đề tài sự tổng hợp và ứng dụng của enzyme protease

TRƯỜNG ĐẠI HOC KHOA HỌC – HUẾ
KHOA SINH HỌC
Tiểu luận
Chủ đề : Sự tổng hợp và ứng dụng của Enzyme
protease
GVHD : ….Trần Thanh Phong
SVTH : Nguyễn Ngọc Phúc
Nguyễn Tuấn Anh
Hồ Thị Thùy Dung
Trần Quang Tuyến
LỚP : CNSH- K32
Huế 21/12/2012
LỜI MỞ ĐẦU

1
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh
vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme
được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD,
được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau .
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme
đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy
phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản
xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm
tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực
phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…
Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi
sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ
khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme
ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống.

Protease có nhiều ứng dụng quan trọng trong đời sống con người, nhiều loại
enzyme protease được dùng để sản xuất thuốc hay các chế phẩm của chúng được dùng
để mang lại lợi ích cho con người. Thông qua bài tiểu luân này giúp chúng em hiểu rỏ
hơn cấu trúc hóa học và chức năng của enzyme protease, cũng như các ứng dụng quan
trọng của protease trong cuộc sống.
Phần I:
TỔNG QUAN VỀ ENZYM PROTEASE
2
1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme.
1.1.1. Vấn đề nghiên cứu enzyme ở nước ta
Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác
của enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút
sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên
cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch
enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan
giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực
tế. Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng
phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin sử dụng mầm mạ để sản
xuất amylase. Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng
tằm bằng protease, bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lên men rượu bằng
enzyme cố định trên cột. Cũng đã có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt-P
450
trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất độc Trong lĩnh vực y dược, việc
nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên một
số thuốc dùng điều trị một số bệnh đặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy
dinh dưỡng ở trẻ em, đồng thời đã tiến hành sản xuất đại trà. Đây là một đóng góp rất
thiết thực và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta.
1.1.2. Công nghệ sản xuất enzyme trên thế giới.
Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên
toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%),

và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) .
1.2. Tổng quan về enzyme Protease.
1.2.1. Giới thiệu chung.
Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên
kết liên kết peptit (-CO-NH-)
n
trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối
cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết
este và vận chuyển axit amin.
3

Hình 1.1. Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh
vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ).
So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt.
Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme
rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới
dạng tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có
tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
4
Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease.
Hình 1.3. Mô hình phân tử enzyme protease (papain)
1.2.2. Phân loại Protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) .
5

Hình 1.3. Sơ đồ phân loại protease
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của
6
Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)
Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)
Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Aminopeptidase
Carboxypeptidase
Serine proteinase
Cystein proteinase
Aspartic proteinase
Metallo proteinase
enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm
chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase.
Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin
BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính
đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một
vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt
động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin.
Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường
hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường
hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2-4
- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11
7
Phần II:
NGUỒN THU NHẬN ENZYM PROTEASE
2.1. Nguồn động vật:
- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều
enzyme nhất. Trypsin là men phân giải các protein hỗn hợp, men này do tuyến
tụy tiết ra, tiền thân của nó là trypsinogen, được hoạt hóa bởi Enterokinaza của ruột.
Trypsin là một enzyme có chức năng phân cắt các protein ta ăn vào thành mảnh nhỏ
đồng thời tự phân cắt nó ra mảnh nhỏ.
- Ngoài ra ở tuyến tụy còn tiết ra enzyme Chymotrypsin, enzyme này góp phần
phân giải protein trong ruột non và được chiết xuất từ tụy bò.
- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ
phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi
trường sữa có đủ nồng độ Ca

2+.
Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được
nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm
pepxin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát
triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi.
Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở
các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.
2.2. Nguồn thực vật:
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ
nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ
dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng
của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của
protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá.
Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica). Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein
tự nhiên.
8
Hình 2.1 Mô hình phân tử papain

Hình 2.2. Nguồn thu enzyme Protease từ thực vật
2.3. Nguồn vi sinh vật:
Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều loài
thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số
loại nấm men.
 Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm
59% lượng enzyme được sử dụng .
9
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease
của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các

liên kết peptide trong phân tử protein .
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là
Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn
Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích
hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có
khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực
phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease
trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được
sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống
thuộc chi Clostridium.

Hình 2.2. Clostridium
10
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ
20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-
12 .

