Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz) Hack họ poaceae)

Bô Y tế







Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ




Nghiên cứu thành phần hóa học
và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật
(Eriochloa ramosa (Retz.) Hack. họ Poaceae



Chủ nhiện đề tài TS.Lê Thị Kim Loan
Cơ quan chủ trì đề tài Viện Dợc liệu







7440
10/7/2009

năm 2008


Bô Y tế






Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ



Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ ga
n
của cây cỏ mật
(Eriochloa ramosa (Retz.) Hack. họ Poaceae


Chủ nhiện đề tài TS. Lê Thị Kim Loan
Cơ quan chủ trì đề tài Viện Dợc liệu
Cấp quản lý Bộ Y tế
Thời gian thực hiện từ tháng 7 năm 2006 đến tháng 7 năm 2008.
Tổng kinh phí thực hiện đề tài 270 triệu đồng

Trong đó kinh phí SNKH 270 triệu đồng












năm 2008





Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ


1. Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ
mật ( Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack., họ Poaceae
2. Chủ nhiệm đề tài: TS. Lê Thị Kim Loan
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu
4. Cơ quan quản lý đề tài: BộY tế
5. Danh sách những người thực hiện chính:
- TS. Lê Thị Kim Loan - Viện Dược liệu
- PGS.TS. Bùi Thị Bằng - Việ

n Dược liệu
- DSCKI. Nguyễn Thị Kim Bích - Viện Dược liệu.
- CN Ngô Văn Trại - Viện Dược liệu
- TS. Phan Văn Kiệm - Viện Hóa các hợp chất tự nhiên
- PGS.TS Nguyễn Trọng Thông - Đại học Y Hà Nội
- PGS.TS. Vũ Thị Ngọc Thanh - Đại học Y Hà Nội
- DS. Nguyễn Kim Phượng - Viện Dược liệu
- ThS. Đỗ Thị Phương - Viện Dược liệ
u.
6. Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 7 năm 2006 đến tháng 7 năm 2008
( Được gia hạn đến 2/2009)















nh÷ng ch÷ viÕt t¾t

Cỏ mật

CM
Dịch chiết nước cỏ mật

Mn
Dịch chiết cồn ( ethanol ) cỏ mật

MC
Dịch chiết cồn- nước cỏ mật

MCN
Polyssccharid/cỏ mật

MN
1
Lớp chất còn lại sau loại polysaccharid trong dịch chiết
nước cỏ mật

MN
2
Sắc ký lớp mỏng

SKLM
Methanol

MeOH
Phổ khối lượng phun mù điện tử

ESI-mS
Độ quay cực

[ α ]
D
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

NMR
Carbon tetraclorid

CCl
4

Paracetamol

PAR
Alanin aminotransferase

ALT
Aspartat aminotransferase

AST
Malondialdehyd

MDA
Cytochrom - P
450

CyP hoặc Cyt- P
450

N-acetyl-p-benzoquinoneimin

NAPQI
Thể tích trung bình hồng cầu

MCV


môc lôc
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
1
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2
2.1 Bệnh viêm gan và một số xét nghiệm thường dùng để đánh giá
tổn thương gan

2
2.1.1 Bệnh viêm gan
2
2.1.2 Một số xét nghiệm thường dùng để đánh giá tổn thương gan
4
2.2 Thuốc và phương pháp điều trị viêm gan

5
2.2.1 Thuốc điều trị viêm gan

5
2.2.2 Các phương pháp điều trị viêm gan
8
2.3 Tổng quan về cây cỏ mật
( Eriochloa ramosa (Retz.) Hack.)

9
3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

11
3.1 Nguyên liệu

11
3.2 Hóa chất và động vật thí nghiệm

11
3.3 Phương pháp nghiên cứu
12
3.3.1
Phương pháp nghiên cứu thực vật

12
3.3.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học trong dược liệu.

12
3.3.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học.

14
3.3.3.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan
14
3.3.3.2 Nghiên cứu tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan
16
3.3.3.3 Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng giấc ngủ với phenobarbital
16
3.3.3.4 Nghiên cứu tác dụng lợi mật
17

3.3.3.5 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp
17
3.3.3.6 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn
18
3.3.3.7 Nghiên cứu độc tính cấp
19
3.3.3.8 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
19
3.3.3.9 Phương pháp xử lý kết quả
20
4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

21
4.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật

21
4.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học

24
4.2.1 Định tính các thành phân hóa học
24
4.2.2 Định lượng các thành phần hoa học trong cao nước và cao cồn cỏ
mật

26
4.2.3 Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số thành phần hóa
học trong cỏ mật

27
4.2.3.1 Nghiên cứu phân lập một số thành phần hóa học

27
4.2.3.2 Hằng số vật lý và các dữ liệu phổ của các hợp chất
30
4.2.3.3 Xác định cấu trúc hóa học của các h
ợp chất
34
4.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học

70
4.3.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan của cỏ mật
68
4.3.2 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao nước cỏ mật
75
4.3.2.1 Ảnh hưởng của cỏ mật lên trong lượng gan chuột
-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl
4

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR

75
76
4.3.2.2 Ảnh hưởng của cỏ mật lên lên hoạt độ enzym transaminase
-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl
4

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR
77

4.3.2.3 Ảnh hưởng của cỏ mật lên lên nồng độ bilirubintrong
-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl

4

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR
80
4.3.2.4 Ảnh hưởng của cỏ mật lên lên mô bệnh học gan chuột
81
-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl
4

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR
4.3.2.5 Ảnh hưởng của cỏ mật lên nồng độ MDA trong dịch đồng thể
-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl
4

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR
90
4.3.3 Nghiên
cứu tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan của cao nước cỏ
mật

91
4.3.4 Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng giấc ngủ của cao cỏ mật khi phối
hợp với phối hợp với phenobarbital


103
4.3.5 Nghiên cứu tác dụng lợi mật của cao nước cỏ mật

103
4.3.6 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của cỏ mật 104

4.3.7 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của cỏ mật

104
4.3.8 Nghiên cứu độc tính cấp

105
4.3.9 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn

105
4.3.9.1 Tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng của thỏ
105
4.3.9.2 Đánh giá chức năng tạo máu
106
4.3.9.3 Đánh giá chức năng gan
109
4.3.9.2 Đánh giá chức năng thận
112
5
BÀN LUẬN
117
6
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
139

TÀI LIỆU THAM KHẢO
142

PHỤ LỤC
-
Bản tự đánh giá về tình hình thực hiện và những đóng góp mới của

ĐT.
- Danh sách tác giả
- Những bài báo đã công bố
147

BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ
Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới
của đề tài KH&CN cấp Bộ

1. Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ
mật ( Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack., họ Poaceae
2. Chủ nhiệm đề tài: TS. Lê Thị Kim Loan
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu
4. Thời gian thực hiện (BĐ-KT): Tháng 7/2006 đến tháng 7/2008 ( Đã được gia hạn
đến tháng 2/2009)
5. T
ổng kinh phí thực hiện Đề tài: 270 triệu đồng
Trong đó, kinh phí từ NSNN: 270 triệu đồng
6. Tình hình thực hiện đề tài so với đề cương:
6.1/ Về mức độ hoàn thành khối lượng công việc : Hoàn thành các nội dung nghiên
cứu
6.2/ Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN: Đạt các yêu
cầu khoa học và các chỉ tiêu cơ bản của sản phẩm.
6.3/ Về tiến độ thực hiện : So v
ới thời gian thực hiện xác nhận trong ĐC bị chậm vì
vậy CNĐT và Cơ quan chủ trì ĐT đã có công văn gửi Vụ KH và ĐTxin gia han.
CNĐT và Viện DL đã nhận được QĐ của Vụ KH và ĐT, cho phép ĐT được kết thúc
vào tháng 2/2009
7. Về những đóng góp mới của đề tài:
Trên cơ sở so sánh với những thông tin đã được công bố trên các ấn phẩm

trong và ngoài nước đến thời
điểm kết thúc đề tài, đề tài có những điểm mới sau đây:
8.1/ Về giải pháp khoa học - công nghệ
- Lần đầu tiên đã nghiên cứu chiết tách và xác định cấu trúc của 5 hợp chất hữu cơ
trong cây cỏ mật ( Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack. ). Trong đó có 1 chất mới, lần
đầu xác nhận được từ thiên nhiên.
- Lần đầu tiên nghiên cứu chứng minh tác dụng bảo vệ gan, làm tăng phục hồi tổn
th
ương gan và tác dụng lợi mật của cây cỏ mật. Tác dụng bảo vệ gan của cỏ mật theo
cơ chế chống oxy hóa
- Đã đánh giá độc tính của cỏ mật thông qua việc nghiên cứu độc tính cấp và độc tính
bán trường diễn, kết quả cho thấy dùng cỏ mật rất an toàn do độc tính thấp
8.2/ Về phương pháp nghiên cứu
Phương pháp NC tác dụng hiệp đồng giấc ngủ của cỏ m
ật với phenobarbital. Đây là
phương pháp mới nhằm chứng minh cơ chế bảo vệ gan của thuốc nghiên cứu.
8.3/ Những đóng góp mới khác :
- Hướng dẫn cán bộ NC của Viện Dược liệu trong thời gian tập sự
- Đã hướng dẫn luận văn ThS. Y học cho BS. Đinh Thị Kim Chi, Luận văn đã bảo vệ
thành công.
-Tham gia Hội thảo khoa học Quốc tế với nội dung ;” A new dammarane - type
triterpene saponin from Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack. hội thảo được tổ chức và
tháng 10/2007 tại Viện Khoa học CNVN.
- Đã có hai bài báo đăng trên tạp chí Dược liệu.
+ Nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan của cỏ mật- Tạp chí DL số 3+4, tập
12/2007
+ A new dammarane - type triterpene saponin from Eriochloa ramosa ( Retz.). Tạp
chí DL số 2, tập 13/2008

Hà Nội.,ngày 20 tháng 12 năm2008
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Họ, tên và chữ ký)


























1

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm gan là bệnh lý thường gặp trong các bệnh về gan mật. Có nhiều nguyên
nhân gây bệnh, có thể do các loại virus ( A, B, C ), do thuốc, do rượu hoặc do hóa
chất xâm nhập vào gan. Bệnh có thể tiến triển từ viêm gan cấp đến viêm gan mạn rồi
tiến tới xơ gan hoặc ung thư gan. Theo Phạm Hoàng Phiệt, Việt Nam nằm trong
vùng dịch tễ của viêm gan B với khoảng 10 triệu người mang HBsAg [23], ước tính
tỷ lệ tử vong có liên quan
đến viêm gan vào khoảng 48.000 người trong một năm
[29]. Viêm gan do nhiễm độc thuốc hoặc do hóa chất cũng thường gặp đặc biệt là
viêm gan do dùng thuốc chống lao hoặc thuốc hạ sốt giảm đau paracetamol có xu
hướng ngày càng tăng.
Viêm gan do virus có thể điều trị bằng thuốc kháng virus như Inteferol,
Lamivudin Tuy nhiên những thuốc này có giá thành quá cao và có nhiều tác dụng
không mong muốn. Hơn nữa hiện nay đã xuất hiện dòng virus đột biến kháng
Lamivudin. Các trường hợp viêm gan do nguyên nhân khác (do thu
ốc, hóa chất )
hiện chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, những bệnh nhân này chủ yếu được điều trị
bằng các thuốc làm tăng khả năng phục hồi tổn thương gan và bảo vệ gan. Một số
thuốc bảo vệ gan được nhập vào Việt Nam như Silymarin (Legalon),
Biphenyldimethyl dicarboxylat (Fortex) có tác dụng tương đối tốt song giá thành
tương đối cao, không phù hợp với điề
u kiện kinh tế của đa số người bệnh khi phải
dùng thuốc dài ngày. Vì thế việc nghiên cứu các thuốc bảo vệ gan từ nguồn nguyên
liệu trong nước là điều hết sức cần thiết.
Y học cổ truyền nước ta có lịch sử hàng ngàn năm. Với sự phong phú và đa dạng
sinh học vào bậc nhất khu vực Đông nam á, tạo điều kiện cho nước ta có nguồn cây
thuố
c dồi dào. Dược liệu dùng chữa bệnh gan mật có rất nhiều và cũng được các thầy
thuốc Y học cổ truyền sử dụng rộng rãi như chi tử ( hạt dành dành ), actiso, nghệ
vàng, nhân trần, bồ bồ Để có thể tìm kiếm, bổ sung và danh mục này những cây

thuốc có tác dụng tốt lại có sẵn trong tự nhiên là công việc hết sức cần thiết và có ý
nghĩa thực tiễn. Cây cỏ mật là cây mọc hoang
ở vùng đồng bằng và trung du nước ta.
Theo kinh nghiệm của nhân dân ở một số địa phương như Nam Định, Phú thọ, Sơn
tây dùng cỏ mật để chữa cảm sốt, chữa mụn nhọt và chữa các bệnh về gan mật. Một
số tác giả trong nước cũng đã nghiên cứu về tác dụng hạ sốt, giảm đau, lợi mật, lợi
tiểu của cỏ mật trên thự
c nghiệm [11], [26] nhưng chưa thấy có nghiên cứu nào về
tác dụng bảo vệ gan và phục hồi tổn thương gan của cây này. Để có cơ sở khoa học
trong việc sử dụng cây thuốc này với mục đích làm thuốc bảo vệ và phục hồi tổn
thương gan, chúng tôi tiến hành thực hiện Đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và
tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz.) Hack., họ
Poaceae với
các mục tiêu sau:
- Xác định thành phần hóa học chính của cây cỏ mật.
- Xây dựng quy trình chiết xuất và phân lập các nhóm hoạt chất chính trong cây cỏ
mật

