đề tài nuôi cấy và phân lập vi khuẩn salmonella

NHÓM 2
NHÓM 2
1
1
BÁO CÁO
BÁO CÁO
Chuyên đề:
Chuyên đề:
NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP
NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP
VI KHUẨN SALMONELLA
VI KHUẨN SALMONELLA
2
2
Hình ảnh vi khuẩn Salmonella
Hình ảnh vi khuẩn Salmonella
3
3
1. Đặc điểm vi khuẩn
1. Đặc điểm vi khuẩn
2. Đặc tính sinh lý
2. Đặc tính sinh lý
3. Đặc tính sinh hóa
3. Đặc tính sinh hóa
4. Phương pháp phân lập
4. Phương pháp phân lập
5. Thử nghiệm và cách nhận
5. Thử nghiệm và cách nhận
biết
biết
4

4
1. Đặc điểm vi khuẩn
1. Đặc điểm vi khuẩn
Giống
Giống
Salmonella
Salmonella
có khoảng 2300 serotype và
có khoảng 2300 serotype và
thuộc họ
thuộc họ
Enterobacteriacaea
Enterobacteriacaea
.
.
Salmonella
Salmonella
spp. có
spp. có
những đặc điểm sau: Gram âm, hình que, kỵ khí
những đặc điểm sau: Gram âm, hình que, kỵ khí
tùy nghi, với đường kính khoảng 0,7-1,5
tùy nghi, với đường kính khoảng 0,7-1,5
micromet
micromet
, dài 2-5 micromet, và
, dài 2-5 micromet, và
roi
roi
mà cấp theo

mà cấp theo
mọi hướng. Di động bằng tiên mao nhưng những
mọi hướng. Di động bằng tiên mao nhưng những
dạng đột biến có thể không di động và có một
dạng đột biến có thể không di động và có một
serotype (Gallinarum) là không di động.
serotype (Gallinarum) là không di động.
5
5
1. Đặc điểm vi khuẩn
1. Đặc điểm vi khuẩn
Các chủng
Các chủng
Salmonella
Salmonella
tạo acid từ glucose và
tạo acid từ glucose và
mannitol nhưng không tạo acid từ saccharose
mannitol nhưng không tạo acid từ saccharose
và lactose. Chúng không tạo indol và không
và lactose. Chúng không tạo indol và không
phân cắt urea. Phần lớn các chủng sinh H
phân cắt urea. Phần lớn các chủng sinh H
2
2
S và
S và
có enzyme Lysine decarboxylase và Ornithine
có enzyme Lysine decarboxylase và Ornithine
decarboxylase.

decarboxylase.
6
6
1. Đặc điểm vi khuẩn
1. Đặc điểm vi khuẩn
Giống
Giống
Salmonella
Salmonella
được chia thành nhiều
được chia thành nhiều
serotype theo xếp loại của Kauffmann-White,
serotype theo xếp loại của Kauffmann-White,
dựa theo kháng nguyên thân (somatic) O và
dựa theo kháng nguyên thân (somatic) O và
kháng nguyên H (flagella). Một số serotype như
kháng nguyên H (flagella). Một số serotype như
Enteritidis, Typhi, Paratyphi và Typhimurium
Enteritidis, Typhi, Paratyphi và Typhimurium
được xếp loại theo phage.
được xếp loại theo phage.
7
7
2. Đặc tính sinh lý
2. Đặc tính sinh lý
- Kém đề kháng với điều kiện bên ngoài, bị phá
- Kém đề kháng với điều kiện bên ngoài, bị phá
huỷ bởi quá trình tiệt trùng bằng phương pháp
huỷ bởi quá trình tiệt trùng bằng phương pháp
Pasteur & đun nấu kỹ.

