Sigel et
al, 1983). Yano et al (1989) đã công bố chất schizophylan, scleroglucan và
lentinan gia tăng sức đề kháng của cá chép đối với
Edwardsiella tarda
bằng
sự hoạt hóa hệ miễn dịch tự nhiên.
Các tác nhân cơ hội thường chỉ gây bệnh cho vật chủ khi vật chủ bị yếu hoặc
bị sốc trong điều kiện môi trường xấu. Những tác nhân cơ hội này có thể ảnh hưởng

xấu đến quá trình sinh trưởng nói chung của của vật chủ ngay cả khi điều kiện môi
trường tốt và vật chủ không có dấu hiệu gì của bệnh tật. Chất kích thích hệ miễn
dịch có thể tăng cường cơ chế bảo vệ của cơ thể làm mất tác dụng của tác nhân gây
bệnh cơ hội vì vậy tăng cường quá trình phát triển và giảm tỷ lệ tử vong của vật chủ.
Theo Baba et al (1993), sức đề kháng đối với vi khuẩn
Aeromonas hydrophila
và
khả năng thực bào của cá chép thường
Cyprinus carpio
tăng đáng kể sau khi được
tắm dung dịch levamisole (10µL/mL, 24 giờ). Jeney và Anderson (1993) cũng cho
thấy rằng cá Hồi Ráng
Oncorhynchus mykiss
được tắm 30 phút trong dung dịch
levamisole (5µL/mL) trước khi tắm 2 phút trong dung dịch
A. samonicida
thì hoạt
động hệ miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu tăng đáng kể.
Khác với cá và động vật máu nóng, tôm và các động vật không xương sống
phụ thuộc hoàn toàn vào hệ miễn dịch không đặc hiệu và không có khả năng sinh
ra kháng thể đặc hiệu, do vậy dùng chất kích thích hệ miễn dịch trở nên giải pháp
quan trọng trong việc tăng cường sức khỏe cho tôm nuôi. Tỷ lệ sống của hậu ấu
trùng tôm được tắm trong dung dịch Beta - 1,3/1,6 glucan cũng tăng lên đáng kể
(Supamattaya và Pongmaneerat, 1998).
Việc phát triển các vaccine chống lại các bệnh virus cần nhiều thời gian,
tốn kém và không thực tế, đặc biệt trong nghề nuôi thủy hải sản. Vì vậy, một
chiến lược tốt nhất để giảm bệnh do virus gây ra là cần phải có chế độ cho ăn và
chăm sóc tốt kết hợp với sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch nhằm giúp tôm cá
nuôi có sức đề kháng đối với các bệnh virus tốt hơn.
Beta - 1,3/1,6 glucan trong thức ăn làm tăng hiệu quả của kháng sinh

(Thompson et al,1993) và vitamin C (Verlhac et al, 1998). Cơ sở sinh học giải
thích cho việc tăng cường hiệu quả của kháng sinh nhờ chất kích thích hệ miễn
dịch là sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh bị hạn chế bởi các tác nhân kháng
khuẩn của chất kháng sinh, đồng thời cơ chế kháng khuẩn của cơ thể lại được
kích thích. Do vậy, việc dùng chất kích thích hệ miễn dịch kết hợp với kháng
sinh ở giai đoạn đầu của bệnh hoặc trước khi dịch bệnh bùng phát là một giải
pháp cần được quan tâm.
Một số nghiên cứu ở cá cho thấy hiệu quả của vaccine tăng đáng kể khi
được dùng kèm với Beta glucan. Chất kích thích hệ miễn dịch được dùng như
những chất trợ giúp (adjuvant) để kích hoạt các đại thực bào (Macrophage) sinh ra
phân tử protein có tên Cytokines (tế bào động lực) có nhiệm vụ kích hoạt các tế
bào bạch cầu có chức năng sinh kháng thể (Lympho-B) ở động vật máu nóng. Một
khám phá mang ý nghĩa thực tế là Beta - 1,3/1,6 glucan có tác dụng như một trợ
giúp (adjuvant) thật sự tăng cường sự sản sinh ra kháng thể, không chỉ qua con
đường tiêm cùng với vaccine mà còn thông qua con đường thức ăn (Nicoletti et al,
1992; Verlhar et al, 1998). Cá được tiêm Beta - 1,3/1,6 glucan có sức đề kháng tốt
hơn đối với một số bệnh nhiễm khuẩn (Robertsen et al, 1990) và tăng cường hiệu
quả của vaccine (Rosta et al, 1993). Beta - 1,3/1,6 glucan được bổ sung vào thức
ăn đã tăng cường hiệu quả của vaccine bằng cách tăng cường nồng độ kháng thể
(Raa et al, 1992; Raa et al 1996) chống lại bệnh nhiễm khuẩn
Furunculosis
ở cá
Hồi Ráng
Oncorhynchus mykiss
(Verlhac et al, 1998; Nikil et al, 1992; 1993).
Nhiều giả thiết cho rằng cá được xử lý glucan sẽ có sức khỏe tốt hơn nên
tăng trưởng nhanh hơn. Tôm được ăn thức ăn có Beta - 1,3/1,6 glucan tăng trưởng
nhanh, tỷ lệ tử vong giảm đồng thời hiệu quả sử dụng thức ăn tăng lên (Sung et al,
1994). Tuy nhiên, Matsuo và Miyazono (1993) cho thấy rằng peptidoglycan, một
trong những glucan có nguồn gốc từ thành tế bào của vi khuẩn Gram (-), tăng sức