2
- Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của hoạt chất toàn phần.
- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình súc vật thí nghiệm của hoạt chất toàn
phần
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.
2.1. Bệnh viêm gan và một số xét nghiệm thường dùng để đánh giá tổn thương
gan
2.1.1. Bệnh viêm gan
Viêm gan là bệnh lý thường gặp trong các bệnh về gan mật. Bệnh viêm gan
thường được chia làm hai loại dựa vào sự tiến triển củ
a bệnh, đó là:
- Viêm gan cấp: Khi có bất thường về gan dưới 6 tháng hoặc về mặt giải phẫu

thấy xuất hiện các tổn thương ở trung tâm tiểu thùy gan.
- Viêm gan mạn: Khi có bất thường về gan trên 6 tháng hoặc hoặc về mặt giải
phẫu thấy xuất hiện các tổn thương ở xung quanh tiểu thùy gan.
Tuy nhiên sự phân loại về thời gian và giải phẫu như trên không phải lúc nào
cũng đúng như v
ậy. Nếu hình ảnh giải phẫu như viêm gan cấp nhưng thời gian tiến
triển của bệnh trên 6 tháng hoặc hình ảnh giải phẫu giống viêm gan mạn mà thời
gian tiến triển của bệnh dưới 6 tháng đều được chẩn đoán là viêm gan mạn.
* Viêm gan cấp: Có ba nguyên nhân gây viêm gan cấp hay gặp nhất đó là do
virus, do thuốc hoặc do nhiễm độc.
- Viêm gan cấp do virus
Viêm gan do virus là bệnh phổ biến với tác nhân gây bệnh là các loại virus A, B,
C, D, E và G. Viêm gan virus A và E thường gây thành d
ịch nhưng lành tính. Viêm
gan virus B, C, D tiến triển âm ỉ, dễ gây tình trạng mạn tính dẫn tới xơ gan, ung thư
gan với tỷ lệ tương đối cao [23], [33]. Cơ chế sinh bệnh viêm gan do virus liên quan
đến quá trình đáp ứng miễn dịch, trong đó chủ yếu là đáp ứng qua trung gian tế bào
và sự tăng sinh gốc tự do tạo ra các phản ứng oxy hóa dẫn đến tổn thương gan và
hủy hoại tế bào gan [35], [47]. Mỗi năm trên thế giớ
i có khoảng 2 triệu người chết
do suy gan cấp, xơ gan và ung thư gan do virus viêm gan B gây ra. Bệnh hay gặp ở
các nước đang phát triển như Ấn Độ, Việt Nam
- Viêm gan cấp do thuốc.
Một số thuốc có độc tính cao đối với gan như Tetracyclin hoặc chất chuyển hóa
ổn định của chúng gây độc với gan như 5.Fluorouracin hoặc chất chuyển hóa trung
gian tấn công trực tiếp vào tế bào gan gây viêm gan, hủy hoại tế bào gan như
Paracetamol, Erythromycin, Isoniasid Trong số các l
ọai thuốc trên thì Paracetamol
( PAR) là thuốc hạ sốt, giảm đau dùng phổ biến trên khắp thế giới trong đó có Việt
Nam. Với liều điều trị thông thường, PAR không gây độc cho gan, nhưng nếu dùng

liều cao sẽ sinh ra nhiều N-acetyl-p-benzoquinoneimin (NAPQI ), đó là chất gây tổn

3
thương tế bào gan [7],[45]. Theo thống kê tại Trung tâm chống độc thuộc Bệnh viện
Bạch mai, ngộ độc thuốc hạ sốt giảm đau trong 2 năm 1998-2000 chiếm 6,34% số
các trường hợp ngộ độc. Đến năm 2002-2003, tỷ lệ này tăng lên 12,2% và đứng thứ
ba trong các loại ngộ độc thuốc. Viêm gan cấp do một số thuốc khác, đặc biệt là do
dùng thuốc chống lao Isoniasid phối hợp với Rifampicin cũng thường g
ặp, trong số
đó có một số trường hợp đã gây tử vong.
- Viêm gan cấp do nhiễm độc
Các trường hợp thường gặp là nhiễm độc thuốc trừ sâu, phẩm nhuộm, nấm độc,
nhiễm độc thực phẩm hoặc các hóa chất dùng trong công nghiệp như Carbon
tetraclorid (CCl
4
). CCl
4
là một chất gây hủy hoại tế bào gan điển hình. Trong quá
trình chuyến hóa, CCl
4
tạo thành các gốc tự do, chính các gốc tự do này sẽ liên kết
với lipid và các protein trên hệ thống lưới nội mô của tế bào gan gây phá hủy cấu
trúc và chức năng của hệ thống lưới, làm tổn thương gan [41], [47]. Mức độ tổn
thương phụ thuộc vào liều lượng CCl
4
, dạng tổn thương thường tập trung chủ yếu ở
vùng trung tâm tiểu thùy. Chính vì vậy CCl
4
hay được dùng trong mô hình gây viêm
gan cấp để nghiên cứu thuốc có tác dụng bảo vệ gan.

* Viêm gan mạn
- Viêm gan mạn do virus: Trên thế giới hiện có khoảng hai tỷ người nhiễm virus
viêm gan B và 400 triệu người đang bị bệnh viêm gan B mạn tính. Viêm gan virus B
là nguyên nhân dẫn đến viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan, gây tử vong với tỷ lệ
cao[14]. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ viêm gan B cao nhất thế giới.
Theo thống kê, tỷ lệ người mang bệnh là 17% [14]. Viêm gan virus C chiế
m 2%
trong các trường hợp viêm gan virus, 55-85% bệnh nhân viêm gan C sẽ chuyển
thành viêm gan mạn nếu không được điều trị kịp thời và nghiêm trọng hơn 15% số
này sẽ chuyển thành ung thư gan [10]. Trong thời gian gần đây, các nhà khoa học đã
phát hiện thêm loại virus gây viêm gan nữa là virus G, tuy nhiên cũng chưa thấy tài
liệu nào công bố virus này có gây viêm gan mạn hay không [10]
- Viêm gan mạn do thuốc hoặc hóa chất: Nguyên nhân thường gặp là do dùng một
hay nhiều loại thuốc/ chất độc đối vớ
i gan trong thời gian dài như dùng thuốc điều
trị lao, thuốc sốt rét, thức ăn chứa formon hoặc do nhiễm độc nghề nghiệp, do tiếp
xúc với hóa chất độc hại thường xuyên. Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật không
đúng phương pháp cũng gây nhiều tác hại đến sức khỏe nói chung và đặc biệt là gây
tác hại với tế bào gan. Theo thống kê của trung tâm ADR quốc gia năm 2006, ADR
do thuốc chống lao
đứng thứ hai sau ADR do kháng sinh, trong đó gặp nhiều trường
hợp viêm gan do dùng phối hợp Isoniazid phối hợp Rifampicin [4].
- Viêm gan mạn do rượu: Viêm gan do rượu được biết đến từ lâu, rượu chuyển hóa
ở gan tạo các gốc tự do, các gốc tự do này tấn công vào các thành phần tế bào, kết
hợp với các protein làm tăng quá trình peroxy hóa lipid dẫn đến tình trạng màng
lipid bị phá hủy, ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của màng tế bào. Bên cạnh đó rượu
còn làm giả
m glutathion ( GSH) nội bào thông qua hàng loạt các cơ chế khác nhau.

