nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và lên men vi khuẩn bacillus thu sinh khối nhằm sản xuất chế phẩm probiotic thủy sản

i

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Duy, ThS.
Khúc Thị An, Ths. Nguyễn Kim Cúc, đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh
nghiệm và động viên tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài này.
Cô Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm, đã giúp đỡ và tạo mọi
điều kiện cho tôi có thể thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm thực hành một cách tốt
nhất.
Xin cảm ơn các quý thầy, cô trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận
tình giúp đỡ, giảng dạy, truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập, để tôi có thể
tích lũy được kiến thức để thực hiện được đồ án, và xa hơn là phục vụ cho những
chặng đường tiếp theo sau khi rời ghế nhà trường
Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn lớp, 50Sh, 50MT, 50 TP2, các anh, chị cao
học, anh Nguyên, anh Đảm, chị Xuân, và tất cả các anh chị, các bạn, cùng thực hiện đề
tài với tôi tại phòng thí nghiệm, đã cùng chia sẻ bao nhiêu buồn vui của việc làm đề tài
và hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua.
Cuối cùng, cho tôi được gửi lời cảm ơn đến ba mẹ tôi, đã hỗ trợ tôi về mặt tinh
thần, cho tôi lời khuyên cũng như san sẻ gánh nặng cho tôi trong 4 năm học và thực
hiện đề tài.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn vì sự quý báu đó !





ii


LỜI CẢM ƠN i
DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii
MỞ ĐẦU ix
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
1.1. Tổng quan về Bacillus 1
1.1.1. Đặc điểm chung về Bacillus 1
1.1.2. Những ứng dụng của Bacillus 1
1.2. Tổng quan về Probiotic trong nuôi trồng thủy sản 3
1.2.1. Khái niệm probiotic 3
1.2.2. Lịch sử nghiên cứu Probiotic trong nuôi trồng thủy sản 3
a/ Lịch sử nghiên cứu về probiotic 3
b/ Lịch sử nghiên cứu probiotic trong nuôi trồng thủy sản 4
1.2.3. Ứng dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản 6
1.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm trong nuôi trồng
thủy sản. 7
1.3.1. Ở Việt Nam 8
1.3.2. Trên thế giới 8
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
2.1. Vật liệu 11
2.1.1. Chủng vi sinh vật 11
2.1.2. Môi trường hóa chất chuyên dụng 11
2.1.3. Thiết bị chuyên dụng 15
iii

2.2. Phương pháp nghiên cứu 15
2.2.1. Nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật 15
2.2.2. Xác định khả năng sinh trưởng 16
2.2.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn 17
2.2.4. Xác định đặc điểm hình thái 19
2.2.5. Định danh vi khuẩn 19

2.2.6. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 20
a/ Bố trí thí nghiệm thay thế nguồn cacbon 20
b/ Bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn nitơ thay thế 21
c/ Bố trí thí nghiệm khảo sát giá trị pH thích hợp 21
d/ Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ muối thích hợp 22
e/ Bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 22
2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện lên men trong hệ thống lên men tự động
BIO FLO 110 22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
3.1. Xác định khả năng sinh trưởng 23
3.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn 25
3.3. Mô tả đặc điểm hình thái 27
3.4. Định danh chủng B 3.7.1 31
3.5. Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp 33
3.5.1. Khảo sát thay thế nguồn cacbon 33
3.5.2. Khảo sát nguồn nitơ thay thế 33
3.5.3. Khảo sát pH thích hợp 34
3.5.4. Kết quả khảo sát nồng độ muối thích hợp 34
3.5.5. Kết quả khảo sát nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 36
iv

3.6. Khảo sát lên men của chủng B 3.7.1 trên hệ thống BIO FLO 110 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39
Tài liệu tham khảo 40

v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Ảnh đại diện Bacillus 1
Hình1.2 . Bào tử Bacillus 1

Hình 2.2.1. Sơ đồ xác định khả năng sinh trưởng 18
Hình 2.2.2. Các bước xác định hoạt tính kháng khuẩn 19
Hình 2.2.3. Đo kích thước vòng kháng 20
Hình 2.2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn cacbon thay thế 22
Hình 2.2.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát nguồn nitơ thay thế 23
Hình 3.1.1. Đường cong sinh trưởng của chủng B 3.10.1 25
Hình 3.1.2. Đường cong sinh trưởng của chủng B 3.10.2 25
Hình 3.1.3. Đường cong sinh trưởng của chủng B 3.7.1 26

Hình 3.1.4. Đường cong sinh trưởng của chủng B 3.7.4 26
Hình 3.2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của B3.7.1 và B3.10.1 đối với Vibrio V1.1 27
Hình 3.2.2. Hoạt tính kháng khuẩn của B 3.7.4 và B 3.10.2 đối với Vibrio V1.1 27
Hình 3.2.3. Hoạt tính kháng khuẩn của B 3.7.1 và B 3.10.1 đối với Vibrio V3.3 28
Hình 3.2.4. Hoạt tính kháng khuẩn của B 3.7.4 và B 3.10.2 đối với Vibrio V3.3 28
Hình 3.3.1. Khuẩn lạc chủng B 3.7.1 30
Hình 3.3.2. Tế bào chủng B 3.7.1 nhuộm Gram 30
Hình 3.3.3. Khuẩn lạc chủng B 3.7.4 31
Hình 3.3.4. Tế bào chủng B 3.7.4 nhuộm Gram 31
Hình 3.3.5. Khuẩn lạc chủng B 3.10.1

32
Hình 3.3.6. Tế bào chủng B 3.10.1 nhuộm Gram 32
Hình 3.3.7. Khuẩn lạc chủng B 3.10.2 33
Hình 3.3.8. Tế bào chủng B 3.10.2 nhuộm Gram 33
Hình 3.4.1. Trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng B3.7.1 34
Hình 3.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng của các chủng thử nghiệm
36
Hình 3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của các chủng thử nghiệm 37
vi

