báo cáo khoa học ''''nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của loài lactobacillus plantarum l24''''

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
BACTERIOXIN CỦA LOÀI Lactobacillus plantarum
L24

Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim
Quy
Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội

I. MỞ ĐẦU

Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không sinh bào
tử, có khả năng lên men đường để tạo axitlactic. Vi khuẩn
lactic được sử dụng rộng rãi trong đời sống như chế biến
thức ăn lên men, ủ chua thức ăn cho gia súc, sản xuất
axitlactic và xử lý môi trường để tránh mùi hôi thối. Tuy
nhiên vi khuẩn lactic còn được quan tâm nhiều do chúng có
khả năng sinh bacterioxin, một loại protein có khả năng
tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm
thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacterioxin
còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào
peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Vì vậy
bacterioxin được dùng nhiều trong bảo quản thực phẩm,
sữa tươi, nước giải khát cũng như trong xử lý môi trường,
chế biến thức ăn chăn nuôi. Trong báo cáo này chúng tôi
giới thiệu một chủng vi khuẩn lactic sinh bacterioxin mới
phân lập tù nước dưa.

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU.

a. Vi sinh vật.

Chủng vi sinh vật được phân lập từ nước dưa và được giữ
và bảo quản tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Trung
tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội.

b. Môi trường MRS dùng trong nghiên cứu có thành phần
sau (g/l): Casein peptone, tryptic digest 10, cao thịt - 10,
cao nấm men - 5, glucose -20. Tween 80, K
2
HPO
4
- 2, Na-
acetate - 5, (NH
4
)
2
citrate - 2.00, MgSO
4
. 7 H
2
O - 0.20,
MnSO
4
. H
2
O - 0.05, nước 1000 ml, pH to 6.2 - 6.8. Khử
trùng 121
o
C trong 15 phút.

c. Xác định hàm lượng bacterioxin theo phương pháp

Brarford [1].

d. Xác định bacterioxin trên gel polyacrylamit (SDS-
PAGE) theo phương pháp của Laemmli [4. 5].

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

a. Đặc điểm hình thái nuôi cấy

Chủng vi khuẩn L24 phân lập từ nước dưa có khuẩn lạc
tròn, nhẵn, màu trắng sữa, tế bào đều có dạng hình que, bắt
màu Gram dương, không có khả năng di động, không sinh
bào tử, phản ứng catalaza âm tính, có khả năng đồng hoá
cacbonhydrat amygdalin, arabinnoza, xenlobioza, fructoza,
glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza,
nhưng không sử dụng sorbitoi Căn cứ vào các đặc điểm
hình thái, sinh lý, sinh hoá, dựa theo khoá phân loại
Bergey’s [5], chủng L24 được xác định thuộc chi
Lactobacillus.

Hình 1. Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn lactic
L24 chụp dưới
kính hiển vi điển tử ở độ phóng đại x 20 000 lần


b. Xác định thành phần của axit diaminopimelic (DAP)
trong thành tếa bào của chủng vi khuẩn lactic L24

Các tác giả Schliifer và Kandlu [3] cho rằng đồng phân
DAP có trong thành phần peptidoglycan của thành tế bào vi

khuẩn Gram dương. đặc biệt đối với xạ khuẩn và vi khuẩn
lactic. Để xác định đồng phân DAP của chủng L24 chúng
tôi tiến hành lấy 50mg tế bào ướt cho vào ống thuỷ tinh nút
xoáy (cỡ 3x100mm), thuỷ phân bằng 1ml 6N HCl trong nồi
ổn nhiệt 100
o
C trong 16 giờ. Làm nguội dịch thuỷ phân tới
nhiệt độ phòng. Dùng giấy sắc ký bản mỏng TLC để xác
định meso-DAP. Chấm chừng 3 l dung dịch lên giấy sắc
ký bản mỏng TLC. Dùng 1l của 0,01M DL-
diaminopimelic axit (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
USA) làm dung dịch chuẩn. Đặt giấy sắc ký bản mỏng
trong bồn thuỷ tinh chứa 50ml hỗn hợp methanol - nước -
6N HCl - pyridine (80:26:4:10, v/v) trong 3 giờ hoặc lâu
hơn. Phun dung dịch 0,2% ninhydrin (trong nước bão hoà n
- butanol) lên giấy sắc ký bản mỏng, đặt trong tủ sấy ở
nhiệt độ 100
o
C trong 5 phút). Vết meso-DAP tách rời, xuất
hiện từ TLC như là các vết màu xanh đen.


