Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật (tt) ppsx

Giới thiệu một số kỹ thuật
bảo quản vi sinh vật (tt)




5. Một số phương pháp phổ biến
sử dụng trong bảo quản các nhóm
vi sinh vật cụ thể:
Trong phần này chúng tôi
giới thiệu cụ thể một số phương
pháp thông dụng nhất.
5.1. Các phương pháp dùng cho
bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn:
Bảo quản vi khuẩn:
a. Phương pháp đông khô
(Freeze drying/
lyophilization):
Đây là phương pháp phổ biến
được sử dụng tại mọi bảo tàng vi
sinh vật trên thế giới. Phương pháp
đông khô hạn chế được sự thay đổi
các đặc tính của vi sinh vật và bảo
quản được trong một thời gian dài.
Phương pháp đông khô được
trình bày ở đây là phương pháp
được dùng tại NCTC (National
Colleciton Type Culture, Anh).

1, Nuôi vi khuẩn cho đông
khô:
Vi khuẩn được cấy trên môi
trường ống thạch nghiêng thích
hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn
bị dịch vi khuẩn trên môi trường
dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế
bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào
cũng rất quan trọng do đó thường
chọn tế bào nằm trong pha sinh
trưởng log.
2, Chuẩn bị đệm mẫu:
Có thể dùng một trong hai
loại đệm sau:
+ Đệm huyết thanh- inositol;
Meso-inositol: 5 gam
Huyết thanh ngựa (số
3): 100 ml
Thanh trùng bằng
phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó
phân 5ml vào các bình vô trùng.
+ Đệm inositol:
Môi trường dinh dưỡng bột số
2: 2.5 gam
Meso-inositol: 5 gam
Nước cất: đủ 100 ml.
Phân 5 ml vào các bình và
khử trùng tại nhiệt độ 121
O
C.

3, Chuẩn bị dịch tế bào:
Mật độ tế bào có ý nghĩa quan
trọng đối với chất lượng bảo quản.
Thông thường có thể thu sinh khối
từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng
cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo
dịch huyền phù tế bào. Mật độ vi
khuẩn thông thường cần đạt
10
10
(đối với vi sinh vật không có
bào tử). Mật độ trên có thể giảm
với các vi sinh vật có bào tử. Hai
đệm pha mẫu trên có thể dùng với
mọi vi khuẩn nhưng trong trường
hợp enterobacteria thì không dùng
đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay
đổi đặc tính miễn dịch của vi
khuẩn.
4, Chuẩn bị ống đông khô:
Ống đông khô được rửa sạch
sau đó ngâm qua đệm với dịch acid
loãng (HCl 2%) và lại được rửa
sạch, làm khô và chuẩn bị nút
bông, ống được thanh trùng khô
hoặc khử trùng theo phương pháp
thông thường.
5, Chuẩn bị mẫu trước khi
đông khô:
Lượng dịch huyền phù vi

khuẩn được đưa cẩn thận bằng
pipet pasteur vào ống đông khô
khoảng 0.1- 0.2 ml. Chú ý mọi thao
tác phải cẩn thận tránh dính mẫu
vào thành hay phía trên của ống
đông khô.
6, Bước tiền đông khô:
Mục tiêu của bước này là làm
bay hơi hết nước có thể bị lạnh
đông tạo đá. Trước khi tiến hành
đông khô mẫu được chuẩn bị qua
bước tiền đông (như trình bày ở
trên) sau đó bước tiền đông khô
tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ
thống đông khô và quá trình làm
mất nước trong điều kiện lạnh được
tiến hành khoảng 3 giờ.
7, Tạo chỗ thắt trên ống
đông khô:
Sau bước tiền đông khô, yêu
cầu phải tạo vết thắt. Việc tạo vết
thắt được thực hiện với hệ thống
đèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay các
cơ sở bảo quản vi sinh vật sử dụng
hệ thống hàn và tạo vết thắt trên
thiết bị tự động.
8, Hậu đông khô:
Trong bước này mẫu lại tiếp
tục được làm khô cho đến độ ẩm
cuối cùng đạt khoảng 1%. Thời

gian cho bước này có thể thay đổi
từ 1-2 giờ.
9, Hàn ống đông khô:
Việc hàn ống trực tiếp trên
thiết bị đông khô (manifold) cần có
kinh nghiệm và cẩn thận. Trước hết
phải tiến hành khoá van và sau đó
mới thực hiện thao tác hàn ống
đông khô.
10, Kiểm tra độ chân không
của ống đông khô:
Người ta sử dụng thiết bị là
đèn phát hiện mức độ chân không.
Với các mẫu đạt độ chân không cần
thiết thì xuất hiện màu xanh tím
nhạt. Đối với các mẫu không đạt
tiêu chuẩn thì không có tín hiệu
hoặc màu tím đậm.
11, Kiểm tra khả năng sống
của mẫu:
Đếm số lượng tế bào là
phương pháp chủ yếu để đánh giá
chất lượng bảo quản. Việc đếm
được thực hiện trước khi và ngay
sau khi đông khô. Các bước kiểm
tra tiếp theo có thể được thực hiện
sau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chất
lượng của mẫu đông khô. Nói
chung khả năng sống của vi sinh
vật có bào tử cao hơn vi sinh vật

không có bào tử và loại gram
dương cao hơn vi sinh vật gram
âm. Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ
khí thì yêu cầu phải được tiến hành
theo đúng qui trình, tránh vi sinh
vật tiếp xúc với oxy.
12, Bảo quản mẫu:
Mẫu thông thường được bảo
quản tại 4
O
C hay nhiệt độ phòng.
b. Phương pháp giữ trong
lạnh sâu:
1, Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu:
Tế bào được nuôi cấy trên
môi trường và nhiệt độ thích hợp
nhất tại giữa hoặc đầu pha log.
2, Pha dịch tế bào với
glycerol hoặc DMSO đã thanh
trùng trước để đạt nồng độ cuối
cùng 10% và mật độ tế bào 10
6
.
3, Dịch huyền phù tế bào
được đưa vào ống lạnh sâu và đóng
nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ
tinh, cần để trong dịch xanh
metylene 0.05% để phát hiện các
ống bị rò rỉ).
Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ

phòng trong 30 phút để cho cân
bằng áp suất thẩm thấu trong và
ngoài tế bào. Trong trường hợp có
nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang
bình nitơ lỏng.
Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng
cần theo tốc độ nhất định. Thông
thường tốc độ lạnh dao động 1-
3
O
C/phút để đạt tới nhiệt độ -30
O
C
ban đầu. Sau đó mẫu được làm lạnh
tiếp với tốc độ cao hơn 10-
15
O
C/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh
cần thiết (-100
O
C đến -80
O
C).
Hiện nay, đã có các thiết bị làm
lạnh sâu được chương trình hoá với
tốc độ mong muốn. Tuy nhiên,
cũng có thể đơn giản hơn là mẫu
ban đầu được đặt trong đá khô sau
đó lại đưa vào tủ lạnh sâu và đặt
thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ -

65
O
C.
4, Hoạt hoá mẫu: mẫu trong
lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được
hoạt hoá bằng cách làm tan nhanh
tới mức có thể (thông thường đưa
ngay vào tủ ấm 37
O
C trong 40-60
giây). Như vậy, theo cách trên có
thể đạt được khả năng sống 95% tế
bào sau 10 năm bảo quản.
c. Một số phương pháp bảo
quản khác: Bảo quản trên gelatin
và silicagel.

Vietsciences- Dương Văn Hợp,
Nguyễn Lân Dũng