Pasteur & đun nấu kỹ.
- Tuy nhiên Samonella có thể sống sót trong thời
- Tuy nhiên Samonella có thể sống sót trong thời
gian dài ở các thực phẩm khô & ướp lạnh, do đó
gian dài ở các thực phẩm khô & ướp lạnh, do đó
khi làm tan thực phẩm đông lạnh vi khuẩn này
khi làm tan thực phẩm đông lạnh vi khuẩn này
dễ phát triển lại.
dễ phát triển lại.
8
8
- Sức đề kháng yếu: sống sót kém ở pH < 5, và
- Sức đề kháng yếu: sống sót kém ở pH < 5, và
chết ở 60OC trong vòng 20 phút, 700C trong 2
chết ở 60OC trong vòng 20 phút, 700C trong 2
phút và 850C trong 1 giây, dưới ánh sáng 5h
phút và 850C trong 1 giây, dưới ánh sáng 5h
chết. Sự đóng băng có thể làm giảm số lượng vi
chết. Sự đóng băng có thể làm giảm số lượng vi
khuẩn nhưng Salmonella có thể còn tồn tại trong
khuẩn nhưng Salmonella có thể còn tồn tại trong
thời gian rất dài ở các thực phẩm đã đóng băng
thời gian rất dài ở các thực phẩm đã đóng băng
như thịt, cá.
như thịt, cá.
- Salmonella nhạy cảm với nồng độ muối, nồng
- Salmonella nhạy cảm với nồng độ muối, nồng
độ tối đa cho sự phát triển là 5,3%, ở nồng độ 6-
độ tối đa cho sự phát triển là 5,3%, ở nồng độ 6-
8% vi khuẩn phát triển chậm, ở nồng độ 8-19% vi

8% vi khuẩn phát triển chậm, ở nồng độ 8-19% vi
khuẩn ngừng phát triển
khuẩn ngừng phát triển
.
.
9
9
Salmonella nhạy cảm với nồng độ muối,
Salmonella nhạy cảm với nồng độ muối,
nồng độ tối đa cho sự phát triển là 5,3%, ở
nồng độ tối đa cho sự phát triển là 5,3%, ở
nồng độ 6-8% vi khuẩn phát triển chậm, ở
nồng độ 6-8% vi khuẩn phát triển chậm, ở
nồng độ 8-19% vi khuẩn ngừng phát triển.
nồng độ 8-19% vi khuẩn ngừng phát triển.
10
10
3. Đặc tính sinh hóa
3. Đặc tính sinh hóa
Salmonella có tính ưa ngọt với đường
glucoce
MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
–
Buffered peptone water – BPW
–
Rappaport-Vassiliadis soy peptone broth –
RV Tryptic soy agar
–
TSA
–

Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar
–
Brilliant green phenol red lactose sucrose
agar – BLPS
11
11
- Triple sugar iron agar – TSI
- Triple sugar iron agar – TSI
- Urea broth
- Urea broth
- Lysine decarboxylase broth
- Lysine decarboxylase broth
- BOrnithine decarboxylase broth
- BOrnithine decarboxylase broth
- Mannitol
- Mannitol
- Nước tryptone
- Nước tryptone
- Thuốc thử Kovacs’
- Thuốc thử Kovacs’
- Nước muối sinh lý
- Nước muối sinh lý
12
12
3. Đặc tính sinh hóa
3. Đặc tính sinh hóa
Bảng một số đặc tính sinh hóa của Salmonella
Bảng một số đặc tính sinh hóa của Salmonella
Stt Thử nghiệm hoặc cơ chất
Stt Thử nghiệm hoặc cơ chất

Phản ứng của
Phản ứng của
Salmonella
Salmonella
spp.
spp.
1
1


Glucose (TSI)
Glucose (TSI)
+
+
2
2


H
H
2
2
S (TSI)
S (TSI)
+
+
3
3

Ure
Ure
-
-
4
4


Lysin decarboxylase
Lysin decarboxylase
+
+
5 Ornithine decarboxylase
5 Ornithine decarboxylase
+
+
6 Indole
6 Indole
-
-
7 Mannitol
7 Mannitol
+
+
13
13
4. Phương pháp phân lập
4. Phương pháp phân lập
Giai đoạn phân lập này được thực hiện đồng thời
trên hai môi trường thạch XLD (Xylose lysine

desoxycholate agar) và BPLS (Brilliant green phenol
red lactose sucrose agar). Sau khi ủ 24 + 3, dùng que
cấy vòng lấy sinh khối từ ống RV, cấy ria sang hai môi
trường thạch XLD và BPLS. Lật ngược các đĩa và ủ
trong tủ ủ ở 37.0±1.0
0
C trong 24 + 3 giờ. Sau khi ủ 24 +
3 giờ xem xét sự hiện diện khuẩn lạc điển hình
14
14
4. Phương pháp phân lập
4. Phương pháp phân lập
Trên môi trường XLD: Khuẩn lạc
Trên môi trường XLD: Khuẩn lạc
Salmonella
Salmonella


spp. điển hình có vùng trong, hơi nhuốm đỏ do
spp. điển hình có vùng trong, hơi nhuốm đỏ do
chất chỉ thị màu thay đổi trong môi trường, và
chất chỉ thị màu thay đổi trong môi trường, và
có tâm đen
có tâm đen
Trên môi trường BPLS: Khuẩn lạc
Trên môi trường BPLS: Khuẩn lạc
Salmonella
Salmonella
spp. điển hình hơi trong có màu hơi đỏ trong
spp. điển hình hơi trong có màu hơi đỏ trong