đề kháng của cá Hồi Ráng
Oncorhynchus mykiss
chống lại vi khuẩn
Vibrio
alguillarium
, nhưng không có tác dụng trong tăng trưởng của cá.
2.1.2. Cơ chế tác dụng của Beta - 1,3/1,6 glucan ở cá
Beta glucan là hợp chất tinh bột không tan có cấu trúc chuỗi, là thành
phần tạo nên thành tế bào của hầu hết các loại men, nấm và một số vi khuẩn.
Như động vật máu nóng thì ở cá đã phát triển cơ quan thụ cảm (Receptor)
trên bề mặt của tế bào thực bào (Engstad và Robersen, 1994), và sự tiếp xúc đầu
tiên giữa glucan và tế bào thực bào được coi là sự gắn kết giữa glucan và cơ quan
thụ cảm glucan (Williams et al, 1996; William, 1997). Cơ quan thụ cảm được di
truyền trong quá trình tiến hóa của động vật và được phát hiện có mặt trong tất cả
các nhóm từ động vật không xương sống (tôm) đến con người. Vì vậy, cơ chế tác
động của Beta - 1,3/1,6 glucan lên hoạt động của hệ miễn dịch đối với các nhóm
động vật đều như nhau. Khi cơ quan thụ cảm liên kết với Beta - 1,3/1,6 glucan, tế
bào trở nên hoạt hóa hơn trong việc bao vây, giết và tiêu hóa vi khuẩn, đồng thời
chúng sinh ra những tế bào động lực Cytokines có chức năng kích hoạt sự tạo
thành tế bào bạch cầu mới. Do vậy, Beta - 1,3/1,6 glucan cũng tăng cường hiệu
quả của vaccine. Ở cá, cơ quan thụ cảm glucan đã được tìm thấy ở đại thực bào
của cá Hồi Đại Dương
Salmo salar
L. (Engsad và Robersen, 1993) và ở tế bào đa
nhân (Neutrophils) của cá da trơn
Ictalurus punctatus
(Aisworth, 1994). Tế bào đại
thực bào (Macrophages) của cá có khả năng nhận ra cấu trúc 1-3 glucan trong
thành tế bào của men, hoặc trực tiếp thông qua cơ quan thụ cảm (receptor) đặc
hiệu hoặc gián tiếp bằng cách liên kết với dịch thể có chức năng miễn dịch. Cấu

trúc nhánh glucan là một trong những yếu tố quan trọng mà cơ quan thụ cảm có
thể nhận biết từ phân tử glucan (Engstad và Robersen, 1993).
Cá không phát triển một cách rõ ràng về mặt cấu trúc tế bào như động vật
máu nóng. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào có chức năng miễn dịch đều có mặt
trong thành ruột của cá bao gồm tế bào bạch cầu sinh kháng thể (Lympho-B), tế
bào bạch cầu không sinh kháng thể (Lympho-T) và các tác nhân có mặt trong đại
thực bào (Macrophages) (Davina et al, 1980; Doggett và Harris, 1987; Rombout
et al. 1989, 1993). Sự kích thích hoạt động miễn dịch bằng con đường thức ăn
được gắn với sự có mặt của tế bào bạch cầu trong hệ tiêu hóa của cơ thể, ở đó
quá trình tiếp thu và hấp thụ Beta glucan diễn ra nhờ hệ thống thực bào ở hệ miễn
dịch màng nhầy của ruột. Giống như động vật máu nóng, ruột liên kết với hệ
miễn dịch của cá để hấp thu các phân tử lớn ở thành ruột sản sinh kháng thể
chống lại tác nhân lạ (Hart et al, 1988). Với giả thiết này, chúng ta nhận thấy
rằng Beta - 1,3/1,6 glucan khi được sử dụng cùng với thức ăn sẽ tăng cường sức
kháng bệnh và sự phát triển của cá, đồng thời nâng cao hiệu quả của vaccine và
kháng sinh khi được sử dụng kèm.
Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng glucan có khả năng kích thích hệ miễn
dịch của cá bảo vệ cơ thể khỏi bị nhiễm khuẩn. Cá Hồi Đại Dương
Salmo sala