Hình 3.5.3. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng thử nghiệm 37
Hình 3.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.7.1 38
Hình 3.5.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.7.4 38
Hình 3.5.6. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.10.1 39
Hình 3.5.7. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến chủng B3.10.2 39
Hình 3.5.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng của 2 chủng B 3.7.4 và B
3.10.2 40
Hình 3.5.9. Khảo sát lên men chủng B 3.7.1 trên hệ thống BIO FLO 110 40
vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kích thước vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus với các chủng Vibrio
29
Bảng 3.2. So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng Bacillus sp. B3.7.1 với các
trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST 35


viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Viết đầy đủ
1 FAO
Food and Agriculture Organization – Tổ chức Nông
Lương Liên Hợp Quốc
2 WHO World Health Organizatin – Tổ chức Y tế thế giới
3 Ct Công thức tính lượng dịch hoạt hóa
4 OD Optical Density (Mật độ quang)
5 TSB Trypticase Soy Broth
6 LB Luria Broth

7 T Kết quả thời gian nuôi khảo sát
8 NTTS Nuôi trồng thủy sản
ix

MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của đề tài
Ở nước ta hiện nay, nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản là một trong những tiềm
năng và thế mạnh, năm 2010 tổng sản lượng nuôi 2.7 triệu tấn, diện tích nuôi đạt
1.110.000 ha, sản lượng đạt 3,1 triệu tấn (theo thống kê của Tổng cục Thủy sản). Tuy
nhiên, trong ngành nuôi trồng thủy sản, mỗi năm cũng gặp rất nhiều khó khăn và thiệt
hại, gây tổn thất lớn cho người nuôi do vấn đề về dịch bệnh trên thủy sản gây ra.
Hầu hết người nuôi thường sử dụng các loại hóa chất khử trùng hoặc kháng sinh
để phòng bệnh. Tuy nhiên hiệu quả của phương pháp này không cao, đồng thời còn
gây ảnh hưởng đến môi trường. Nguy hiểm hơn nếu lạm dụng chất kháng sinh sẽ gây
ra dư lượng kháng sinh trong sản phẩm và hiện tượng kháng kháng sinh của các vi
khuẩn gây bệnh trên thủy sản. Vì vậy, việc tìm ra một giải pháp thích hợp để giải quyết
vấn đề này là rất quan trọng.
Trên thị trường thuốc và chế phẩm nuôi trồng thủy sản của nước ta những năm
gần đây, xuất hiện một cái tên mới được sử dụng, đó là “ Probiotic”. Các chủng vi sinh
vật như là Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp.,
clostridium sp., được sử dụng trong hầu hết các chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi
trồng thủy sản hiện nay. Giúp giảm thiểu những bất lợi do hóa chất gây ô nhiễm môi
trường được sử dụng trong quá trình nuôi, hoặc hạn chế sử dụng các loại kháng sinh vì
có thể gây nhờn thuốc.
Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những
đặc tính probiotic: đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, sinh các enzyme tiêu hóa, phân
hủy các chất hữu cơ thừa … đã được áp dụng. Các chế phẩm sinh học không những
tăng cường khả năng sinh trưởng, khả năng kháng bệnh cho vật nuôi mà còn hạn chế
được tối đa việc sử dụng kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh. Nhiều nhóm vi sinh
vật mang các đặc tính probiotic đã được sử dụng, trong đó có nhóm vi khuẩn Bacillus.

Vì lý do trên, trong khuôn khổ của một luận án tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện
đề tài “Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và lên men vi khuẩn Bacillus thu sinh khối
nhằm sản xuất chế phẩm probiotic thủy sản” là cấp thiết.
Mục tiêu của đề tài: Khảo sát điều kiện nuôi cấy và thu sinh khối của các chủng
Bacillus có khả năng kháng khuẩn, mô tả, định danh các chủng đó, ứng dụng vào sản
xuất chế phẩm probiotic, nhằm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản.
Nội dung thực hiện:
- Xác định đặc điểm sinh trưởng của các chủng Bacillus
x

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng Bacillus với các chủng Vibrio
gây bệnh
- Xác định đặc điểm hình thái của các chủng có hoạt tính probiotic
- Định danh các chủng có hoạt tính probiotic
- Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp của các chủng có hoạt tính probiotic
- Khảo sát điều kiện lên men các chủng có hoạt tính trong hệ thống lên men
BIO FLO 110


Sinh viên thực hiện
1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Bacillus
1.1.1. Đặc điểm chung về Bacillus
Bacillus là vi khuẩn hình que, hay trực khuẩn, thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+),
hiếu khí bắt buộc hoặc kị khí tùy tiện, dinh dưỡng theo kiểu hóa dưỡng hữu cơ, dương
tính với catalase, di động bằng chu mao. Do có khả năng hình thành nội bào tử nên
Bacillus có khả năng kháng nhiệt, kháng điều kiện khô hạn, chịu mặn, chịu chất khử và
các phân tử có hại khác.