Hình 2.3. Bacillus
 Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A.
fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng
tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu
các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có
khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát.
11

Hình 2.4. Nấm mốc
 Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn
và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp
protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus

Hình 2.5. Xạ khuẩn
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách
chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới
12
90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ), người ta
cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ,
chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ S. fradiae
cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptide
định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl
hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong
hệ hai pha lỏng.
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở
quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi
ích chính như sau:
• Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.
• Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc nhiều
lần quanh năm.
• Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng
sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).
• Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức sản
xuất.

Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây
bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp.
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật
có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng
hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó.
13
Phần III :
THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH ENZYM PROTEASE TỪ
VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT
3.1. Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật.
Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn.
Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn
chủ yếu
Hình 3.1. Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme
14
Tuyển chọn và cải tạo giống
vi sinh vật
Phương pháp bảo quản giống
vi sinh vật
Tách và làm sạch chế phẩm
enzim
Môi trường nuôi cấy vi sinh
vật sinh tổng hợp enzim
3.1.1. Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao.
Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có
thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác
động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến
chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn
chủng gốc ban đầu.
3.1.1.1. Phương pháp gây đột biến.

Đây là phương pháp hay được dùng nhất nhằm để:
 Tạo những đột biến bị giảm khả năng sinh tổng hợp repressor hoặc tổng hợp
repressor có ái lực thấp với gene opertor.
 Tạo những đột biến tổng hợp enzyme có cấu trúc bậc 1 thay đổi do đó có thể
giảm độ thay đổi với kiểu kìm hãm theo cơ chế liên hệ ngược.
Nếu sự thay đổi cấu trúc bậc 1 xảy ra ở vùng trung tâm hoạt động hoặc ở gần đó thì có
thể làm thay đổi rõ rệt hoạt tính của enzyme.
 Gây đột biến ở đoạn gene hoạt hóa promotor để làm tăng áp lực của nó đối với
ARN-polymerase do đó làm tăng tốc độ sao chép mã…Dùng biện pháp này có thể làm
tăng lượng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lần.
Hiện tượng đột biến thường liên hệ với sự thay đổi một gene, chẳng hạn bị “lồi” một
bazo khi tái tạo phân tử ADN.
Để tạo một đột biến gene có thể dùng tác nhân vật lý (tia tử ngoại, tia phóng xạ)
hay hóa học (các hóa chất) tác dụng lên tế bào sinh vật.
3.1.1.2. Phương pháp biến nạp.
Là sự biến đổi tính trạng di truyền của một nòi vi sinh vật dưới ảnh hưởng của
ADN trong dịch chiết nhận nhận được từ tế bào của vi sinh vật khác. Ở đây yếu tố biến
nạp là AND. Sự chuyển vật liệu di truyền (ADN) từ tế bào cho đến tế bào nhận có thể
xảy ra trong ống nghiệm (invitro) khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào
cho mà không có sự tiếp xúc giữa các tế bào.
15
Các tế bào có thể nhận bất kỳ loại ADN nào chớ không đòi hỏi phải là ADN từ
các giống họ hàng. Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhận một số đoạn ADN nhất định,
thường không quá 10 đoạn. Các đoạn ADN được di truyền trong biến nạp có M=10
6
-
10
7
và phải có cấu trúc xoắn kép. Hiện tượng biến nạp phổ biến ở nhiều loài vi khuẩn
như: Diplococus, Staphylocus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus,

Xantomonas.
3.1.1.3. Phương pháp tiếp hợp gene.
Khác với biến nạp, ở đây vật liệu di truyền chỉ được truyền từ tế bào cho đến tế
bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau. Do vậy các vi sinh vật có khả năng biến nạp
thì sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa. Hiện nay quá trình tiếp hợp gene
đã được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, salmonella, Pseudomonas
aeruginosa.
3.1.1.4. Phương pháp tải nạp
Vật liệu di truyền (ADN) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ vai
trò trung gian của thực khuẩn thể (phage). Trong quá trình tải nạp, các đoạn AND được
chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận. Do đó làm biến đổi
tính chất di truyền của tế bào nhận.
3.1.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.
Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đã
được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưu ý
đến điều kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có
thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và
kiểm tra lại các đặc tính ban đầu.
• Phương pháp cấy chuyền.
Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi
trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều
kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo
quản ở nhiệt độ lạnh 3-4
0
C và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại. Khi cấy chuyền chỉ lấy
bào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng để đảm bảo không
16
chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi
không thể lường hết được). Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi
trường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng.

Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến 1 năm, người ta phủ 1
lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó. Cần
lưu ý chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý.
Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vi khuẩn và
rất hữu hiệu, dễ dàng triễn khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn
đến hư hỏng giống gốc.
Hình 3.2. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch
• Phương pháp làm khô
Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều
được khử trùng cẩn thận). Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục
của giống khi bảo quản. Phươg pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm
mốc, xạ khuẩn, một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữu giống có thể được 1
năm.
17
Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền. Tuy
nhiên giống như phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn.
• Phương pháp đông khô
Hình 3.3. Đông khô vi sinh vật.
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng
thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được
làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng
mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu
là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối
tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy
nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào
động vật.
• Phương pháp bảo quản lạnh sâu:
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi
trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt
độ lạnh sâu (-196

°
C -> -80
°
C).
18
Hình 3.4. Bảo quản lạnh sâu
Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan
mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong
mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm
này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như
glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này
được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20
°
C, -30
°
C, -40
°
C, -70
°
C, -140
°
C
và -196
°
C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30
°
C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu
nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả
với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và
virut.

Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn
năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau
như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật. Tuy nhiên,
phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và
điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ Đặc biệt phương pháp này không thích hợp
với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường
19
được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với
phương pháp đông khô.
Hình 3.5. Bảo quản trong nitơ lỏng.
3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease.
Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng
trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi
trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và
tổng hợp enzyme.
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện
tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất
đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất
kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất
cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng
của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca,
P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
3.1.3.1. Nguồn cacbon.
20
Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc tính
của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp.
Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối
với nấm mốc sinh ra enzyme protease có hoạt lực cao. Các nguồn cacbon có tác dụng
đến sinh tổng hợp proteinase của nấm mốc có thể theo thứ tự:

Đối với Asp. flavus 74: fructoza→ glucoza→ sacaroza→ ramnoza→ manoza→
galactoza→ arabinora→ lactoza.
Đối với Asp. awamori 200: fructoza→ manit→ sacaroza→ arabinoza→
manoza→ galactoza→ lactoza.
Đối với Asp. oryzae 79: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→
arabinoza→ galactoza.
Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme
Protease. Ví dụ: Vi khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp Protease ở môi
trường tinh bột >8%.
Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và sinh
tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25- 1,5%
sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu xuất tổng hợp enzyme.Nếu tăng nồng độ tinh
bột hơn nữa sẽ không thu được kết quả dương tính. Tỷ số giữa cacbon và nitơ cần phải
là 4: 1. Trên môi trường có maltoza (0,5- 2%) vi sinh vật phát triển bình thường, nhưng
tổng hợp protease ngoại bào bị ức chế. Xạ khuẩn không phát triển được ở trên môi
trường có các nguồn cacbon duy nhất là sacaroza, lactoza hoặc arabinoza. Glucoza,
manoza, fructoza, xyloza có trong môi trường (0,2- 5%) làm ức chế sinh trưởng của xạ
khuẩn và sinh tổng hợp enzyme.
Ngoài ra một số loại hydrocacbon cũng có nguồn cacbon có 125 chủng vi sinh
vật. Chẳng hạn chủng Ps. Seruginosa có thể đồng hoá hydrocacbon và có khả năng
sinh tổng hợp protease có hoạt lực cao trên môi trường n- parafin với 12, 14 và 16
nguyên tử cacbon, dầu nặng hoặc propylenglycol. Chúng không chỉ đồng hoá được cả
hydrocacbon béo mà còn đồng hoá cả hydrocacbon thơm.
3.1.3.2. Nguồn nito.
21
Nguồn nito sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ.
Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A.
flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao. Trên
môi trường kzapek NaNO
3

được thay bằng cả cazein hoạt lực protease của nấm mốc
được tăng lên 3,5 lần, còn khi thay tinh bột bằng glucoza và bổ sung pepton hoạt lực
enzyme tăng 6 lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được
nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ. Cho
thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu
cơ hoạt lực enzyme protease tăng 22- 74%. Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ
duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp protease nói chung.
Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, trong đó có B. subtilis và B. mesentericus,
các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ được dùng phối hợp trong môi trường sẽ tạo điều
kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp protease. Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH
4
,
H
2
PO
4
là tốt hơn cả. Những muối khác NH
4
Cl, (NH
4
)
2
SO
4
, NH
4
NO
3
, NaNO
3