được tiêm glucan đã tăng khả năng kháng bệnh đối với
Vibrio anguilarium

(Robersen et al, 1990; Onarheim và Robers, 1992; Mitchell, 1992). Khả năng diệt
khuẩn của đại thực bào ở cá Hồi Ráng
Oncorthynchus mykiss
, cũng tăng khi được
xử lý glucan (Jorgensen et al, 1993). Nhiều thử nghiệm cho thấy số lượng tế bào
bạch cầu và hoạt động thực bào ở cá da trơn
Ictalurus punctatus

tăng đáng kể sau
khi được ăn thức ăn có có chứa Beta glucan (Duncan và Klesius, 1996). Một số
nghiên cứu cho thấy các chất Beta glucan đã tăng cường hoạt động miễn dịch của cá
thông qua tăng cường hoạt tính men (lysozyme) đồng thời tăng cường khả năng diệt
khuẩn của tế bào thực bào (Robersen et al, 1990). Nhiều nghiên cứu chứng minh
rằng Beta - 1,3/1,6 glucan tăng cường sức kháng bệnh của cơ thể thông qua con
đường miệng và mũi, vì vậy tăng cường hệ miễn dịch cơ thể (Nicoletti et al,1992;
Maeda et al, 1994; Shoenher et al, 1994; Raa et al. Chưa công bố).
2.1.3. Thời điểm dùng chất kích thích hệ miễn dịch
Nhiều ý kiến cho rằng, môi trường tự nhiên của ao đìa nuôi tôm chính là
nguồn dự trữ phong phú chất kích thích hệ miễn dịch có nguồn gốc từ vi sinh vật.
Do vậy không cần phải bổ sung bất cứ một loại dùng chất kích thích hệ miễn
dịch nào khác. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng sức đề kháng của tôm
không được tăng cường ở những ao đìa có mật độ tảo và vi khuẩn cao. Điều này
có nghĩa là chất kích thích hệ miễn dịch có mặt trong thành phần tế bào của tảo
và vi khuẩn không ở trạng thái kích hoạt hoặc không có tác dụng tích cực. Một
vài nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng Beta - 1,3/1,6 glucan tăng cường hoạt
động kháng khuẩn của tế bào hemocyte ở tôm, trong khi đó vi khuẩn
Vibrio
ở
mật độ cao (10
6
CFU/mL) thì không có tác dụng này (Sung et al, 1994).
Chất kích thích hệ miễn dịch có thể được dùng trước khi đánh bắt tôm cá,
khi thay đổi nhiệt độ môi trường hoặc luyện cho cá giống chuyển từ thức ăn tươi
sống sang thức ăn tổng hợp, trong điều kiện thả mật độ cao, môi trường nước bị
phì dưỡng (hiện tượng nở hoa); các giai đoạn nhạy cảm như hậu ấu trùng và lột
xác của tôm, giai đoạn thành thục sinh dục. Chất kích thích hệ miễn dịch được
dùng để tăng cường khả năng phòng bệnh nói chung nhằm giảm nguy cơ bệnh
tật gây ra chứ không phải là một loại thuốc trị bệnh.