Mỗi tế bào Bacillus chỉ sinh ra một bào tử trong điều kiện khắc nghiệt về dinh
dưỡng và điều kiện sống. Bào tử có cấu tạo gồm nhiều lớp, lớp ngoài cùng, lớp áo bào
tử, vỏ bào tử và lớp lõi. Mỗi lớp có cấu tạo và vai trò khác nhau, giúp bào tử có thể
thích nghi với môi trường sống khắc nghiệt.
Phân loại
- Giới: Bacteria
- Ngành: Firmicutes
- Lớp: Bacilli
- Bộ: Bacillales
- Họ: Bacillaceae
- Chi: Bacillus
Các loài đại diện:
Bacillus cereus
Bacillus thuringiensis
Bacillus subtilis
Bacillus anthracis
Bacillus infernus
Bacillus clausii
Bacillus coagulans
Bacillus megaterium…
1.1.2. Những ứng dụng của Bacillus
Bacillus là loài được phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên và rất đa dạng, được
nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong đời sống con người ở nhiều lĩnh vực khác nhau.
Từ sản xuất các sản phẩm truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, trong y-dược,
Hình 1
.1
.
T
ế
bào vi

khuẩn Bacillus
Hình 1.
2
.
Bào t
ử

Bacillus

2

da giầy, xử lý môi trường, trong chăn nuôi thủy sản….Chẳng hạn Bacillus subtilis
được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong sản xuất enzyme ngoại bào (protease),
ứng dụng dùng để thủy phân protein của thịt, cá, được sử dụng nhiều trong các sản
phẩm nước mắm hay các thực phẩm đóng hộp, hoặc dùng trong tách chiết phá vỡ mô
cơ tế bào.
Vào năm 1947 Linderstrom, Lang và Ottesen tại phòng thí nghiệm Carlsberg
(Phadarate và cộng sự,1997), tìm thấy các enzyme thuộc nhóm subtilisin, khi nuôi cấy
chủng B. licheniformis và được đặt tên là subtilisin Carlsberg. Subtilisin, là một nhóm
enzyme protease kiềm (serine protease). Enzyme này có tính đặc hiệu rộng, thủy phân
nhiều loại liên kết peptide, các liên kết ester, nhất là những liên kết được tạo thành từ
các amino acid thơm, cũng như tất cả các serine protease (Govind và cộng sự, 1981),
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp các chất tẩy rửa, thuộc da, và ngay cả
trong y học, do subtilisin có khả năng hoạt động trong phổ pH rộng và nhiệt độ cao.
Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại
chất tẩy rửa, bột giặt, chất làm sạch kính, kem đánh răng, hoặc răng giả. Các enzyme
protease thích hợp sẽ được bổ sung vào chất tẩy thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng,
dễ dàng loại bỏ các vết bẩn do thức ăn, máu và các chất do con người tiết ra. Chất tẩy
rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất năm 1956 với tên BIO-40. Đến
năm 1963, Novo industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên thương mại là BIOTEX

được chiết xuất từ B. licheniformis. Và đến gần đây, tất cả các protease bổ sung vào
chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease được sản xuất từ chủng Bacillus
(Rao và cộng sự, 1998; Thangam và cộng sự, 2002) và chủ yếu là từ B. subtilis. Trên
thế giới, mỗi năm người ta dã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa.
Trong đó có hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor international mỗi năm đã
cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzyme protease (Gupta và cộng sự, 2002).
Trong ngành công nghiệp thuộc da một số công đoạn như ngâm ướt, tẩy lông,
làm mềm da và thuộc da. Thông thường các phương pháp thuộc da thường dùng các
hóa chất độc hại như natri sulfide, làm ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến môi trường khi
nước thải của nhà máy này thải ra song. Việc sử dụng enzyme để thay thế các hóa chất
đã giúp nâng cao chất lượng, làm giảm ô nhiễm và giảm chi phí sản xuất khi phải sử lý
môi trường. Protein là một thành phần cơ bản của da và lông nên protease đã được sử
dụng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi
fibin như albumin, globulin trong quá trình thuộc da (Christner, 1996; Varela và cộng
sự, 1997; Thangam và cộng sự, 2002). Ngoài ra còn có rất nhiều nghiên cứu và ứng
dụng khác của Bacillus trong các lĩnh vực khác vẫn chưa được đề cập và nghiên cứu,
điều này cho thấy tiền năng rất lớn của Bacillus nói chung hay vi sinh vật nói riêng đối
với con người.
3

Một ví dụ nữa cho việc của Bacillus đó chính là sử dụng trong sản xuất thuốc
trừ sâu sinh học, chủng vi sinh vật thông dụng nhất được sử dụng để sản xuất là chủng
Bacillus thuringiensis, bản chất là việc sử dụng độc tố ở dạng tinh thể hay bào tử của vi
khuẩn để tiêu diệt sâu bọ và côn trùng có hại. Bacillus thuringiensis lần đầu tiên được
phát hiện vào năm 1901 tại Nhật Bản bởi nhà sinh vật học Shigente Ishiwarti, khi ông
tìm ra nguyên nhân gây ra cái chết đột ngột của một số sâu tơ. Ông là người đầu tiên
phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis, và gọi đó là Bacillus sotto. Năm 1911,
Bernard người Đức, tìm thấy trong một xưởng bột mì ở Thuringia, một giống vi khuẩn
ký sinh trong cơ thể côn trùng, có sức trừ sâu rất mạnh, gọi là khuẩn Thuring. 1971,
chế phẩm Bacillus thuringiensis đã được nghiên cứu và sử dụng và phát triển cho tới