môi trường.
môi trường.
15
15
4. Phương pháp phân lập
4. Phương pháp phân lập
Chú ý.
Chú ý.
Một số lòai Salmonella không có khả
Một số lòai Salmonella không có khả
năng sinh H
năng sinh H
2
2
S như Salmonella Paratyphi A phát
S như Salmonella Paratyphi A phát
triển trên môi trường XLD có màu hồng với tâm
triển trên môi trường XLD có màu hồng với tâm
hồng đậm, Salmonella có lactose dương tính
hồng đậm, Salmonella có lactose dương tính
phát triển trên môi trường XLD có màu vàng có
phát triển trên môi trường XLD có màu vàng có
tâm đen hoặc không đen
tâm đen hoặc không đen
16
16
5. Thử nghiệm và cách
5. Thử nghiệm và cách
nhận biết
nhận biết

PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA
5.1 Triple sugar iron agar (TSI agar)
a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lượng nhỏ
a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lượng nhỏ
sinh khối trên NA, cấy ria trên mặt nghiêng ống
sinh khối trên NA, cấy ria trên mặt nghiêng ống
thạch TSI. Sau đó dùng que cấy nhọn, lấy sinh
thạch TSI. Sau đó dùng que cấy nhọn, lấy sinh
khối đâm sâu xuống đáy ống (tránh chạm đáy). Ủ
khối đâm sâu xuống đáy ống (tránh chạm đáy). Ủ
các ống trong tủ ủ 37,0
các ống trong tủ ủ 37,0
±
±
1
1
0
0
C /24
C /24
+
+
3 giờ.
3 giờ.
17
17
5. Thử nghiệm và cách
5. Thử nghiệm và cách
nhận biết
nhận biết

b) Kết quả: Sự chuyển màu trên TSI sau 24 giờ
b) Kết quả: Sự chuyển màu trên TSI sau 24 giờ
ủ được mô tả như sau
ủ được mô tả như sau
Đáy ống
Đáy ống
Vàng … ………
Vàng … ………
Glucose dương tính
Glucose dương tính
Đỏ
Đỏ
………….
………….
Glucose âm tính
Glucose âm tính
Đen
Đen
…………
…………
Hình thành H
Hình thành H
2
2
S
S
Có bọt khí hoặc nứt mặt thạch do sinh khí từ
Có bọt khí hoặc nứt mặt thạch do sinh khí từ
glucose
glucose

18
18
5. Thử nghiệm và cách
5. Thử nghiệm và cách
nhận biết
nhận biết
Mặt nghiêng
Mặt nghiêng
Vàng ……… Lactose hoặc Sucrose dương tính
Vàng ……… Lactose hoặc Sucrose dương tính
Đỏ ………… Lactose và Sucrose âm tính
Đỏ ………… Lactose và Sucrose âm tính
Ống TSI cấy
Ống TSI cấy
Salmonella
Salmonella
điển hình có mặt
điển hình có mặt
nghiêng kiềm (màu đỏ), đáy ống acid (vàng), có
nghiêng kiềm (màu đỏ), đáy ống acid (vàng), có
khí và 90% có màu đen(H
khí và 90% có màu đen(H
2
2
S được hình thành)
S được hình thành)
19
19
5. Thử nghiệm và cách
5. Thử nghiệm và cách

nhận biết
nhận biết
Chú ý 1.
Chú ý 1.
Khi đọc kết quả ống TSI, không được
Khi đọc kết quả ống TSI, không được
đọc sớm (ví dụ sau 12 giờ ủ) do sẽ cho kết quả
đọc sớm (ví dụ sau 12 giờ ủ) do sẽ cho kết quả
dương tính giả hoặc đường lên men nhưng
dương tính giả hoặc đường lên men nhưng
chưa đủ lượng acid để thay đổi chất chỉ thị pH
chưa đủ lượng acid để thay đổi chất chỉ thị pH
(phenol red). Nếu đọc sau 24 giờ sẽ cho kết quả
(phenol red). Nếu đọc sau 24 giờ sẽ cho kết quả
đỏ/ đỏ sai do vi khuẩn sử dụng peptone làm môi
đỏ/ đỏ sai do vi khuẩn sử dụng peptone làm môi
trường có tính kiềm
trường có tính kiềm
20
20
5. Thử nghiệm và cách
5. Thử nghiệm và cách
nhận biết
nhận biết
Chú ý 2.
Chú ý 2.
Một vi khuẩn sinh H
Một vi khuẩn sinh H
2
2