Dùng chất kích thích hệ miễn dịch có thể giúp cá phòng được một số bệnh
viêm nhiễm và giảm tỷ lệ tử vong. Tuy nhiên, không phải tất cả các bệnh viêm
nhiễm đều có thể phòng ngừa được bằng dùng chất kích thích hệ miễn dịch. Nhiều
công trình đã công bố kết quả của chất kích thích hệ miễn dịch của cá chống lại
một số bệnh nhiễm khuẩn do
Vibrio anguillarium, V. salmonicida, Aeromonas
salmonicida, Streptococcus sp
; bệnh do virus như bệnh đậu vàng; và do kí sinh
như đốm trắng. Ngoài ra còn nhiều loại bệnh chưa được kiểm nghiệm hoặc không
thấy hiệu quả của chất kích thích hệ miễn dịch như bệnh do
R. salmoninarum, P.
piscicida, E. ictaluri
. Những vi khuẩn này có thể sống trong đại thực bào của cá và
không bị ảnh hưởng bởi quá trình thực bào (Nelson et al, 1989; Baldwin và
Newton, 1996; Gutenberger et al, 1997). Anderson (1992) cho rằng chất kích thích
hệ miễn dịch có thể giúp cá phục hồi tình trạng bị ức chế hệ miễn dịch do stress
gây ra (Kitao và Yoshida, 1986; Boonyratpalin et al, 1995).
2.1.4. Kỹ thuật gây miễn dịch
Các kỹ thuật gây miễn dịch bao gồm cho ăn, phun, ngâm trực tiếp
(directimmersion), ngâm trong dung dịch ưu trương (hyperosmotic immersion),
và tiêm xoang bụng (intraperitoneal ịnection) với liều dùng hữu hiệu, mức độ bảo
vệ và thời gian bảo vệ giảm dần theo thứ tự ấy [Trích từ Đỗ Thị Hoà et al, 2004].
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng dùng phương pháp tiêm chất kích thích
hệ miễn dịch sẽ tăng cường hoạt động miễn dịch không đặc hiệu thông qua
tăng số lượng tế bào bạch cầu và khả năng bảo vệ của cá đối với tác nhân gây
bệnh. Tuy nhiên, phương pháp này gây stress cho cá do hoạt động đánh bắt và
tiêm, không khả thi đối với cá nhỏ, đòi hỏi nhiều thời gian và tốn sức. Do vậy,
phương pháp dẫn truyền qua miệng (chủ yếu là phương pháp cho ăn) và tắm
có thể khắc phục được những nhược điểm trên. Ưu điểm của phương pháp cho
ăn là không gây stress cho cá, không phụ thuộc vào kích thước và số lượng cá.

Dùng các chất kích thích hệ miễn dịch qua con đường thức ăn có tác dụng
tăng cường chức năng tế bào bạch cầu và sức đề kháng chống lại một số bệnh
như
Furunculosis
,
Vibriois
hay
Stepcoccois
. Baba et al (1993) công bố rằng cá
chép được tắm trong dung dịch levamisole với nồng độ 10 µg/mL trong 23 giờ
đã tăng hoạt động thực bào và sức đề kháng chống lại
Aeromonas hydrophila

trong 2 tuần. Jeney và Anderson (1993) báo cáo rằng cá Hồi Ráng
Oncorhynchus mykiss
được tắm trong dung dịch
A. salmonicida
kết hợp với
chất kích thích hệ miễn dịch như levamisole trong 30 phút, đã tăng cường hoạt
động thực bào, và nồng độ kháng thể chống lại
A. salmonicida
.
Cho đến nay, glucan được coi là chất kích thích hệ miễn dịch có hiệu quả
nhất đối với tôm, cá nuôi. Beta glucan hiện đang được sử dụng như một thành
phần quan trọng trong thức ăn công nghiệp (Lall và Oliver, 1991). Phương pháp
dùng chất kích thích hệ miễn dịch qua đường thức ăn được xem là phương pháp
thông dụng nhất vì nó dễ áp dụng và chi phí thấp (Siwicki, 1989; Sahoo và
Mukherjee, 1999; 2001 a, b). Chất kích thích hệ miễn dịch và phụ gia kèm theo
có thể được áp dụng trước, cùng hoặc sau khi vaccine để làm tăng cường hoạt
động hệ miễn dịch đặc hiệu thông qua tăng kháng sinh và số lượng tế bào có

chức năng sinh kháng thể. Để có thể kéo dài hiệu quả của chất kích thích hệ miễn
dịch, tốt hơn là kèm theo các phụ gia (chất mang) để giúp cho các hoạt chất này
giải phóng một cách từ từ.
2.1.5. Nồng độ và thời gian sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch
Một vấn đề đặt ra là sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch với nồng độ bao
nhiêu và khi nào thì sử dụng sẽ đạt hiệu quả tối ưu?
Theo Kajita et al (1990) cho biết cá Hồi Ráng
Oncorhynchus mykiss
được
tiêm dung dịch levamisole với nồng độ 0.1 µg/kg và 0.5 µg/kg thì hiệu quả các
phản ứng hóa học trong quá trình thực bào tăng. Tuy nhiên, khi dùng với nồng
độ là 5 µg/kg thì không có hiệu lực.
Theo nghiên cứu của Robersen et al (1994) thì hoạt động thực bào của đại
thực bào (Macrophages) được xử lý glucan đạt cao nhất ở nồng độ 0.1 – 1
µg/mL, trong khi đó ở nồng độ 10 µg/mL lại không có hiệu quả và ở nồng độ 50
µg/mL thì hoạt động của thực bào bị ức chế.
Matsuo và Miyazano (1993) công bố rằng cá Hồi Ráng
Oncorhynchus
mykiss
được ăn thức ăn có chứa peptidoglycan trong 28 ngày thì khả năng đề
kháng khi bị cảm nhiễm với vi khuẩn
Vibrio anguillarum
tăng đáng kể. Tuy
nhiên, nếu được ăn kéo dài tới 56 ngày thì khả năng đề kháng với vi khuẩn này
không tăng hơn. Yoshida et al (1995) cho thấy rằng số lượng tế bào thực bào
ở cá da trơn châu Phi tăng khi được ăn thức ăn có glucan hoặc oligosaccharide
trong 30 ngày, nhưng không có hiệu quả trong 45 ngày.
Như vậy, hiệu quả của việc dùng chất kích thích hệ miễn dịch không
phải tăng dần theo thời gian sử dụng nó, khi sử dụng ở nồng độ cao có thể sẽ
làm ức chế hệ miễn dịch của cá.