ngày nay.
1.2. Tổng quan về Probiotic trong nuôi trồng thủy sản
1.2.1. Khái niệm probiotic
Theo nghĩa gốc, từ “probiotics” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa là
“Cho cuộc sống”. Tuy nhiên, theo thời gian định nghĩa này cũng đã phát triển. LiLy
và Stillwell (1965) đã mô tả “Probiotics” như một hỗn hợp được tạo thành bởi một
động vật nguyên sinh có khả năng thúc đẩy sự phát triển của sinh vật khác. Sau đó định
nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm 1970, đó là “ probiotics”
cũng bao gồm cả dịch chiết tế bào có khả năng thúc đẩy sự phát triển của vi sinh vật
(Gomes và Malcata, 1999). Năm 1974 Parker đã áp dụng khái niệm này khi bổ sung
vào trong thức ăn của gia súc và nhận thấy ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ khi sử
dụng nó thông qua việc góp phần vào sự cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột của gia súc.
Vì vậy, khái niệm “probiotics” được sử dụng để mô tả “cơ quan và chất góp phần tạo
ra khả năng cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột”
Định nghĩa chung này sau đó được định nghĩa chính xác hơn bởi Fuller (1989),
định nghĩa Probiotics như “một chất bổ trợ cho thức ăn chứa vi sinh vật sống mang lại
những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột
của chúng”.
Năm 2001, chuyên gia của FAO và WHO đã định nghĩa về probiotics “là những
cơ thể vi sinh vật sống, khi được đưa vào cơ thể vật chủ với một lượng nhất định sẽ
đem lại lợi ích về sức khỏe cho vật chủ” và đến thời điểm hiện tại, đây vẫn là định
nghĩa được mọi người chấp nhận và sử dụng nhiều nhất.
1.2.2. Lịch sử nghiên cứu Probiotic trong nuôi trồng thủy sản
a/ Lịch sử nghiên cứu về probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser
(1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và tìm thấy trong phân của những đứa trẻ
mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ
khỏe mạnh.
4

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, người từng đạt giải Nobel – đã
chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi
sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-
dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn,
nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được
ông nói đến trong cuốn sách “Sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908).
Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang
tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic.
Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn
lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh. Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa
Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón
thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột
đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp
một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất
ra được. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa
được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái niệm
chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á sau nhiều năm khi các sản phẩm lên men
từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80.
Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus
được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm
chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi.
b/ Lịch sử nghiên cứu probiotic trong nuôi trồng thủy sản
- Các nghiên cứu trong nước
 Ở Việt nam, những nghiên cứu về việc sử dụng men vi sinh để cải thiện
môi trường nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng còn tương đối ít. Trong
những năm gần đây, Bộ Thủy sản đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi
sinh và nhiều nơi đã làm quen với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả
khá tốt.
 Tác dụng của nhóm vi khuẩn probiotic ứng dụng trong sản xuất chế phẩm
sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản được Ts. Nguyễn Văn Duy và cộng sự,

(2011); Lê Thị Bích Phượng và cộng sự, (2003); Lê Tấn Hưng và cộng sự, (2003); Võ
Thị Hạnh và cộng sự, )2004) nghiên cứu và thử nghiệm.
 Những nhóm vi khuẩn probiotic có tềm năng được sử dụng trong sản xuất
chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản là: Lactobacillus, Pseudomonas,
Bacillus, Micrococcus, Moraxella…. Thành phần vi sinh trong NTTS gồm những sản
phẩm chính là sử dụng các nhóm vi sinh vật sống như: : Lactobacillus, Pseudomonas,
Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter…
5

 Các nghiên cứu của Ts.Nguyễn Văn Duy và cộng sự, (2011) cho thấy, các
chủng vi sinh vật thuộc Bacillus có khả năng sinh trưởng và phát triển cạnh tranh và
kháng với các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên đối tượng tôm sú.
 Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự, (2000) tìm hiểu tác
dụng của men vi sinh Bio-dream lên các yếu tố vô sinh và hữu sinh trong ương nuôi ấu
trùng tôm càng xanh với liều lượng 1g/m
3
. Theo như thí nghiệm, so sánh giữa không
sử dụng và sử dụng hàng ngày và sử dụng 10 ngày 1 lần thì việc sử dụng hàng ngày
cho kết quả tốt nhất. Kết quả thử nghiệm ấu trùng chuyển sang tôm bột ở ngày thứ 18,
mật độ vi khuẩn Vibrio tổng số cũng thấp và các yếu tố môi trường cũng luôn giữ được
ổn định.
 Chế phẩm Biochie dùng để xử lý nước nuôi tôm sú giống và tôm thịt tại
Đồ Sơn, Hải phòng và Hà Nội cho kết quả khá tốt, tôm phát triển đồng đều, tăng
trưởng nhanh, tỉ lệ sống cao, giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôi (Võ Thị Thứ và
cộng sự, 2005).
- Các nghiên cứu ngoài nước
 Theo Nair và cộng sự, (1985) vi khuẩn lactic và một số nhóm vi khuẩn có
khả năng tiết ra các chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh như Aeromonas hydrophila và
Vibrio parahaemolyticus.
 Theo nghiên cứu của Foster và cộng sự (1991) sử dụng vi khuẩn phân lập

từ đất PM-4 cho vào môi trường ương nuôi ấu trùng Penaeus monodon, và nhận thấy
ảnh hưởng tốt tới tỉ lệ sống của ấu trùng do chúng có khả năng ức chế mầm bệnh.
 Qiao Zhenguo và cộng sự (1994) nghiên cứu 3 chủng vi khuẩn quang hợp
sử dụng cho nuôi tôm thẻ Trung Quốc ( Penaeus chinensis) dùng cho cải thiện chất
lượng môi trường nước.
 Năm 1995, Gariques và Arevalo đã tóm lược quy trình sản xuất sử dụng
các chủng vi khuẩn probiotic Vibrio alginolyticus điều khiển hệ vi khuẩn trong việc sản
xuất giống tôm Penaeus vannamei ở Ecuador. Chúng làm tăng tốc độ sinh trưởng và tỷ
lệ sống của ấu trùng tôm một cách đặc biệt, do sự cạnh tranh với những vi khuẩn gây
bệnh tiềm tàng. Vì vậy đã giảm nhu cầu thuốc kháng sinh và những chất hóa học dùng
để phòng và trị bệnh.
 Ở Châu Á đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các men vi sinh trong nuôi tôm,
đặc biệt là tại Thái Lan ( Jiravanichpaisial và cộng sự), đã sử dụng Lactobacillus sp.
Trong nuôi tôm sú (Penaeus monodon). Rengpipat và Rukpratanporn cho rằng Bacillus
S11 là vi khuẩn hữu ích có thể bổ sung vào dung dịch giàu hóa Artemia trước khi cho
ấu trùng tôm sú ăn. Kết quả tôm ít bệnh hơn và phát triển nhanh hơn, đạt tỷ lệ sống
100% khi gây cảm nhiễm với V. harveyi, trong khi kết quả đối chứng chỉ đạt 26%.
 Nghiên cứu của Wang Xiang- Hong và cộng sự (1998) cũng cho biết một
số vi khuẩn hữu ích có thể kích thích hoặc ức chế sự phát triển của tảo. Tác giả còn cho
biết thêm những vi khuẩn trong nước sẽ loại trừ nhanh NH
3
, H
2
S, vật chất hữu cơ có
hại. Ngoài ra, chúng còn có thể cân bằng pH trong ao nuôi.
6