S có thể tạo ra
S có thể tạo ra
nhiều kết tủa đen (FeS) che khuất màu vàng ở
nhiều kết tủa đen (FeS) che khuất màu vàng ở
đáy ống. Tuy nhiên, nếu đáy ống không có màu
đáy ống. Tuy nhiên, nếu đáy ống không có màu
vàng dù là không thể quan sát được và nên ghi
vàng dù là không thể quan sát được và nên ghi
nhận kết quả như thế
nhận kết quả như thế
21
21
5. Thử nghiệm và cách
5. Thử nghiệm và cách
nhận biết
nhận biết
5.2 Urea broth
a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lượng
nhỏ sinh khối trên TSA, chuyển sang ống môi
trường lỏng ure. Ủ các ống trong tủ ủ 37.0 ±
1.0
0
C /24 + 3 giờ. Nếu phản ứng dương tính, sự
phân cắt ure giải phóng NH
3
làm thay đổi màu
của phenol-red sang hồng kế đó là đỏ hồng.
Phản ứng thường rõ ràng sau 2-4 giờ
22
22

5. Thử nghiệm và cách
5. Thử nghiệm và cách
nhận biết
nhận biết
b) Kết quả: Dương tính khi màu đỏ hồng khắp
b) Kết quả: Dương tính khi màu đỏ hồng khắp
cả ống (
cả ống (
Proteus mirabilis, Proteus vulgaris,
Proteus mirabilis, Proteus vulgaris,
Morganella morganii, Providencia rettgeri).
Morganella morganii, Providencia rettgeri).
Âm
Âm
tính khi môi trường không đổi màu.
tính khi môi trường không đổi màu.
Chú ý 1.
Chú ý 1.
Tiến hành thử nghiệm song song với
Tiến hành thử nghiệm song song với
mẫu đối chứng âm (không có ure) để loại trừ
mẫu đối chứng âm (không có ure) để loại trừ
trường hợp NH
trường hợp NH
3
3
do thủy phân protein mà ra
do thủy phân protein mà ra
23
23

5. Thử nghiệm và cách
5. Thử nghiệm và cách
nhận biết
nhận biết
Chú ý 2.
Chú ý 2.
Proteus vulgaris
Proteus vulgaris
và
và
Proteus mirabilis
Proteus mirabilis


cho phản ứng dương tính sau khoảng 8 giờ
cho phản ứng dương tính sau khoảng 8 giờ
Chú ý 3.
Chú ý 3.
Phản ứng âm tính giả có thể xảy ra
Phản ứng âm tính giả có thể xảy ra
nếu lượng NH
nếu lượng NH
3
3
quá ít không thể thay đổi nồng
quá ít không thể thay đổi nồng
độ ion H
độ ion H
+
+

của hệ đệm, do đó không làm chất chỉ
của hệ đệm, do đó không làm chất chỉ
thị pH thay đổi màu hoặc một vi khuẩn nào đó
thị pH thay đổi màu hoặc một vi khuẩn nào đó
có thể thủy phân Ure nhưng không thể sử dụng
có thể thủy phân Ure nhưng không thể sử dụng
NH
NH
3
3
như nguồn Nitơ, sự sinh trưởng không xảy
như nguồn Nitơ, sự sinh trưởng không xảy
ra
ra
24
24
5. Thử nghiệm và cách
5. Thử nghiệm và cách
nhận biết
nhận biết
5.3 Lysin decarboxylation và Ornithin
5.3 Lysin decarboxylation và Ornithin
decarboxylase
decarboxylase
a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lượng
a) Thực hiện: Dùng que cấy vòng, lấy lượng
nhỏ sinh khối trên TSA ống nghiệm chứa
nhỏ sinh khối trên TSA ống nghiệm chứa
khoảng 5 ml môi trường Lysin decarboxylation
khoảng 5 ml môi trường Lysin decarboxylation

và ống nghiệm chứa khoảng 5 môi trường
và ống nghiệm chứa khoảng 5 môi trường
Ornithine decarboxylation. Sau khi cấy, phủ lên
Ornithine decarboxylation. Sau khi cấy, phủ lên
trên một lớp mỏng dầu khóang. Ủ các ống
trên một lớp mỏng dầu khóang. Ủ các ống
trong tủ ủ 37.0
trong tủ ủ 37.0
±
±
1.0
1.0
0
0
C /24
C /24
+
+
3 giờ
3 giờ
25
25