4

Như vậy tổn thương gan do rượu là do tăng quá trình peroxy hóa lipid và làm giảm
các chất chống oxy hóa [10], [35].
- Viêm gan mạn tính tự miễn: Là tình trạng mất khả năng thích ứng miễn dịch của
gan với chính các tổn thương gan. Nguyên nhân và cơ chế chưa rõ song viêm gan
mạn tính tự miễn luôn có mặt các tự kháng thể và tăng gama globulin máu [10].
- Viêm gan tiềm tàng: Là những trường hợp có biểu hiện tình trạng viêm gan mạn
tính nhưng không tìm được nguyên nhân. Hiện nay với các phương pháp nghiên cứu
hiện đại như y sinh học phân tử, miễn dịch học, thì viêm gan tiềm tàng đã giảm do
đã xác định được nguyên nhân và điều trị kịp thời [10].
2.1.2. Một số xét nghiệm thường dùng để đáng giá tổn thương gan
Gan là cơ quan quan trọng trong cơ thể, được thể hiện thông qua các chức năng
do gan đảm nhận. Các xét nghiệm của hệ thống gan, mật rất đa dạng và phong phú,
có vai trò lớn trong quá trình chẩn
đoán và tiên lượng bệnh. Khi tế bào gan bị tổn
thương, một số enzym có nhiều trong gan sẽ được giải phóng vào máu. Do vậy để
đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan sẽ dựa vào việc tiến hành các xét nghiệm xác
định hoạt độ các enzym có nguồn gốc ở gan trong máu và thăm dò hình thái mô
bệnh học của gan.[16],[22].
* Trên lâm sàng: Để thăm dò sự huỷ hoại tế bào gan thường xác định hoạt độ của
các enzym transaminase trong huyết thanh vì khi tế
bào gan bị tổn thương các
enzym này thường thay đổi sớm nhất và có tính chất đặc trưng. Trong số đó có hai
loại enzym được chú ý nhất , đó là :
1. AST ( Aspartat aminotransferase): Enzym này có ở hai nơi trong tế bào . Phần
lớn nó tồn tại trong ty thể và một phần nhỏ trong bào tương. Enzym này có ở nhiều
mô khác nhưng nhiều nhất ở cơ tim, gan và cơ xương [19],[22]
2.ALT (Alanin aminotransferase): Là enzym chỉ có trong bào tương, đặc trưng cho
các bệnh lý ở gan vì có mặt nhiều nhất ở
gan, rất ít ở cơ tim và cơ vân [19], [22].
Trong viêm gan do virut hoặc do nhiễm độc, hoạt độ AST và ALT trong huyết

thanh phản ánh mức độ huỷ hoại tế bào gan đều tăng cao và tăng sớm nhưng ALT
tăng nhiều hơn [19], [30]. Các enzym này xuất hiện trong máu trước khi có triệu
chứng lâm sàng và hết muộn sau khi các triệu chứng lâm sàng đã hết. Đặc biệt các
enzym này tăng rất cao trong nhiễm độc carbon tetraclorid, nhiễm độc rượu cấp có
mê sảng hoặc nhi
ễm độc các hoá chất như phospho (có thể tăng gấp 100 lần so với
bình thường) [22].
Ngoài hai enzym AST và ALT thì một số chỉ số sinh hoá khác trong huyết thanh
như bilirubin, protein toàn phần, albumin, cholesterol toàn phần, phosphatase
kiềm cũng biến đổi khi gan bị tổn thương [8 ], [19], [30].
* Trên thực nghiệm : Để đánh giá tổn thương gan trên thực nghiệm, ngoài các
xét nghiệm hoá sinh máu còn thông qua việc đánh giá mô bệnh học quan sát đại thể

5
và cấu trúc vi thể gan. Ngoài ra, để góp phần tìm hiểu cơ chế tác dụng của thuốc có
liên quan đến tác dụng chống oxy hoá hay không? thường định lượng
malondialdehyd (MDA). Mô hình gây tổn thương gan bằng CCl
4
và PAR trong cơ
chế đều có điểm chung là các chất này bị chuyển hoá ở gan và tạo thành các gốc tự
do. Chính các gốc tự do này sẽ phản ứng với lớp lipid kép của màng tế bào gây ra sự
peroxy hoá lipid màng tế bào, từ đó gây tổn thương và huỷ hoại tế bào gan. MDA là
sản phẩm sinh ra trong quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào do đó xác định nồng
độ MDA trong gan có thể đánh giá được quá trình peroxy hoá lipid.
2.2 Thuốc và phương pháp điều trị viêm gan
2.2.1. Thuốc đ
iều trị viêm gan
* Nhóm thuốc kháng virut
- Các thuốc có tác động đến hệ thống miễn dịch: Interferon alpha (IFNα),
Corticoid, Levamisol, Thymosin, các Cytokin

Trong các loại thuốc này IFNα dược sử dụng khá rộng rãi trong điều trị viêm gan
virut B và C trong hơn một thập kỷ nay. Tuy nhiên tác dụng kháng virut của IFNα là
không đặc hiệu và hiệu quả cũng còn hạn chế. Nhiều nghiên cứu cho thấy sử dụng
IFNα liều 3-5 triệu UI trong thời gian từ 16 đến 24 tu
ần (4-6 tháng) chỉ khoảng 30-
40% số người dùng có chuyển đảo huyết thanh và khoảng 10% mất HBV-DNA. Sau
khi ngừng thuốc một thời gian, khoảng 50% số bệnh nhân tái phát, xuất hiện HBV-
DNA trở lại. Mặt khác các IFNα tái tổ hợp hiện nay còn nhiều tác dụng không mong
muốn và đắt tiền, hơn nữa cần điều kiện bảo quản khá nghiêm ngặt ( nhiệt độ bảo
quản 2-8
0
C), nhất là khi vận chuyển xa gặp nhiều khó khăn. Gần đây nhiều tác giả
còn nhận thấy sử dụng IFNα ( nhất là dạng IFNα2a) , khi vào cơ thể có tính kháng
nguyên vì thế cơ thể sẽ sinh kháng thể và như vậy làm giảm tác dụng điều trị.[55]
- Các thuốc tương tự nucleosid : Các chất tương tự nucleosid điều trị viêm gan
mạn thường được sử dụng là Lamivudine (LAM). LAM cũng như các ch
ất tương tự
nucleosid khác gây ức chế quá trình tổng hợp ADN của virut . Sử dụng LAM cho
bệnh nhân với liều 100mg hàng ngày sau 12 tháng thấy tỷ lệ chuyển đảo huyết thanh
16-18% (so với nhóm dùng giả dược tỷ lệ này là 4-6%). Tỷ lệ này tăng lên khi dùng
LAM kéo dài 2,3,4 năm. Do thuốc ít độc tính nên có thể dùng kéo dài. Như vậy
dùng thuốc dài ngày gây tốn kém cho bệnh nhân nhưng quan trọng hơn là hiện nay
đã xuất hiện dòng đột biến kháng Lamivudin [43].
* Nhóm thuốc bảo vệ
tế bào gan
- Cơ chế tác dụng của thuốc bảo vệ gan
Các thuốc bảo vệ gan (Hepatoprotective drug) có tác dụng duy trì sự ổn định của
tế bào gan, làm cho tế bào gan vững bền trước sự tấn công của các tác nhân gây
bệnh. Đề bảo vệ tế bào gan, các loại thuốc này có thể tác dụng theo các cơ chế sau:

6
+ Ngăn cản sự chuyển hóa các thuốc hoặc hóa chất khi vào cơ thể thành các chất
độc với gan.
+ Dọn sạch gốc tự do khi được hình thành.
+ Làm bền vững màng tế bào, giúp tăng sức chống đỡ với các tác nhân gây bệnh.
- Hiện nay có nhiều thuốc bảo vệ gan đã được nghiên cứu và sử dụng trong điều
trị đặc biệt có nhiều thuốc có nguồn gốc thảo dược như Legalon (silymarin),
Abivina (bồ bồ), Dihacharin (Diệp hạ châu đắng), Hana (Cà gai leo)[3].
- Một số dược liệu được dùng chữa bệnh gan, mật
Bồ bồ (Herba Adenosmatis indiani)