, KNO
3
,
Ca(NO
3
)
2
làm giảm hoạt lực protease tới 30- 50% , còn amylaza giảm 7- 10 lần. Còn
trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lực protease và amylaza cũng thấp hơn
trong môi trường đối chứng (NH
4
)
2
HPO
4
và nước chiết đậu tương.
Đối với xạ khuẩn ưa nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là chất cảm
ứng để sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất.
Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật.
Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng đột
biến A. oryzae 251- 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A. oryzae 132- 63 tới 7- 24%.
Nhiều axit amin có tác dụng ức chế đến sinh tổng hợp enzyme, Valin, axit glutamic,
izolơxin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B. megaterium 60%. Còn đối với B.
subtilis các axit amin ức chế trong quá trình này là glyxin, metionin, axit glutamic,
alanin, lơxin,…
Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của
chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợp
proteinza vi sinh vật.
22
3.1.3.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh trưởng

Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật.
Ion Mg
2+
có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt
độ cao.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy thông
thường từ 25 - 30
0
C. Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi trường nước)
cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng khi đó cũng cần
tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật.
Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy ở môi
trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường bề sâu
(môi trường dịch thể) , thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này cực kỳ
quan trọng). Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc
vào thành phần môi trường bề mặt.
Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định lượng
sao cho quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất. Muốn vậy người ta có
thể sử dụng một số phương pháp:
Phương pháp tối ưu hóa quy hoạch thực nghiệm toàn phần.
Phương pháp toán học mô hình hóa thực nghiêm.
3.1.4. Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme.
Có thể chia làm 2 loại: môi trường tổng hợp và môi trường tự nhiên.
 Môi trường tổng hợp: là môi trường bao gồm các chất với liều lượng xác định
(qua tìm hiểu, nghiên cứu), chẳng hạn nguồn cacbon có thể là tinh bột, xenluloza,
đường, axit, rượu, nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ. Loại môi trường này được sử dụng
cho mục đích nghiên cứu.
 Môi trường tự nhiên: thường dùng các loại phế liệu, nguyên liệu có chứa các
nguồn cacbon, nitơ, khoáng, các yếu tố sinh tổng hợp trưởng. Mặt khác, các nguyên
liệu này có sẵn, rẻ tiền nên được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất các

chế phẩm enzyme từ vi sinh vật. Các nguyên liệu để chuẩn bị làm môi trường tự
nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép hoa quả, rau, khô dầu,
23
bã rượu, rĩ đường, sản phẩm phân huỷ nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi lựa chọn sử
dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hoà sinh tổng hợp
enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy
thông thường từ 25 - 30
0
C. Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi
trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng
khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật.
3.1.5. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật.
• Nuôi cấy bề mặt:
Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát
triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt
hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã
được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật
trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men- misô)
đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương).
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là trấu.
Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mông, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất
gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm
sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%, có thể
bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH
4
)
2
SO
4

, (NH
4
)
2
CO), photpho, nitơ hữu cơ và các
chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu.
 Quy trình công nghệ:
Nguyên liệu  Trộn  Làm ẩm  Thanh trùng bằng nhiệt  Lam nguội, tơi 
Gieo giống vsv  Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy  Nuôi cấy, theo dõi, xử lý.
 Ưu nhược điểm:
Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi
đã tách tế bào vi sinh vật. Trong công nghiệp rượu muốn đường hoá 100kg tinh bột chỉ
cần 5kg chế phẩm nấm mốc bề mặt nhưng phải cần đến 100lit nấm mốc chìm để lọc bã
và tế bào vi sinh vật.
24
Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế
phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần
khâu tách và làm sạch enzyme.
Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện qui mô
gia đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn đến 20T/ngày.
Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm
trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó.
Tuy nhiên phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự động hoá, cần
diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều.
• Nuôi cấy chìm
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu trong đa số
trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vsv dùng nguồn cơ chất cacbon là đường
glucoza, saccharoza. Thực tế, trong một số trường hợp đường hoá sơ bộ tinh bột trước
khi thanh trùng. Khi đó đường maltoza được tạo thành là chất cảm ứng tốt, môi trường
thường giảm độ nhớt nên dễ dàng cho quá trình khuấy trộn và sục khí.

Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ
sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung
cấp cho quá trình nuôi cấy.
Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy chìm 1 bước gồm: chuẩn bị môi trường
nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất.
 Ưu nhược điểm
Phương pháp nuôi cấy hiện đại dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao, dễ tổ
chức sản xuất.
Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng
hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy,
enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bao điều kiện vệ sinh, vô trùng.
Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu
hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô
trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn.
25