1.2.3. Ứng dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản
Một loại probiotic có hiệu quả là phải có khả năng tồn tại và hoạt động trong
một môi trường đa dạng dưới nhiều hình thức khác nhau. Theo Fuller (1989) thì nó cần

phải có những khả năng như sau:
1. Là một sản phẩm sống
2. Không mang mầm bệnh và độc tố
3. Tạo ra các tác dụng có lợi trên vật chủ
4. Có khả năng tồn tại và phát triển trong môi trường ruột của vật chủ
5. Duy trì ổn định và tồn tại lâu dài để được sử dụng sau này trong điều
kiện lưu trữ và điều kiện ngoài hiện trường.
Việc sử dụng vi khuẩn đường ruột có lợi trong thức ăn cho người và động vật
trên cạn đã được biết đến nhiều. Lactobacillus acidophilus được sử dụng phổ biến để
kiểm soát và phòng bệnh do các vi sinh vật mầm bệnh trong ống tiêu hóa của nhiều
động vật trên cạn. Vi khuẩn Lactobacillus rhammosus có trong yaourt giúp tăng khả
năng tiêu hóa và kháng lại vi khuẩn có hại trong đường ruột. Lý thuyết kiểm soát sinh
học đã được áp dụng trong nuôi trồng thủy sản. Nhiều nhà khoa học đã cố gắng sử
dụng một số loại probiotic trong nuôi trồng thủy sản để điều khiển quần thể vi tảo của
nước trong ao, kiểm soát vi sinh vật gây bệnh, để tăng cường sự phân hủy các hợp chất
hữu cơ dư thừa và cải thiện môi trường ao nuôi.
Ngoài ra, việc sử dụng probiotic có thể gia tăng quần thể các sinh vật làm thức
ăn, cải thiện mức dinh dưỡng của các loài thủy sản nuôi và tăng cường khả năng miễn
dịch của vật nuôi với mầm bệnh. Như vậy, định nghĩa của probiotic đối với nuôi trồng
thủy sản được mở rộng, nó bao gồm cả việc bổ sung vi khuẩn sống vào ao nuôi, những
vi khuẩn có lợi này sẽ cải thiện thành phần vi sinh vật của nước và nền đáy nhằm cải
thiện chất lượng nước. Probiotic được giả định là có khả năng tăng cường và cải thiện
sức khỏe của vật nuôi bằng việc loại trừ các mầm bệnh hoặc hạn chế tối đa tác hại của
mầm bệnh. Vi khuẩn probiotic có thể bám vào bề mặt bên ngoài của vật chủ hay đi vào
bên trong ruột hoặc trực tiếp từ nước hoặc qua thức ăn hay qua những hạt có thể tiêu
hóa được. Hơn nữa, sử dụng probiotic sẽ góp phần làm giảm lượng hóa chất, kháng
sinh trong phòng và trị bệnh cho tôm cá.
Probiotic được gọi dưới tên khác nhau như “Chế phẩm vi sinh”, “Vi khuẩn có
lợi” hoặc “Vi sinh vật hiệu quả”, bao gồm các loại vi khuẩn Lactobacillus,
Actinomycetes, Nitrobacteria, vi khuẩn chuyển hóa đạm, Bifidobacterium, nấm men…

Những vi khuẩn hữu ích này có thể cải thiện chất lượng nước nuôi thủy sản và hạn chế
mầm bệnh trong nước, từ đó gia tăng năng suất nuôi trồng.
7

Trong nuôi trồng thủy sản, probiotic được sử dụng như phương tiện kiểm soát
dịch bệnh, bổ sung hoặc trong một số trường hợp thay thế các chất kháng khuẩn. Các
nhóm vi tảo (Tetraselmis), nấm men (Debaryomyces, Phafia và Saccharomyces), vi
khuẩn gram dương (Bacillus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,
Lactococcus, Micrococcus, Streptococcus và Weissella ) và vi khuẩn gram âm
(Aeromonas, Alteromonas, Photorhodobacterium, Pseudomonas và Vibrio) đều được
sử dụng. Tuy nhiên, phương thức hoạt động của probiotic chưa được nghiên cứu đầy
đủ một cách hệ thống.
Theo những công bố gần đây, trong nuôi trồng thủy sản, cơ chế hoạt động của vi
khuẩn probiotic có thể theo các khía cạnh:
1. Cạnh tranh loại trừ vi khuẩn gây bệnh hoặc tạo ra hoạt chất ức chế sự phát triển
của vi khuẩn gây bệnh.
2. Cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết để tăng cường dinh dưỡng cho vật nuôi.
3. Cung cấp men tiêu hóa để gia tăng quá trình tiêu hóa ở vật nuôi
4. Trực tiếp hấp thụ hoặc phân hủy vật chất hữu cơ hoặc chất độc trong nước cải
thiện chất lượng nước.
5. Thay đổi quá trình trao đổi chất của vi khuẩn hoặc có thể gây nên kích thích hệ
miễn dịch của vật chủ.
Những cố gắng để cải thiện quần thể vi sinh vật trong hệ thống nuôi trồng thủy
sản đã được tiến hành cách đây khá lâu bằng việc sử dụng các dòng vi khuẩn có
lợi.Vadstein và cộng sự, (1993) cho rằng bổ sung trực tiếp vi khuẩn chọn lọc là một
biện pháp để kiểm soát quần thể vi khuẩn trong suốt giai đoạn phát triển ấu trùng của
cá biển. Sorgeloos (1994) đề cập đến các vấn đề cấy vi khuẩn hữu ích vào bể, trước khi
thả cá bột, sẽ không những chỉ làm giảm cơ hội cho các vi khuẩn gây bệnh phát triển
mà còn có tác động có lợi khi vi khuẩn hữu ích phát triển trong đường ruột của cá bột.
Việc sử dụng khẩu phần ăn có chứa probiotic có thể có lợi cho các bột khi bị sốc