-Thành phần hóa học: Bồ bồ chứa 0,8% tinh dầu, saponin, flavonoid, acid nhân
thơm và coumarin. Đã nhận dạng được 7 chất trong tinh dầu bồ bồ là L-Fenchon
chiếm 33,5%, L- Limonen 28,6%, Humulen 11,6%, Xineol 5,9%, Fenchol,
Piperitenon oxyd, Geranyl acetat [ 3].
-Tác dụng sinh học [3]:
+ Tác dụng làm tăng tiết mật : Dịch chiết bằng ethanol 40% có tác dụng làm tăng
tiết mật 45% trên chuột lang so với lô đối chứng trong khi đó tinh dầu bồ bồ và dịch
chiết nước có tác dụng yếu hơn với lần lượ
t là tăng tiết mật 29% và 20% so với lô
đối chứng.
+Tác dụng thải độc của gan, nghiệm pháp BSP: Tốc độ thải trừ BSP trên chuột
lang của lô uống dịch chiết ethanol 40% là 50,99%, của lô uống tinh dầu bồ bồ là
48,5% so với lô chứng. Trong khi đó chỉ số BSP của lô uống dịch chiết nước không
thay đổi so với lô chứng.
+ Tác dụng chống viêm cấp: Cả ba loại chế phẩm dịch chiết ethanol 40%, dị
ch
chiết nước và tinh dầu bồ bồ đều có tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù
chân chuột bằng kaolin, trong đó dịch chiết nước có tác dụng mạnh nhất sau đó đến
dịch chiết ethanol và tinh dầu có tác dụng yếu hơn cả

+ Tác dụng chống viêm mạn: Cả ba loại chế phẩm dịch chiết ethanol 40%, dịch
chiết nước và tinh dầu bồ bồ đều có tác dụng chống viêm mạn trên mô hình u hạt
th
ực nghiệm, trong đó dịch chiết nước và dịch chiết ethanol có tác dụng tương
đương còn tinh dầu có tác dụng yếu so với hai chế phẩm trên.
+ Độc tính
Độc tính cấp : Không xác định được LD
50

Độc tính bán mạn : Không ảnh hưởng đến các chức năng tạo máu, chức năng
gan, thận.
- Ứng dụng trong điều trị

7
Bồ bồ được dùng chữa cảm sốt, viêm gan, vàng da, viêm ruột, làm thuốc kích
thích ăn ngon cho phụ nữ sau khi sinh [3 ],[6]
Một chế phẩm được bào chế từ bồ bồ có bổ sung tinh dầu (đặt tên là Abivina)
cuả Viện Dược liệu đã thử lâm sàng trên bệnh nhân viêm gan virus bệnh viện Nhi
trung ương, viện quân y 103 có tác dụng tốt vì vậy thuốc đã được Cục Dược, Bộ Y
tế cấp giấy phép sản xuất

Diệp hạ châu đắng (Herba phyllanthi amari)
-Thành phần hóa học: Lá diệp hạ châu đắng chứa các chất đắng hypophylanthin,
phylanthin. Ngoài ra còn có flavonoid (1,15%), alcaloid kiểu securinin như
niuroidin, isobubialin, epibubianin, quercetin, quercitrin, các acd hữu cơ,
tanin(7,78%) [3 ].
-Tác dụng sinh học [3 ]
+ Tác dụng bảo vệ gan
Cao diệp hạ châu đắng có tác dụng bảo vệ gan trên chuột cống trắng được gây
nhiễm độc gan bằng carbon tetraclorid, làm giảm hàm lượng colagen trong máu, làm

giảm mức độ xơ hóa, làm giảm men gan ở gan động vật so với lô đối chứng.
Các thành phần hóa họ
c trong diệp hạ châu đắng có tác dụng bảo vệ gan là
lignan phyllanthin và hypophyllanthin. Tuy nhiên các thành phần này có tác dụng
độc với hệ thần kinh.
+ Cơ chế tác dụng bảo vệ gan là do cao diệp hạ châu đắng có hoạt tính chống oxy
hóa, làm giảm lượng MDA 28,7% trên động vật thí nghiệm so với lô đối chứng.
+ Cao diệp hạ châu đắng có tác dụng lợi tiểu
+ Cao diệp hạ châu đắng có tác dụng lợi mật
- Ứng dụng trong điều tr
ị.
Diệp hạ châu được dùng làm thuốc điều trị viêm gan, vàng da, sốt, đau mắt, rắn
cắn [ 6 ]
Thuốc Dihacharin được bào chế từ Diệp hạ châu đắng đã được thử nghiệm lâm
sàng tại Viện quân y 103 trên bệnh nhân viêm gan B mạn có kết quả tốt. Sản phẩm
là kết quả của Đề tài nghiên cứu độc lập cấp nhà nước do PGS.TS Nguyễn Thượng
Dong ( Viện Dược liệu ) chủ
trì đã được Cục Dược, Bộ Y tế cấp giấy phép sản xuất
Actiso (Folium Cynarae scolymi)

-Thành phần hóa học: Lá Actiso chứa acid hữu cơ gồm cynarin, acid malic, acid
succinic, các hợp chất flavonoid và nhiều chất vô cơ.
- Tác dụng sinh học

8
+ Tác dụng lợi mật: Dung dịch actiso tiêm tĩnh mạch gây tăng mạnh lượng mật
bài tiết
+Tác dụng lợi tiểu: Uống hoặc tiêm dung dịch actiso làm tăng lượng nước tiểu,
làm giảm lượng cholesterol và urê huyết.
- Ứng dụng trong điều trị

Actiso được dùng làm thuốc thông tiểu, thông mật chữa các bệnh suy gan, thận,
viêm thận cấp và mạn.
Nghệ vàng (Rhizoma Curcumae longae)

-Thành phần hoá học: Trong thân rễ nghệ vàng có rất nhiều thành phần hoá học
như tinh dầu, chất béo, chất vô cơ và nhóm chất màu. Trong đó nhóm chất màu
được nghiên cứu nhiều về tác dụng sinh học. Nhóm chất màu curcuminoid gồm 3
chất là curcumin, demethoxycurcumin và bis demethoxycurcumin.
-Tác dụng sinh học: Curcuminoid có tác dụng bảo vệ và phục hồi tổn thương gan
cấp thông qua hai cơ chế [3],[20]
+ Ức chế isoenzym của CYP ( CYP2E
1
), ngăn chặn quá trình chuyển hoá PAR
thành chất độc N-acetyl- benzoquinoneimin (NAPQI) và CCl
4
thành CCl
3

+ Chống oxy hoá, ức chế quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào gan.
- Ứng dụng trong điều trị: Nghệ vàng được dùng trong Y học cổ truyền để chữa
các bệnh về gan, mật [3]. Curcuminod được dùng như một loại thực phẩm chức
năng để phòng chống ung thư như ung thư đường tiêu hoá, gan hoặc một số trường
hợp ung thư khác.
Ngoài ra còn rất nhiều các dược liệu khác đã được nghiên cứu tác dụng b
ảo vệ
gan như cà gai leo, nhàu, nhó đông, chàm tía, nhân trần, chè đắng [6].
2.2.2. Các phương pháp điều trị viêm gan
- Viêm gan mạn tính: Cho đến nay bệnh viêm gan mạn không có biện pháp điều trị
đặc hiệu.
+ Với viêm gan mạn tính giai đoạn ổn định thì chế độ ăn và sinh hoạt hợp lý là

quan trọng, đó là chế độ ăn giàu năng lượng và vitamin, giảm mỡ, bỏ rượu, bia và
hạn chế lao động nặng [10], [33]
+ Với viêm gan m
ạn tính giai đoạn tiển triển thì ngoài chế độ ăn và sinh hoạt hợp
lý phải kết hợp dùng thuốc điều trị.
- Đối với viêm gan do virus: Điều trị nguyên nhân bằng các thuốc kháng virus
như Lamivudin, Entercavir, Inteferol. Bên cạnh việc dùng các thuốc này kết hợp
việc điều trị dự phòng biến chứng, giải quyết tình trạng viêm gan, điều trị dự phòng
xơ gan và ung thư gan bằng các thuốc b
ảo vệ tế bào gan hoặc các thuốc giúp phục
hồi các tổn thương tế bào gan.