2.2.

Tình hình nghiên cứu về sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch trong
nuôi trồng Thủy sản ở Việt Nam
Ở Việt Nam thì sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch là chưa phổ biến và
chủ yếu mới chỉ sử dụng cho nuôi tôm thương phẩm. Beta glucan đã được sử
dụng nhiều trong nuôi tôm công nghiệp tuy nhiên việc xác định nồng độ và thời
gian sử dụng sao cho hợp lý vẫn còn là vấn đề cần quan tâm. Một số nghiên cứu
cho rằng nếu sử dụng liên tục trong một thời gian dài phải làm cho tôm phải tiêu
hao năng lượng và hậu quả là làm cho tôm yếu đi hệ miễn dịch. Đa số người cho
rằng sử dụng chất kích thích hệ miễn dịch trong thời gian ngắn sẽ có hiệu quả
bảo vệ vì nó chỉ tác dụng tới cơ chế miễn dịch không đặc hiệu.
Cá Khoang Cổ Đỏ là đối tượng cá cảnh được các nước trên thế giới rất ưa
chuộng vì màu sắc sặc sỡ của chúng cùng với đời sống cộng sinh với Hải quỳ nên
nó mang lại giá trị xuất khẩu cao trong các loài cá cảnh biển. Phòng CNNT đã
nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản và bước đầu thử nghiệm sinh sản nhân tạo
thành công loài cá này. Hiện nay phòng đang tiếp tục thực hiện đề tài “Hoàn thiện
quy trình sản xuất giống và nuôi thương mại cá Khoang Cổ Đỏ”. Do vậy, việc
nghiên cứu thử nghiệm dùng chất kích thích hệ miễn dịch để nâng cao tỷ lệ sống và
sức khỏe cho đối tượng này là vấn đề cần thiết để đưa ra được giải pháp phòng trị
bệnh hiệu quả và bền vững trong sản xuất giống.
3. Một số đặc điểm sinh học sinh sản và giá trị kinh tế của cá Khoang Cổ Đỏ
3.1. Một số đặc điểm sinh học sinh sản của cá Khoang Cổ Đỏ
Phân loại: Ngành:
Vertebrata
; Lớp cá xương:
Osteichthyes
; Bộ:
Perciformes
; Họ:

Pomacentridae
; Giống:
Amphiprion
; Loài:
Amphiprion
frenatus
Brevoort, 1856
Theo Mycrs (1991), ngoài tự nhiên, hầu hết cá Khoang Cổ đều sống quanh
vùng rạn san hô biển nhiệt đới, nơi có độ sâu từ 1 - 50 m nước. Màu sắc sặc sỡ tùy
theo các giai đoạn phát triển của cơ thể [Trích từ Hà Lê Thị Lộc (2004)].
Theo Allen (1972) và Wootton (1995), cá Khoang Cổ Đỏ thuộc nhóm cá
lưỡng tính với tính đực có trước. Điều này có nghĩa là tất cả các cá Khoang Cổ nhỏ
đều mang tính đực, đến một kích thước nào đó và gặp điều kiện thích hợp thì một
số sẽ chuyển sang con cái. Theo kết quả điều tra của một số tác giả cho biết sự
phát triển phôi của hầu hết các loài cá trong giống
Amphiprion
đều trải qua từ 6 –
10 ngày (ở nhiệt độ nước 25
o
C). Tuy nhiên, trứng thường nở vào ngày thứ 8 – 10
tùy theo điều kiện nhiệt độ. Kích thước của cá con mới nở thường đạt từ 4 – 5 mm,
sau 4 tháng đạt 40 mm và đến lúc này thì cá thường tìm Hải quì để cộng sinh.
Cơ chế nào đã giúp cá Khoang Cổ có khả năng sống hội sinh được với các
loài Hải quì? Các xúc tu của Hải quì có thể gây tê liệt cho tất cả những loài cá
khác, nhưng cá Khoang Cổ lại có thể sống chung với chúng và có thể ngủ trong
hải quì vào ban đêm [Hà Lê Thị Lộc (2004) trích từ Mebs, 1994; Eschmeyer,
1998]. Hai nhân tố đóng góp vào vào sự “miễn dịch” của cá đó là tập tính bơi nhấp
nhô rất đặc trưng kết hợp với những hóa chất đặc biệt chứa trong lớp màng nhầy
bên ngoài da giúp cá đề phòng sức đốt của những tế bào gây tê liệt nhỏ li ti hiện
diện trên bề mặt của những xúc tu Hải quì (gọi là nematocyst). Theo Allen (1972),