Hình 2. Kết quả xác định meso-DAP của chủng vi khuẩn
lactic
trên sắc ký bản mỏng
Chú thích: Chẩm 1 - meso-DAP chuẩn (Sigma)
Chấm 4: Meso - DAP của chủng L24


Kết quả sắc ký cho thấy chủng L24 chứa meso-DAP và do

đó vi khuẩn có thành tế bào thuộc nhóm IV. Dựa vào các
đặc điểm sinh lý, sinh hoá và typ thành tế bào của chủng
L24, đối chiếu với khoá phân loại của Ber’sgey có thể xác
định chủng này thuộc chi Lactobacilus [2].

Việc đưa các chủng vi sinh vật sống vào môi trường là một
việc làm hệ trọng, phải đảm bảo chắc chắn rằng chủng đó
không gây hậu quả xấu đối với sức khoẻ con người và môi
trường, do vậy chúng tôi tiến hành xác định trình tự rADN
16S để định danh chính xác đến loài. Sau khi tiến hành
phản ứng PCR, trình tự rADN 16S được đọc trên máy đọc
trình tự tự động 3100 Avant bằng đoạn mồi đặc hiệu. Trình
tự đoạn gen được tổng hợp có chiều dài 645bp. Đây là đoạn
ít bền vững so với trình tự đoạn rADN 16S của
Lactobacillus plantarum, ký hiệu AL 935261 trong ngân
hàng dữ liệu gen của Nhật Bản thì độ tương đồng lên đến
98%.
Dưới đây là số liệu vế kết quả so sánh trình tự gen của sản
phẩm đã được tổng hợp bằng phản ứng PCR với trình tự
của đoạn gen trong ngân hàng dữ liệu gen Nhật Bản.


Hình 3. Điện di sản phẩm PCR của chủng L24 trên gel
agaroza 5%, được nhuộm bạc
Chú thích: M - ADN chuẩn 1kb Ladder (10 000bp)
Băng 1 biểu hiện đoạn được tổng hợp của chủng L24.



c. Xác định bacterioxin của loài Lactobacillus plantarum

L24 trên gel polyacrylamit 15%.

Bacterioxin do vi khuẩn lactic sinh ra là các phân tử protein
mang điện tích dương, kích thước nhỏ gồm 30 - 60 axit
amin, có điểm đẳng điện cao và có khả năng ức chế các vi
khuẩn có quan hệ chủng loại gần với vi khuẩn sinh ra
bacterioxin đó [4].

Bacterioxin có mặt trong tất cả các nhóm của vi khuẩn
lactic như: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus,
Streptococcus, Leuconostoc và, Pediococcus,. Trong đó,
hai nhóm chính là: Lactobacillus, Lactococcus đóng vai trò
quan trọng. Theo hệ thống phân loại do Kleen - hammer,
các bacterioxin được chia thành 4 nhóm, dựa trên trọng
lượng phân tử, độ bền nhiệt, sự có mặt của các axit amino.
Do đó, để xác định rõ Lactobacillus plantarum L24 chúng
tôi nghiên cứu thuộc nhóm sinh bacterioxin nào. Chủng
L24 được nuôi cấy tĩnh sau 24 giờ tiến hành phá vỡ tế bào
và hạ pH xuống 2.5, để qua đêm ở 4
o
C. Sau đó chỉnh pH về
7,0 và đem tủa với aceton 100%, lạnh (giữ ở -22
o
C) với thể
tích bằng thể tích mẫu. Ly tâm 10000vòng trong15 phút.
Làm khô mẫu và hoà tan trở lại bằng dung dịch đệm l mẫu
bacterioxin thô được tra vào mỗi giếng trên gelmSorensen
pH = 7,0. Lấy 10 polyacrymit 15%. Chạy với cường độ
dòng điện 1,5A/giếng. Cuối cùng nhuộm bạc.
Kết quả được trình bày ở hình 34

Hình 4. Điện di đồ gel polyacrylamit 15%
Chú thích: Giếng 1 protein chuẩn 200 kDa (Sigma)
Giếng 2 băng bacterioxin của Lactobacillus plantarum L24,
trọnglượng phân tử 15kDa.