(stress) do môi trường hay do thao tác. Trong nuôi giáp xác, probiotic cũng đóng một
vai trò đáng kể. Garriques và Arevalo (1995) cho rằng việc sử dụng Vibrio
alginolyticus, được phân lập từ nước biển, đã làm tăng tỉ lệ sống và tốc độ tăng trưởng
của tôm P. vannamei trong trại giống.
Nogami và Maeda (1992) nghiên cứu một dòng vi khuẩn PM-4, phân lập từ ao
nuôi ghẹ, dòng vi khuẩn này đã giảm số lượng Vibrio ssp. trong nước nuôi và Portunus
trituberculatus và làm tăng năng suất ấu trùng ghẹ. Jiravanichpaisal và Chuaychuwong
(1997) sử dụng Lactobacillus sp. trong nuôi tôm sú (P. monodon) để hạn chế bệnh gây
ra bởi nhóm Vibrio và bệnh đốm trắng. Các tác giả đã xác định được hoạt động ức chế
của Lactobacillus sp. trên nhóm Vibrio, E.coli và Staphylococcus sp.
1.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm trong nuôi
trồng thủy sản.
8

1.3.1. Ở Việt Nam
Các nghiên cứu ở Việt Nam đều sử dụng các chủng của Bacillus và kết hợp với
các chủng khác để làm thức ăn thủy sản. Một trong những cơ chế hoạt động của men vi
sinh là các men có tác dụng phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất
hữu cơ đơn giản (Nguyễn Đình Trung và cộng sự, 2004) vi sinh vật thuộc nhóm
Bacillus vừa sử dụng trực tiếp chất hữu cơ trong ao, vừa khử nitrate thành nitơ phân tử
dạng khí thoát ra ngoài, làm giảm muối dinh dưỡng trong ao, hạn chế số lượng tảo, duy
trì độ trong của ao nuôi, khi đạt mật độ lớn, nó sẽ cạnh tranh sử dụng hết thức ăn của
các động vật nguyên sinh, các vi sinh vật có hại cho thủy sản, đặc biệt là Vibrio có hại,
ngăn cản hạn chế sự phát triển của chúng.
Theo nghiên cứu của các tác giả, Phạm Thị Tuyết Ngân và Trương Quốc Phú,
ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus lên chất lượng nước và mùn bã hữu cơ
trong bể nuôi tôm sú đã được nghiên cứu. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức bổ sung 3
loài vi khuẩn Bacillus bao gồm Bacillus B8, B37 và B38 với mật độ 105 CFU/mL và 1
đối chứng (không bổ sung vi khuẩn). Kết quả cho ta thấy hầu hết các chỉ tiêu chất
lượng nước của các nghiệm thức đều nằm trong khoảng cho phép.

1.3.2. Trên thế giới
Theo nghiên cứu của Rengpipat và cộng sư (1998) các chủng Bacillus có khả
năng kháng bệnh cho tôm sú do có thể kích hoạt hệ thống miễn dịch dịch thể và miễn
dịch tế bào tôm sú. Một số tác giả nhận thấy Bacillus có khả năng cô lập vi khuẩn gây
bệnh như Vibrio sp. Một số nghiên cứu trên các đối tượng nuôi trồng thủy sản như:
luân trùng, Artemia, nhuyễn thể, ấu trùng giáp xác, cá… cho thấy Bacillus đã trực tiếp
cung cấp chất dinh dưỡng cho vật nuôi đặc biệt là acid béo và vitamin. Nghiên cứu
khác trên cá hồi chấm hồng bắc cực (Salvelinus alpines L) kết quả cũng cho thấy vi
khuẩn có thể đã có vai trò quan trọng trong quá trình dinh dưỡng của cá. Nghiên cứu
tương tự trên tôm thẻ trưởng thành (Penaeus chinensis) cho thấy hệ vi sinh vật đã cung
cấp nguồn dinh dưỡng và là nguồn thức ăn trực tiếp cho tôm.
Boyd (1996) đã công bố việc thử nghiệm thành công chế phẩm vi sinh gồm các
chủng Bacillus subtilis, Nitrobacter, Pseudomonas, Aerobacter, Cellumonas, và
Rhodopseudomonas. Chế phẩm này làm giảm lượng tảo lam, giảm lượng nitrat, nitrit,
và amoni, photpho hạ, tăng nồng độ oxy hòa ta, tốc độ phân giải các chất hữu cơ tăng
dẫn đến tăng hiệu quả nuôi trồng hải sản.
Foster (1991) đã bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis, và nhận thấy, các enzyme
được làm khô và nghiền nhỏ để phân hủy lượng bùn tích tụ dưới đáy hầm.
Một số nghiên cứu về khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của probiotic.
Nghiên cứu về sử dụng vi khuẩn trộn vào thức ăn trên cá hồi nước ngọt (Rainbow
9