Fautin (1991), Guiter (1996) và Lubbock (1980) nghiên cứu thấy rằng lớp màng
nhầy của cá Khoang Cổ
A. clarkii
dày hơn gấp 3 – 4 lần những loài cá cùng họ
nhưng không hội sinh với Hải quì. Thành phần hóa sinh cũng khác nhau giữa hai
loại chất nhầy. Chất nhầy bảo vệ được những loài cá khác sản sinh ra không có sự
hiện diện của chất đặc biệt như trong lớp nhầy của cá Khoang Cổ. Chất nhầy này
bao gồm một số lượng lớn Glucoprotein chứa trong polysaccharide. Vì vậy, những
tế bào gây tê liệt chỉ phóng thích độc tố sau một quá trình nhận dạng loại chất nhầy
này như một kích thích cơ học. Mebs (1994) nghiên cứu thấy rằng độc tố của Hải
quì có thể gây giảm lượng hồng cầu trên cơ thể người, chúng tác động lên các tơ
mang của cá và với liều lượng 0.5 ug/mL nước sẽ gây chết những loài cá khác sau
2 giờ. Theo De Crespigny (1869) cho thấy rằng, cá Khoang Cổ khi sống chung
với Hải quì thì các xúc tu của Hải quì có thể tách bỏ bọn ký sinh ngoài da nhờ
những chất gây tê liệt hiện diện trên các xúc tu của chúng [Trích từ Hà Lê Thị
Lộc, 2004].
Sự sinh trưởng của cá Khoang Cổ khác nhau tùy từng loài và ngay những cá
thể trong cùng một loài cũng có sự khác biệt. Tốc độ tăng trưởng nhanh nhất đã
được ghi lại đối với giai đoạn cá còn non và tiền trưởng thành (Ochi, 1986). Phổ
thức ăn của cá Khoang Cổ Đỏ là rất rộng, thức ăn được dùng có thể là thức ăn
của cá nước ngọt như:
Daphnia
,
Artemia
, trùng chỉ, luân trùng (
Rotifer
), cá con,
tôm biển, tảo, rong biển, nhuyễn thể (tươi, đông lạnh). Vì vậy, việc cung cấp và
tập luyện cho cá ăn những thức ăn đầy đủ chất bổ dưỡng và hợp với tập tính theo
từng chủng loại của chúng là rất cần thiết, giúp cho chúng tăng trưởng và thích

nghi tốt trong môi trường nuôi.
3.2. Giá trị kinh tế
Trung bình mỗi năm nước ta xuất khẩu cá cảnh được 5 triệu USD, nhưng
trong đó cá cảnh biển chỉ chiếm khoảng 10%. Đây là con số quá khiêm tốn so với
tiềm năng và thực lực của chúng ta.
Cá Khoang Cổ ít có giá trị về mặt thực phẩm, nhưng nhờ sự đa dạng,
phong phú về màu sắc và có khả năng thích nghi cao trong điều kiện nuôi
nhân tạo nên những loài cá này đã được phát triển nuôi khá phổ biến ở qui mô
gia đình và trong các khu du lịch, giải trí
Với những đặc điểm nổi bật của cá Khoang Cổ Đỏ mà chúng có thị trường
xuất khẩu rất lớn trên thế giới. Vì mục đích kinh tế đã dẫn đến việc khai thác
chúng ngày càng gia tăng. Vấn đề đặt ra cho các nhà khoa học là phải cho sinh
sản nhân tạo thành công để góp phần bảo vệ nguồn sinh vật biển nói chung và cá
Khoang Cổ Đỏ nói riêng. Song việc sinh sản nhân tạo lại gặp một số vấn đề khó
khăn, trong đó khả năng mắc bệnh trong điều kiện nhân tạo rất dễ xảy ra khi đời
sống của chúng bị thiếu Hải quì. Do đó, việc tăng cường khả năng kháng bệnh
cho cá trong điều kiện sinh sản nhân tạo là rất quan trọng. Sử dụng Beta - 1,3/1,6
glucan (Chất kích thích hệ miễn dịch) cho cá đã được nhiều nhà khoa học trên
thế giới nghiên cứu và đã có hiệu quả nhất định đối với một số đối tượng thủy
sản. Vì vậy, việc nghiên cứu thử nghiệm dùng chất kích thích hệ miễn dịch để
nâng cao tỷ lệ sống và sức khỏe cho loài cá này là nội dung cần thiết.