Kết quả cho thấy trọng lượng phân tử của bacterioxin của
Lactobacillus plantanrum L24 thuộc nhóm lớn, nhóm
bacterioxin II, protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử
nhỏ từ 10 - 30kDa.

d. Ảnh hưởng của nguồn nitơ (N) vô cơ đến khả năng
sinh trưởng và sinh tổng hợp bacterioxin của
Lactobacillus plantarum L24

Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là
muối amon còn muối nitrat là nguồn thức ăn không thích
hợp đối với nhiều loại vi khuẩn. Hầu như các loại vi sinh
vật đều có khả năng đồng hoá muối amôn. Đôi khi có loài
không sử dụng được muối này thì nguyên nhân không phải
do bản chất của NH4+ mà do sau khi đồng hoá gốc amôn,
môi trường sẽ tích lũy các gốc anion vô cơ như SO
4
-
,
HPO
4
2-

, làm giảm pH của môi trường. Đối với vi khuẩn
lactic thì đây là một đặc điểm rất quan trọng vì quá trình
sinh trưởng của chúng phụ thuộc rất nhiều vào pH.

Lactobacillus plantarum L24 được tiến hành nuôi tĩnh ổn
nhiệt trên môi trường dịch thể MRS, với tỷ lệ giống 0.5%,
có bổ sung các nguồn nitơ vô cơ 0,1% khác nhau thời gian
nuôi 48 giờ. Xác định khả năng sinh trưởng và sinh tổng
hợp bacterioxin của Lactococcus plantarum L24. Kết quả
trình bày trên hình 5.


Hình 5. Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng
và sinh tổng hợp bacterioxin
của loài Lactobacillus plantarum L24


Một điều dễ nhận thấy khi bổ sung vào môi trường một
lượng nitơ định trước đã có ảnh hưởng đến sinh trưởng và
sinh tổng hợp bacterioxin của Lactobacillus plantarum
L24. Rõ ràng là amoni photphat là nguồn nitơ vô cơ thích
hợp nhất cho sinh tổng hợp bacterioxin của Lactobacillus
plantarum L24. Nguyên nhân gây ra sự khác nhau này có
thể do gốc phọtphat có tính đệm cao và tính axit yếu nên
không làm giảm pH của môi trường nhiều như các gốc
khác. Trên các môi trường thường sử dụng nguồn nitơ vô
cơ khác, sinh trưởng mật độ OD của tế bào đạt 2. 2 và sinh
tổng hợp bacterioxin đạt là 52g/ml. Điều này rất thuận lợi
khi bổ sung các chất khoáng khi nuôi cấy vi sinh vật.

IV. KẾT LUẬN

Chủng vi khuẩn lactic L24 có khuẩn lạc tròn, nhẵn, màu
trắng sữa, tế bào đều có dạng hình que, bất màu Gram
dương, không có khả năng di động, không sinh bào tử,
phản ứng catalaza âm tính Có khả năng đồng hoá
cacbonhydrat đặc biệt là xyloza. Chủng L24 vừa có khả
năng sinh axitlactic vừa có khả năng sinh bacterioxin II,
protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10-30kDa. Các
phân tích trình tự rADN 16S cho thấy chủng L24 là
Lactobacillus plantarum.


SUMMARY

STUDY ON BACTERIOCIN PRODUCTION OF
NEWLY ISOLATEDSTRAIN Lactobacillus plantarum
L24

Nguyen Thi Hoai Ha et al

The strain of lactic acid bacteriocin L24 was isolated from
fermented sour vegetables cell are rods, non sporing, non-
notile, catalase negative. Metabolision was predominantly
fermentative, lactic acid being formed from glucose
homofermentatively, xylose was fermented. The analysis of
16S rDNA sequence shows that this strain L24 was
identified as Lactobacillus plantarum. Bacteriocin II was
produced. Antibacterial protein with molecular weigh
15kDa were detected by using gel electrothesis SDS-PAGE

method.

TÀI LIỆU THAM KHẢO.

1. Bradford, M. M. 1976. Arapid and Sensitive- Method for
the Quantitation of Laemmli, U. K.1970. Nature. Vol 227.
680-685.
2. Buchanan, R.E., and Gillons, N.E. Bergey s. Manual
Determinative Bacteriology 8 Ed. William Wilkins Co.,
Baltimore, 1974.
3. Helo, H; Nilssen. O; 1991. Lactococcin A, new
bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. cremoris
isolation and characterization of the protein and it’s gene. J.
Bacteriol 173, 3879 – 3887.
4. Kelly, W. J. 1998. Charaterization of Lactococci isolated
from minimally processed fresh fruits and vegetables. Int.
J. Food Microbiol., 45. 85-92.
5. Yang, R, Johnson, M and Ray, B.1992. Novel method to
extract large amounts of bacteriocins from lactic acid
bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 38. 3355-3559