trout), kết quả làm tăng sự đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio thông qua làm tăng
hoạt động thực bào của bạch cầu.
Nghiên cứu của Rengpipat và cộng sự (2000) trên đối tượng tôm sú cũng cho
rằng sử dụng Bacillus sp. (S11) giúp vật nuôi ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus đã
tiết ra các chất làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể. Balcázar
(2003) chứng minh Bacillus làm tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống
chế V. harveyi và virus đốm trắng. Một nghiên cứu khác của Hadi Zokaei và cộng sự
(2009) trộn B.subtilis vào thức ăn tôm thẻ chân trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ

lệ sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ B.subtilis cũng tăng nhanh trong hệ
tiêu hóa của tôm .
Boyd (1996) đã công bố việc thử nghiệm thành công chế phẩm vi sinh gồm các chủng
Bacillus subtilis, Nitrobacter, Pseudomonas, Aerobacter, Cellumonas, và
Rhodopseudomonas. Chế phẩm này làm giảm lượng tảo lam, giảm lượng nitrat, nitrit,
và amoni, photpho hạ, tăng nồng độ oxy hòa ta, tốc độ phân giải các chất hữu cơ tăng
dẫn đến tăng hiệu quả nuôi trồng hải sản.
Foster (1991) đã bổ sung vi khuẩn Bacillus subtilis, và nhận thấy, các enzyme
được làm khô và nghiền nhỏ để phân hủy lượng bùn tích tụ dưới đáy hầm.
Một số nghiên cứu về khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của probiotic.
Nghiên cứu về sử dụng vi khuẩn trộn vào thức ăn trên cá hồi nước ngọt (Rainbow
trout), kết quả làm tăng sự đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio thông qua làm tăng
hoạt động thực bào của bạch cầu.
Nghiên cứu của Rengpipat và cộng sự (2000) trên đối tượng tôm sú cũng cho
rằng sử dụng Bacillus sp. (S11) giúp vật nuôi ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus đã
tiết ra các chất làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể. Balcázar
(2003) chứng minh Bacillus làm tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống
chế V. harveyi và virus đốm trắng. Một nghiên cứu khác của Hadi Zokaei và cộng sự
(2009) trộn B.subtilis vào thức ăn tôm thẻ chân trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ
lệ sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ B.subtilis cũng tăng nhanh trong hệ
tiêu hóa của tôm và mật độ Vibrio giảm.
Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh vi khuẩn có thể tiết vào môi trường chất có
tính sát khuẩn cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng có sẵn trong môi trường. nghiên
cứu của Stein (2005) cho thấy tiềm năng sản sinh chất kháng sinh của Bacillus subtilis
được ghi nhận hơn 50 năm qua. Hiện nay tác giả đã tổng kết có vài trăm dòng vi khuẩn
Bacillus subtilis có khả năng tiết ra hơn 20 loại chất kháng sinh với cấu trúc khác nhau,
10

bao gồm: subtilis, ericin, mersacidin, sublancin, subtilosin, surfactin, iturin,
bacillibactin, bacillmycin, mycosubtilin, fengycin, plipastatin, corynebactin, bacilysin,

difficidin, oxydifficicin, bacilysocin, rhizocticin, amicoumacin, mysobaccillin…Hầu
hết các chất được tiết ra trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trường nước
làm rào cản sự nhân lên của vi khuẩn cơ hội gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Các
chất diệt khuẩn này có thể có tác dụng đơn lẻ hoặc kết hợp nhau.
Sự cạnh tranh chủ yếu xảy ra ở nhóm vi sinh vật dị dưỡng, cạnh tranh cơ chất
hữu cơ, là nguồn carbon và năng lượng. Những nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này
chưa nhiều. Rico-Mora (1998), đã đưa một dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên
môi trường nghèo hữu cơ. Cấy vi khuẩn này vào bể nuôi tảo khuê cùng với Vibrio
alginolyticus, kết quả Vibrio không phát triển. Điều này chứng tỏ vi khuẩn được chọn
lọc cạnh tranh lấn át Vibrio trong điều kiện nghèo hữu cơ.
Verschuere và cộng sự (1999) đã chọn lọc một số dòng vi khuẩn có ảnh hưởng
tốt đến tỉ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng Artemia sau khi nước nuôi đã được lọc
sạch. Kết quả cho thấy chất kìm hãm được tiết ra môi trường có tác dụng chống lại vi
khuẩn gây bệnh V.proteolytics CW8T2. Vì vậy, những dòng vi khuẩn chọn lọc sẽ có ưu
thế trong việc cạnh tranh năng lượng và chất dinh dưỡng.
Tất cả các vi sinh vật đều cần chất sắt cho sinh trưởng (Reid và cộng sự, 1993).
Hiện tượng sản sinh siderophore là hiện tượng vi khuẩn tiết ra chất kết tủa các ion sắt
có trọng lượng phân tử thấp trong môi trường. Các vi sinh vật này sẽ hấp thụ các phân
tử Fe kết tủa này và làm mất Fe trong môi trường. Các vi sinh vật gây bệnh cần nhiều
sắt để tăng trưởng, do vậy dẫn đến hiện tượng cạnh tranh Fe của vi sinh vật trong thủy
vực, kết quả làm hạn chế mầm bệnh trong môi trường (Neilands, 1981; Wooldridge và
cộng sự, 1993).
Những kết quả về tác dụng của Bacillus subtilis C- 3102 (FERM BP- 1096)
cũng đã chứng minh trong việc tăng cân và tăng hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản, gia
cầm, gia súc (Liao, và cộng sự, 1992). Theo nghiên cứu của (Logan và Bartlett, 1998)
việc bổ sung một số lượng nhất định các chủng vi khuẩn Bacillus lentimorbus, Bacillus
stearothermophilus vào hồ nuôi thủy sản tập trung có tác dụng làm tăng sản lượng cá
đến 25%.
11