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ ngày 30 – 08 – 2007 đến 11 – 2007 tại trại
Thực nghiệm phòng CNNT Viện Hải dương học, Nha Trang, Khánh Hòa.
Nguồn cá Khoang Cổ Đỏ dùng cho thí nghiệm là giống sản xuất nhân tạo
từ trại Thực nghiệm của phòng CNNT, Viện Hải dương học.
Chất kích thích hệ miễn dịch dùng trong thí nghiệm này là dung dịch TĐK
-100 chứa 92% Beta -1,3/1,6 glucan (Sản phẩm của công ty TNHH SX & TM
Văn Minh AB).
Vi khuẩn dùng gây cảm nhiễm là
Vibrio alginolyticus
được phân lập và lưu
giữ tại Phòng Bệnh, Viện Nghiên cứu NTTS III- Nha Trang – Khánh Hòa.
2. Bố trí thí nghiệm
Nước biển đư
ợ
c
lọc qua hệ thống lọc cơ học, để lắng trong bể chứa, xử lý
bằng ChlorineB 30ppm, phơi nắng từ 3 – 4 ngày trước khi sử dụng, dư lượng
Chlorine được trung hoà bằng Thiosunfatnatri.

•
Thí nghiệm 1: cá từ 3 ngày tuổi

Cá Khoang Cổ Đỏ 3 ngày tuổi có kích thước từ 5 - 6 mm được nuôi trong các
bể kính có thể tích 15L/bể. Các bể nuôi đều được xi phông, thay nước hàng ngày và
cho ăn
Artemia
với mật độ 2-3cá thể/mL. Cá được chia ngẫu nhiên làm 4 lô riêng biệt,
mỗi lô gồm 3 bể lặp lại với mật độ 40 cá thể/bể: Lô đối chứng không được xử lý
Beta glucan; ba lô xử lý được tắm trong dung dịch Beta - 1,3/1,6 glucan với các nồng
độ khác nhau. Phương pháp tắm được dựa theo liệu trình dùng cho tôm kết hợp
với tài liệu tham khảo (Selvaraj et al, 2005): định kỳ 5 ngày/lần, ba lô xử lý được
tắm trong dung dịch Beta - 1,3/1,6 glucan trong thời gian 5 giờ với nồng độ là 18,4
ppm, 184 ppm và 920 ppm.
Tỷ lệ sống của các lô cá được theo dõi hàng ngày. Sau 25 ngày thí nghiệm,
mẫu cá được thu 6 con/lô và bảo quản ở nhiệt độ -20
o
C cho đến khi phân tích hàm
lượng đạm tổng số của toàn bộ cơ thể cá.
Gây cảm nhiễm cho cá được áp dụng theo phương pháp của Magarinos et
al (1995) có điều chỉnh trên cơ sở các kết quả thử nghiệm ban đầu: các lô cá
được gây nhiễm bằng cách đưa dung dịch vi khuẩn
Vibrio alginolyticus
vào bể
nuôi với nồng độ 10
4
CFU/mL (CFU: Colony Form Unit). Sau khi gây cảm
nhiễm, cho cá ăn
Artemia
hàng ngày nhưng không xi phông thay nước. Tỷ lệ chết

của cá được theo dõi hàng ngày. Sức đề kháng với vi khuẩn
Vibrio alginoliticus

được xác định trên cơ sở tỷ lệ tử vong lũy tích của cá sau ba tuần gây cảm nhiễm.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 như sau:




Hình 1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của Beta-1,3/1,6 glucan lên tỷ lệ
sống, hàm lượng đạm tổng số và sức đề kháng cá Khoang Cổ Đỏ từ 3 ngày tuổi.


Tắm β-glucan
(18.4ppm–5
h
)

Tắm β-glucan
(184ppm–5
h
)

Tắm β-glucan
(920ppm–5
h
)

Đối chứng

Cá từ 3 ngày
tuổi

Nuôi dưỡng cá trong bể kính thể tích 15L/bể với mật độ 40 con/bể; mỗi lô 3 bể lặp

lại, cùng chế độ chăm sóc. Sau 25 ngày xác định tỷ lệ sống, hàm lượng đạm trong
toàn bộ cơ thể cá
Cảm nhiễm cá với vi khuẩn
Vibrio alginolyticus
ở nồng độ ban đầu là 10
4

CFU/mL. Theo dõi trong 3 tu
ần.

Xác định tỷ lệ sống và
h
ệ số bảo vệ t
ương đ
ối.