9
- Đối với viêm gan do thuốc/ hóa chất độc ngoài việc loại bỏ các tác nhân gây độc
này phải dùng thêm các thuốc giúp phục hồi và bảo vệ tế bào gan.
- Đối với viêm gan tự miễn điều trị bằng cách dùng liệu pháp Corticoid [25].
- Đối với viêm gan tiềm tàng : Điều trị triệu chứng là chủ yếu nếu chưa tìm được
căn nguyên [10].
2.3. Tổng quan về cây cỏ mật (Eriochloa procera (Retz.) C.Hubb. (Syn. E.
ramosa (Retz.) Hack.)
2.3.1. Một số
loài trong chi Eriochloa H.B.K (Cỏ mật)
Theo tài liệu “Danh mục các loài thực vật ở Việt Nam”, tập III của 2 cơ sở Đại
học Quốc Gia và Viện Sinh thái tài nguyên phối hợp soạn thảo, xuất bản năm 2005
cho biết chi cỏ mật (Eriochloa H.B.K) ở Việt Nam có 03 loài [ 27 ].
* Eriochloa polystachya H.B.K 1815 (CCVN, 3:813), Cỏ mật to, Cỏ mật nhiều
gié
- Phân bố: An Giang (Long xuyên, Mỹ luông ), nguyên sản Mêhicô.
- Dạng sống và sinh thái: Cỏ thuỷ sinh, dài 1,4-2m. Mọc ở ruộng nước, kênh r
ạch.

- Công dụng: Làm thức ăn cho gia súc.
* Eriochloa villosa (Thunb.) Kuath. 1829- Paspalum villosum Thunb. 1784-
Panicum tuberculiflorum Steud. 1854- Cỏ mật lông, Cỏ mật nhiều lông
- Phân bố: Cao Bằng, còn có ở Ấn Độ, Trung quốc, Nhật Bản
- Dạng sống và sinh thái : Cỏ 1 năm, cao 30-100cm. Mọc ở ven bờ kênh, rạch,
ruộng nước.
- Công dụng: Làm thức ăn cho gia súc
*Eriochloa procera ( Retz.) C. Hubb.1930 ( CCVN,3 : 813) - Agorostis procera
Retz. 1786 - Milium ramosum Retz. 1791- Eriochloa ramosa (Retz.) Hack.1906 , Cỏ
mật thân cao
- Phân bố: Bắc bộ, Trung bộ, Cần Thơ, còn có ở Trung Qu
ốc, Thái Lan và một số
nước nhiệt đới khác ở châu Á, châu Phi, châu Mỹ
- Dạng sống và sinh thái: Cỏ 1 năm, cao 30-150cm. Mọc ở ruộng hoang, bãi cỏ
ven đường.
- Công dụng: Làm thức ăn cho gia súc
2.3.2 Tổng quan về cỏ mật thân cao ( Eriochloa procera (Retz.) C.Hubb. (Syn.
E. ramosa (Retz.) Hack.)

10
Ảnh 2.1. Ảnh của loài Eriochloa
procera (Retz.) C.Hubb. (Syn. E.
ramosa (Retz.) Hack. )





* Đặc điểm thực vật [3]
Cây thảo, sống lâu năm. Rễ hình sợi, mọc dầy đặc. Thân khí sinh mọc thành bụi

dầy, nhẵn, có lông ở các đốt, cao 0,3-1,5m. Lá mọc so le, hình dải,đầu lá nhọn, mép
hơi nháp, bẹ lá xoè rộng, lưỡi bẹ ngắn, có lông.
Cụm hoa mọc thành bông đơn hoặc phân nhánh, dài 5-13cm, cuống chung
mảnh, nhẵn, bông nhỏ xếp lớp rất thưa mọc so le, hơi thẳng đứng, hình bầu dục
nh
ọn, có lông cứng ở đỉnh, không có mày ngoài, mày trong mềm nhọn, mép hơi gập
lại, có lông mềm, cuống bông nhỏ, có lông, hoa ở dưới không sinh sản, hoa ở trên
lưỡng tính dẹt, màu xám, bóng, 3 nhị, chỉ nhị hình sợi, bầu thuôn dẹt, nhẵn, có 2 vòi
nhuỵ, núm nhuỵ phát triển, màu hung đen nhạt.
Quả nằm trong mày hoa, góc rất nhọn, tù ở đầu, nhẵn, dẹt, có vòi tồn tại
* Phân bố, sinh thái: Mọc hoang ở vùng đồng bằng và trung du.
Cây ưa sáng, thường mọ
c trên đất ẩm lẫn với các loại cỏ khác ở bãi sông, ruộng
trồng hoa màu, ven đường hay nương rẫy. Cây con mọc từ hạt vào khoảng cuối
tháng 3 đến tháng 5, sau mùa hoa quả, cây tàn lụi.
Cỏ mật là nguồn thức ăn cho trâu, bò và có hại cho cây trồng.
* Thành phần hóa học
Theo tác giả Lê Văn Công, trong cỏ mật có tinh dầu, hàm lượng này ở cây tươi
là 0,0012-0,02% còn cây khô là 0,12-0,2%. ngoài ra trong cỏ mật còn có flavonoid,
peptit, acid amin. [11]
* Tác dụng sinh học
- Theo các tác giả Lê Văn Công, Đỗ Trung Đàm, cao c
ỏ mật (chiết bằng ethanol

11
80%) có tác dụng hạ sốt trên mô hình gây sốt bằng men bia ở chuột cống trắng với
liều 0,5g/kg và 1g/kg thân trọng, tác dụng này tuy kém analgin (liều 200mg/kg)
nhưng đến giờ thứ năm vẫn còn giữ được [3], [11]
- Vẫn theo các tác giả trên, cao cỏ mật còn có tác dụng giảm đau trên mô hình
gây đau bằng acid acetic trên chuột [12].