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Chủng vi sinh vật
Các chủng Bacillus, và Vibrio được lấy từ bộ sưu tập chủng của Phòng thí
nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nha Trang được bảo quản trong 20%
glycerol ở – 70
0
C. Các chủng Bacillus bao gồm 4 chủng B 3.7.1, B 3.7.4, B 3.10.1,
B3.10.2, và 2 chủng Vibrio đối kháng là V1.1 và V3.3.
2.1.2. Môi trường hóa chất chuyên dụng
Môi trường nuôi vi khuẩn
Môi trường TSB
Casein peptone 17 g
Soya peptone 3 g
NaCl 5 g
K
2
HPO
4
4 g
Glucose 2,5 g
Bile Salts 1,5 g
pH 7,4
Môi trường TSA là môi trường TSB bổ sung thêm từ 15 g- 20 g agar.
Môi trường LB
Bacto-tryptone 10 g
12

Yeast extract 5 g

NaCl 10 g
Hòa tan vào trong 800 ml nước cất, điều chỉnh pH= 7.5 sau đó cho đủ thể tích là
1 lít.
 Môi trường khảo sát nguồn carbon và nitơ thay thế
 Môi trường bột đậu nành
Bột đậu nành 2 g
NaCl 2 g
K
2
HPO
4
0,25 g
Glucose 0,25 g
Nước cất 100 ml
 Môi trường bột bắp
Peptone 2 g
NaCl 2 g
K
2
HPO
4
0,25 g
Bột bắp 0,25 g
Nước cất 100 ml
 Môi trường bột sắn
Peptone 2 g
NaCl 2 g
K
2
HPO

4
0,25 g
13

Bột sắn 0,25 g
Nước cất 100 ml
 Môi trường peptone
Peptone 2 g
NaCl 2 g
K
2
HPO
4
0,25 g
Glucose 0,25 g
Nước cất 100 ml
 Môi trường rỉ đường
Peptone 2 g
NaCl 2 g
K
2
HPO
4
0,25 g
Rỉ đường 0,25 g
Nước cất 100 ml
 Môi trường amoni sulfat
Amoni sulfat 2 g
NaCl 2 g
K

2
HPO
4
0,25 g
Glucose 0,25 g
Nước cất 100 ml
 Môi trường NaCl
Peptone 2 g
K
2
HPO
4
0.25 g
14

Glucose 0.25 g
NaCl “thay đổi theo thí nghiệm”
Nước cất 100 ml
Với mỗi nồng độ muối thử nghiệm, ta bổ sung muối theo tỉ lệ thích hợp sau đó
hấp ở 121
0
C trong 15 phút.
Các môi trường đều được hấp khử trùng ở hấp khử trùng ở 121
o
C, 1 at, trong 15
phút.
 Thuốc nhuộm Tím Violet
Crystal violet 2 g
Rượu ethylic 20 ml
Ammol oxalate 0,8 g

Nước cất 80 ml
Hòa tan 2 g Crystal violet với 20 ml rượu ethylic để được dung dịch A
0.8 g Ammol oxalate trộn với 80 ml nước cất được dung dịch B
Trộn 2 dung dịch trên lại với nhau ta được dung dịch thuốc nhuộm Violet, bảo
quản trong lọ sẫm màu.
 Dung dịch Iodine
Iodine 1 g
KI 2 g
Nước cất 300 ml
Hòa tan 1 g Iodine trong 3 ~ 5 ml nước cất, thêm 2 g KI. khuấy cho tan
hoàn toàn, thêm nước cất cho đủ 300 ml . Bảo quản trong lọ sẫm màu.
 Dung dịch Fuchsin
Dung dịch A:
- Fuchsin 0,3g
- Ethanol 95% 10 ml
Dung dịch B:
- Phenol nóng chảy 5 ml
15

- Nước cất 95 ml
Trộn đều dung dịch A và B, lọc qua giấy lọc thô sau đó bảo quản trong lọ tối
màu.
 Dung dịch Liugon
Iodine (I
2
) 5 g
Postassium iodide( KI) 10 g
Nước cất 85 ml
Hòa tan 5 g I
2

, 10g KI với 85 ml nước cất để đạt được dung dịch thuốc nhuộm
là 150 mg/ml
 Dung dịch nước muối sinh lý
Hòa tan 8.5 g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở 121
0
C trong 15 phút,
để nguội và sử dụng.
2.1.3. Thiết bị chuyên dụng
 Hệ thống lên men BIO FLO 110 (Bioreacter), dung tích tối đa 10 lít, là hệ
thống lên men có khả năng cài đặt tự động các thông số về nhiệt độ, giá trị pH, tốc độ
khuấy, phá bọt. Máy được thiết kế phù hợp và tối ưu cho việc nuôi cấy các loại tế bào
động vật cũng như thực vật vì khả năng tự động điều chỉnh theo thống số cài đặt của
người sử dụng.
 Máy UV-VIS CARY 100 BIO dùng để xác định mật độ tế bào của dịch nuôi
(Giá trị OD của dịch nuôi).
 Kính hiển vi điện tử Motic moticam 2300 dùng để soi tế bào vi khuẩn sau khi
nhuộm Gram.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật
o Nuôi cấy chủng
Chủng được hoạt hóa sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh bằng cách, cho vào môi trường
TSB, nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ phòng 180 vòng/ phút. Sau khi hoạt hóa qua đêm,
tiến hành cấy chuyển để tiến hành thí nghiệm, chủng sẽ được đo nồng độ tế bào trong
dịch nuôi bằng máy đo UV- VIS ở bước sóng 540 nm, để xác định được giá trị OD của
dịch hoạt hóa. Giá trị OD chính là độ đục của dịch nuôi hay khả năng hấp thụ của dịch
nuôi tại một bước sóng nhất định nào đó, giá trị này thể hiện khả năng sinh trưởng của
vi sinh vật khi nuôi sau một khoảng thời gian nào đó. Vi khuẩn càng phát triển mạnh