Kết luận

•
Thí nghiệm 2: cá 1 tháng tuổi
Cá Khoang Cổ Đỏ 1 tháng tuổi có kích thước trung bình là 19.33 mm được
nuôi trong các bể kính có thể tích 15L/bể. Các bể nuôi đều được xi phông, thay nước
hàng ngày và cho ăn
Artemia
với mật độ 2-3 cá thể/mL. Cá được chia ngẫu nhiên làm
4 lô riêng biệt, mỗi lô gồm 3 bể lặp lại với mật độ 17 cá thể/bể: Lô đối chứng không
được xử lý Beta glucan; lô cho ăn
Artemia
làm giàu bằng dung dịch Beta - 1,3/1,6
glucan liên tục trong 2 tuần và một tuần ăn

Artemia
không làm giàu; hai lô xử lý bằng
phương pháp tắm với dung dịch Beta - 1,3/1,6 glucan với các nồng độ khác nhau
(phương pháp cho ăn và tắm đều dựa theo liệu trình dùng cho tôm kết hợp với tài
liệu tham khảo của Selvaraj et al, 2005) và kết quả thử nghiệm ban đầu: định kỳ
7 ngày/lần, hai lô cá được tắm 30 phút trong dung dịch Beta 1,3/1,6 glucan với
nồng độ là 184 ppm và 552 ppm. Tỷ lệ sống của cá được theo dõi hàng ngày. Tốc
độ tăng trưởng của cá được kiểm tra định kỳ hàng tuần.
Sau ba tuần thí nghiệm, cá được thu 6 con/lô và bảo quản ở nhiệt độ -20
0
C
cho đến khi phân tích hàm lượng đạm tổng số của toàn bộ cơ thể cá.
Gây cảm nhiễm cho cá cũng được áp dụng theo phương pháp của
Magarinos et al (1995) như thí nghiệm 1 nhưng với nồng độ vi khuẩn
V.
alginolitycus
là 10
6
CFU/mL. Sau khi gây cảm nhiễm cho cá ăn
Artemia
hàng
ngày nhưng không xi phông thay nước. Tỷ lệ chết của cá được theo dõi hàng
ngày. Sức đề kháng với vi khuẩn
Vibrio alginoliyicus
được xác định trên cơ sở tỷ
lệ tử vong lũy tích của cá sau ba tuần gây cảm nhiễm. Cá sống sót sau 3 tuần gây
nhiễm được thu mẫu để xác định các loại vi khuẩn có mặt trong mẫu cá.
•
Phương pháp cho ăn Beta – 1,3/1,6 glucan.
Dung dịch làm giàu được chuẩn bị bằng cách pha 0.4 mL dung dịch TĐK-

100 trong 8 L nước biển lọc sạch (tương đương nồng độ 46 ppm), khuấy đều và
sục khí mạnh.
Artemia
được ấp nở bằng cách ngâm trứng nghỉ
Artemia
trong nước
ngọt từ 20 đến 30 phút sau đó rửa sạch và đưa vào nước biển có sục khí mạnh với
liều lượng 1g/L. Sau 24 đến 30 giờ, tắt sục khí 15 đến 20 phút để vỏ nổi lên bề
mặt, thu
Nauplius
của
Artemia
đưa vào dung dịch làm giàu với mật độ từ 40 – 50
ấu trùng/mL. Thời gian làm giàu ít nhất là 2 giờ trước khi cho cá ăn.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 được thể hiện ở Hình 2



Hình 2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của Beta-1,3/1,6 glucan lên sinh trưởng, tỷ lệ
sống, hàm lượng đạm tổng số và sức đề kháng của cá Khoang Cổ Đỏ từ 1 tháng tuổi.

TĂ làm giàu β-
glucan (46ppm)

Tắm β-glucan
(184ppm–1/2
h
)

Tắm β-glucan
(552ppm–1/2
h
)

Đối chứng

Cá từ 1 tháng
tuổi

Nuôi dưỡng cá trong bể kính thể tích 15L/bể với mật độ 17 con/bể; mỗi lô 3 bể lặp lại,
cùng chế độ chăm sóc. Sau 21 ngày xác định tỷ lệ sống, sinh trưởng, hàm lượng đạm
tổng số của toàn bộ cơ thể cá.
Cảm nhiễm với vi khuẩn
Vibrio alginolyticus
ở nồng độ ban đầu là 10
6
CFU/mL.
Theo dõi trong 3 tu
ần.

Xác định tỷ lệ sống và
h
ệ số bảo vệ t
ương đ
ối.

Kết luận

Thu m

ẫ
u cá
để
xác
đị
nh
s
ự
có m
ặ
t các vi khu
ẩ
n.