- Kết quả nghiên cứu của sinh viên Nguyễn Thị Thanh Xuân trong khoá luận tốt
nghiệp đại học cho biết cao cỏ mật ( chiế
t bằng ethanol 90% ) có tác dụng lợi mật,
lợi tiểu, giảm đau (theo phương pháp gây đau bằng mâm nóng) và hạ sốt trên chuột
nhắt trắng [26].
* Công dụng
Cỏ mật được dùng theo kinh nghiệm của nhân dân một số vùng như Sơn Tây,
Nam Định để chữa cảm sốt, cúm, sốt xuất huyết.[3],[11]
Cho đến nay (2008) chưa tìm thấy công trình nghiên cứu nào của các tác giả
nước ngoài về thành phần hoá học và tác dụng dụng sinh h
ọc của cây cỏ mật thân
cao
3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nguyên liệu
- Nguyên liệu để nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng
sinh học là cây cỏ mật thu hái tại Đông Anh- Hà Nội vµo thêi ®iÓm c©y b¾t ®Çu ra
hoa
- Nguyên liệu để nghiên cứu tác dụng sinh học là các lớp chất chiết xuất và phân
lập từ toµn c©y cỏ mật ( bá rÔ ), liều thí nghiệm được tính tương đương với d
ược
liệu
3.2. Hóa chất và động vật thí nghiệm
3.2.1 Thuốc và hóa chất phục vụ nghiên cứu tác dụng sinh học
- Carbon tetraclorid của hãng Placebo (CE), paracetamol (Trung Quốc),
carboxymethylcellulose (CMC) (Thuỵ Điển). Dầu olive (Thailand). Silymarin (biệt
dược Legalon) dạng viên nén, hàm lượng 70mg của hãng Madaus (Korea).
- Kít định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: AST, ALT, bilirubin
toàn phần, cholesterol, albumin, creatinin của hãng DIALAB GmbH (Áo).
- Dung dịch xét nghiệm mẫu ABX Minidil LMG của hãng ABX – Diagnostics.
- Các hóa chất nghiên cứu dùng để xác định hàm lượng MDA trong gan: Acid

ascorbic, muối Mohr, acid thiobarbituric, kaliclorid, acid tricloacetic do phòng
Đông y thực nghiệm - Bệnh vi
ện Y học cổ truyền Trung ương cung cấp.
- Các hóa chất làm tiêu bản mô bệnh học do Bộ môn Giải phẫu bệnh - Trường Đại

12
học Y - Hà Nội cung cấp.
3.2.2. Dụng cụ, máy móc phục vụ nghiên cứu tác dụng sinh học
-Máy xét nghiệm huyết học Vet abc TM Animal Blood Counter.
- Máy xét nghiệm sinh hóa máu Screen master của hãng Hospitex Diagnostics
(Italy).
- Máy nghiền đồng thể Stomater 80 (Anh).
- Máy quang phổ Elisa Lx 800 (Mỹ).
- Các dụng cụ thí nghiệm thông thường của bộ môn Dược lý, Bộ môn Giải phẫu
bệnh - Trường Đại học Y Hà Nội và Phòng Đông y thực nghiệm - Bệnh viện Y học
cổ truyền Trung ương và Khoa Dược lý-Việ
n Dược liệu
3.2.3 Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 25,0 ± 2,0 gam
do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.
- Thỏ trắng (chủng Newzealand), cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 2,0 ± 0,2kg
(để nghiên cứu độc tính bán trường diễn) do Trung tâm chăn nuôi - Viện kiểm
nghiệm cung cấp.
- Chuột cống trắng, cả 2 giố
ng, khoẻ mạnh, trọng lượng 150 ± 20g.
Động vật được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại phòng thí
nghiệm từ 3 - 5 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu tại Bộ
môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội và Khoa Dược lý- Viện Dược liệu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật

Thu thập các mẫu cây tại nhiều địa phương, mô t
ả hình thái, đối chiếu với các tài
liệu để xác định tên khoa học.
3.3.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học trong dược liệu
* Nghiên cứu định tính các thành phần hóa học.
- Định tính các thành phần hóa học bằng các phản ứng hóa học [ 2 ]
- Định tính các thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng [ 2 ], [6 ]
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel, DC-Alufolien
60 F
254
( Merck 1,05715), RP
18
F
254s
(Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở các
bước sóng 254nm, 366nm hoặc dùng thuốc thử tương ứng phun đều lên bản mỏng,
sấy khô đến khi hiện màu
* Phương pháp định lượng một số thành phần hóa học

13
- Định lượng các chất tan trong ethyl acetat có trong cao nước và cao cồn : Dược
liệu (cân và xác định độ ẩm) được chiết nước hoặc chiết bằng ethanol, sau đó cô đến
cao lỏng. Lắc cao lỏng với ethyl acetat nhiều lần, gạn lớp ethyl acetat, làm bay hơi
dung môi và làm khô cắn. Cân cắn để tính hàm lượng các chất tan trong ethyl acetat
trong cao nước và cao cồn cỏ mật.
-Định lượng nitơ amin có trong cao nước và cao cồn theo phương pháp ghi trong
DĐVN I, tập 1.[5]
Dược liệu (cân và xác đị
nh độ ẩm) được chiết nước hoặc chiết bằng ethanol, sau đó
cô đến cao khô. Cân cao khô. Lấy 1g cao thêm 40ml nước, đun cánh thủy cho tan

hết, để nguội. Thêm vào 1g bari clorid (TT) và 1,5ml dung dịch bari hydroxyd bão
hòa trong methanol, khuấy cho tan hết. ChuyÓn dung dịch này vào bình định mức
200ml, thêm nước đến vạch. Để yên khoảng 1giờ. Lọc, bỏ 30ml dịch lọc đầu. Lấy
100ml dịch lọc cho vào bình nón, thêm dung dịch acid hydrocloric 0,1N để điều
chỉnh pH tới 6,8 bằng pH mét. Thêm 10ml focmol trung tính. Chuẩn
độ bằng dung
dịch natri hydroxyd 0,1N đến pH = 9,2 ( đo bằng pH mét ).
Hàm lượng nitơ amin trong chế phẩm ( cao nước, cao cồn ) được tính toán dựa trên
kết quả chuẩn độ với 1ml dung dịch natri hydroxyd 0,1N tương ứng với 0,0014g
nitơ
* Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số chất.
- Nghiên cứu chiết xuất: Chiết xuất các chất trong dược liệu bằng phương pháp
ngâm hoặc chiết nóng với các lo
ại dung môi khác nhau.
- Phương pháp phân lập các chất
+ Phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60
GF
254
( Merck 10575),. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở các bước sóng 254nm,
366nm hoặc cắt rìa bản mỏng đề phun thuốc thử, hơ nóng để phát hiện vết. Ghép lại
bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, cạo lớp silicagel có chất , giải hấp phụ
bằng dung môi thích hợp.
+ Phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silicagel pha thường và pha đả
o.
Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063mm ( 240-430 mesh). Silicagel pha
đảo ODS hoặc YMC (30-50µm, Fujisilisa chemical Ltd.)
- Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất.
+ Điểm nóng cháy đo trên máy Kofler microhotstage của Viện hóa học các hợp

chất thiên nhiên
+ Độ quay cực [α]
D
đo trên máy JASCO DIP-1000KUY polarimeter của Viện Hóa
học thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam

14
+ Phổ khối ( ESI-MS) : Phổ khối lượng phun mù điện tử ( Eletron spray ionization
mass spectra )đo trên máy AGILENT 1100LC-MSD Trap của Viện hóa học các hợp
chất thiên nhiên.
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (MNR) :
1
H-NMR (500MHz),
13
C-NMRR (
125MHz) đo trên máy Brruke AM500FT-NMR Spectrometer của Viện hóa học
thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam.
3.3.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học.
3.3.3.1.Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan
* Mô hình gây tổn thương gan cấp bằng carbon tetraclorid (CCl
4
) trên chuột
nhắt trắng:
Chuột nhắt trắng được chia thành nhiêu lô, mỗi lô 10 con:
+ Lô 1 (chứng sinh học- C
sh
): Uống nước cất + tiêm dầu olive
+ Lô 2 (chứng bệnh lý- C
bl
) : Uống nước cất + tiêm CCl

4

+ Lô 3 (chứng dương) : Uống silymarin 67mg/kg + tiêm CCl
4

+ Lô 4, lô 5 (thử thuốc) Uống cao cỏ mật với liều tương ứng + tiêm CCl
4.

- Trình tự tiến hành thực nghiệm :
+ Chuột được uống nước cất hoặc thuốc liên tục trong 7 ngày, mỗi ngày 1 lần vào
buổi sáng.
+ Ngày thứ 8, sau khi uống thuốc 1 giờ, gây tổn thương gan chuột ở các lô 2, 3, 4, 5
bằng cách tiêm màng bụng dung dịch CCl
4
0,5ml/kg (pha 0,5ml CCl
4
trong 3,5ml
dầu olive, tiêm 0,04ml/10g). Chuột ở lô 1 được tiêm màng bụng dầu olive với cùng
thể tích.
+ Trước khi gây độc 14 - 16 giờ, cho chuột nhịn đói, 24 giờ sau khi gây độc, lấy
máu động mạch cảnh để định lượng enzym AST, ALT và bilirubin, đồng thời lấy
gan để xác định trọng lượng, nồng độ MDA và quan sát mô bệnh học (đại thể, vi
thể).
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ thời gian làm thực nghiệm NC tác dụng bảo v
ệ gan trên
mô hình gây tổn thương gan bằng CCl
4

ngày
lấy máu và gan
tiêm CCl
4
Uống thuốc hoặc uống nước cất
1 2 3 4 5 6 7 8 9

15
- Định lượng hoạt độ AST, ALT theo phương pháp Reitman-Franker [30]
- Xác định nồng độ MDA
Nồng độ MDA được xác định theo phương pháp Mitsuru Uchiyama và Midori
Mihama. MDA là sản phẩm chuyển hóa trung gian của quá trình peroxy hóa lipid,
MDA phản ứng với acid thiobacbituric tạo phức trimethine màu hồng, có đỉnh hấp
thụ cực đại ở bước sóng 530-532nm.
Mức độ hấp thụ màu OD (X
E
) của dung dịch đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA.
Hàm luợng MDA được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn
MDA trong cùng điều kiện.
Cách tiến hành: Giết chuột nhắt trắng, mổ lấy gan, bảo quản gan trong đá lạnh. Cân
400mg gan, nghiền trong 9,6ml dung dịch KCl lạnh (1 lít dung dịch chứa 1,2g KCl)
trên máy nghiền đồng thể.
Dung dịch phản ứng gồm 2ml dung dịch đồng thể gan chuộ
t + 0,4ml dung
dịch acid ascorbic 0,04352% + 0,4ml dung dịch muối Mohr 0,001645%.
Đặt các ống chứa dung dịch phản ứng trong bình điều nhiệt ở 37
0

C trong 30
phút sau đó thêm 0,5ml dung dịch acid tricloacetic 40%, ly tâm dung dịch phản ứng
với tốc độ 3000vòng/ phút trong 10 phút ở 4
0
C. Lấy 0,1ml dịch nổi cho phản ứng
với 0,5ml acid thiobarbituric, đun sôi trong 20 phút, để nguội ở nhiệt độ phòng. Đo
độ hấp thụ màu của dung dịch phản ứng ở bước sóng 532nm.
- Quan sát mô bệnh học: Sau khi giết chuột, gan được lấy ra quan sát đại thể. Sau
đó lấy một mẩu gan nhỏ ở mỗi phân thuỳ gan, cố định trong dung dịch formalin
trung tính tối thiểu trong 1 tuần. Bệnh phẩm được làm khô trong các mẫu ethanol
75-100% tr
ước khi cố định trên nến. Cắt từng lát mỏng 5µm, nhuộm với
hematoxylin và eosin (HE), đem soi trên kính hiển vi quang học quan sát cấu trúc vi
thể gan
*Mô hình gây tổn thương gan cấp bằng paracetamol (PAR): Chuột nhắt trắng
được chia ngẫu nhiên thành nhiều lô, mỗi lô 10 con :
+ Lô 1 (C
sh
) : Uống nước cất + uống CMC 1%
+ Lô 2 (C
bl
): : Uống nước cất + uống PAR
+ Lô 3 (chứng dương) : Uống silymarin 67 mg/kg +uống PAR
+ Lô 4 , lô 5 (thuốc nghiên cứu): Uống cao cỏ mật liều tương ứng + uống PAR.
Chuột được uống nước cất hoặc thuốc liên tục trong 7 ngày như trong mô hình gây
tổn thương gan bằng CCl
4
. Ngày thứ 8 sau uống thuốc 1 giờ, và nhịn đói 16-18 giờ
trước đó, gây độc cho chuột ở các lô 2, 3, 4, 5 bằng uống PAR liều 400mg/kg pha
trong carboxymethylcellulose (CMC) 1% với thể tích 0,2ml/10g. 48 giờ sau khi uống

paracetamol, lấy máu động mạch cảnh để định lượng enzym AST, ALT và bilirubin,
đồng thời lấy gan để xác định trọng lượng, nồng độ MDA và quan sát mô bệnh học.

16
3.3.3.2.Nghiên cứu tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan
Chuột nhắt trắng, được chia thành 7 lô, mỗi lô 10 con. Gây tổn thương gan chuột
bằng cách tiêm màng bụng CCl
4
3 ngày liên tục, với liều 0,2ml/kg/ngày (pha 0,2ml
CCl
4
trong 3,8ml dầu olive, tiêm 0,04ml/10g). Ngày thứ ba, sau khi tiêm CCl
4
1 giờ
bắt đầu cho uống nước cất, sylimarin (67mg/kg) hoặc cao cỏ mật (9,0g/kg) tương
ứng với từng lô theo sơ đồ 3.2. Chuột được lấy máu động mạch cảnh để định lượng
các enzym AST, ALT và bilirubin, lấy gan để xác định trọng lượng, nồng độ MDA
và làm tiêu bản mô bệnh học ở các thời điểm sau uống thuốc 2 ngày và 4 ngày.

Sơ đồ 3.2 Thời gian làm thực nghiệm nghiên cứu tác dụng tăng phục hồi tổn
thương gan

Ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7

Lô 1 tiêm dầu olive nước cất nước cất giết 5 chuột

Lô 2 tiêm CCl
4
nước cất giết 5 chuột

Lô 3 tiêm CCl
4
silymarin giết chuột

Lô 4 tiêm CCl
4
cỏ mật

Lô 5 tiêm CCl
4
nước cất

Lô 6 tiêm CCl
4
silymarin giết chuột

Lô 7 tiêm CCl
4
cỏ mật

3.3.3.3. Tác dụng hiệp đồng giấc ngủ của cỏ mật với phenobarbital
Phương pháp nghiên cứu tác dụng hiệp đồng giấc ngủ của cỏ mật với
phenobarbital.
- Cách tiến hành: Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 20
con
+ Lô 1: (lô chứng) Uống nước cất (cùng thể tích với cao cỏ mật), 30 phút sau
tiêm phenobarbital 100mg/kg
+ Lô 2: Uống cao cỏ mật liều 4,5g/kg, 30 phút sau tiêm phenobarbital
100mg/kg
+ Lô 3: Uống cao cỏ mật liều 9,0g/kg, 30 phút sau tiêm phenobarbital

100mg/kg
- Đ
ánh giá kết quả dựa vào thời gian tiềm tàng và thời gian ngủ của chuột.