Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh (tóm tắt)

- 1 -

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị
cao về dinh dưỡng, kinh tế và là nguyên liệu cho công nghiệp, có tác dụng
cải tạo đất và bảo vệ môi trường. Hiện nay, năng suất và sản lượng đậu
tương ở nước ta còn thấp, chất lượng hạt chưa cao do mức độ ổn định của
giống, ảnh hưởng của nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh và các tác
động bất lợi khác từ ngoại cảnh. Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ
bị nhiễm nhiều loại virus, như Soybean mosaic virus – SMV gây bệnh khảm
lá, Bean yellow mosaic virus – BYMV gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ, và
một số virus gây bệnh khác. Trong đó, SMV và BYMV là những loại virus
gây bệnh khảm có tác động xấu lớn nhất đến cây đậu tương.
SMV và BYMV được lây nhiễm từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp làm
môi giới và virus có thể truyền qua hạt. Khi cây đậu tương bị bệnh, lá cây có
những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn bị biến dạng,
đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chậm phát triển, số lượng quả ít
và biến dạng, sần sùi, có vị đắng và thường lép. Bệnh khảm do SMV và
BYMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, chất lượng và sản lượng hạt đậu
tương. Năng suất đậu tương có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus
trước khi ra hoa và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém
[87]. Việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ gây thiệt hại lớn về
năng suất và chất lượng hạt [95].
Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp
phòng mà chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV. Các biện pháp
phòng bệnh bao gồm chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh đồng
ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt trừ
côn trùng truyền bệnh. Tuy nhiên, các biện pháp trên thường có hiệu quả thấp
và tốn nhiều công sức. Biện pháp có hiệu quả nhất để phòng hai loài SMV và

BYMV là sử dụng các giống đậu tương kháng bệnh, nhưng nguồn giống đậu
tương kháng bệnh tự nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế. Chính vì

- 2 -

vậy hướng tiếp cận tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus được quan tâm
nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh
theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi).
RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và có hiệu quả được ứng
dụng để kháng lại các loài virus gây bệnh ở thực vật. Dựa trên nguyên lý bất
hoạt gen sau phiên mã, một số tác giả đã ứng dụng thành công kỹ thuật
RNAi trong chiến lược tạo cây chuyển gen kháng virus [3], [31], [98].
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành đề
tài luận án là: “Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát
triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương
chuyển gen kháng bệnh”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung: Tạo được dòng cây chuyển gen kháng virus gây bệnh
khảm trên cây đậu tương bằng kỹ thuật RNAi.
2.2. Mục tiêu cụ thể: (i) Xác định được trình tự đoạn gen CP từ SMV gây
bệnh khảm ở cây đậu tương Việt Nam; (ii) Phát triển vector chuyển gen
mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và cả hai loài SMV và
BYMV; (iii) Tạo được cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả
năng kháng SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen; (iv)
Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi .
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Thu thập thông tin về hệ gen và gen CP của SMV, thiết kế cặp mồi nhân
đoạn gen CP, tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV. Phân tích
sự đa dạng về trình tự đoạn gen CP, trình tự amino acid suy diễn của gen CP
phân lập từ SMV ở Việt Nam và một số trình tự đã công bố trên Ngân hàng

gen quốc tế.
3.2. Phân tích sự tương đồng của gen CP trong hệ gen của SMV và BYMV
phân lập từ nhiều nguồn khác nhau. Xác định đoạn bảo thủ của gen CP và
tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin về gen CP.

- 27 -


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN




LÒ THỊ MAI THU



PHÂN LẬP ĐOẠN GEN CP TỪ SOYBEAN MOSAIC
VIRUS VÀ PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN
MANG CẤU TRÚC RNAi PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU
TƯƠNG CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC




Thái Nguyên - 2014


- 26 -


Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện đại,
Khoa Sinh– KTNN, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên và Phòng
Công nghệ tế bào thực vật, Phòng DNA Ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học




Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu
PGS.TS. Chu Hoàng Hà




Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 2:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp
Họp tại Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên

Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2014







Có thể tìm hiểu luận án tại Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên, Thư
viện Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên và Thư viện Quốc gia Việt Nam



- 3 -

3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của
SMV và của hai loài SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway. Biến nạp
vector chuyển gen mang đoạn gen CPi đã thiết kế vào A. tumefaciens.
3.4. Biến nạp cấu trúc RNAi vào cây thuốc lá. Phân tích sự có mặt của đoạn
gen CPi của hai loài SMV và BYMV trên cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ
thuật PCR. Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của cây chuyển gen
so với cây đối chứng không chuyển gen.
3.5. Chuyển cấu trúc RNAi vào cây đậu tương thông qua A. tumefaciens.
Phân tích, xác định sự có mặt của đoạn gen chuyển CPi trên cây đậu tương

chuyển gen.
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Phân lập được đoạn gen CP từ SMV dòng SL1 và SL2 có kích thước
720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid. Hai trình tự đoạn gen CP của SMV
đã được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102,
HG965103.
4.2. Phát triển thành công hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả
năng kháng đơn loài SMV và khả năng kháng đồng thời hai loài SMV và
BYMV.
4.3. Tạo được 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả
năng kháng cả hai loài SMV và BYMV.
4.4. Chuyển thành công cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương ĐT12 và
DT2008, thu được 5 dòng cây chuyển gen từ giống ĐT12 và 19 dòng cây
chuyển gen từ giống DT2008.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Về khoa học
Việc phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc gen RNAi
chứa đoạn gen CPi kháng đơn loài SMV và kháng đồng thời cả hai loài
SMV, BYMV để tạo được cây thuốc lá chuyển gen có tính kháng đối với
SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen đã khẳng định cơ
sở khoa học và tính hiệu quả của biện pháp sử dụng các gen có nguồn gốc từ

- 4 -

chính loài virus gây bệnh để chuyển vào cây trồng nhằm tạo cây trồng
chuyển gen kháng virus theo nguyên lý của kỹ thuật RNAi.
5.2. Về thực tiễn
Kết quả lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu
tương đã tổn thương và tái sinh thành công cây đậu tương chuyển gen mang
cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và BYMV đã cho thấy khả

năng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen và kỹ thuật RNAi trong chọn tạo giống
đậu tương ở Việt Nam. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen
CPi của SMV và BYMV theo nguyên lý kỹ thuật RNAi để tạo được cây
chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương đã khẳng định hướng nghiên cứu
ứng dụng kỹ thuật RNAi và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn
chọn giống cây trồng ở Việt Nam.
6. Cấu trúc luận án: Luận án có 128 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được
chia thành các chương, phần: Mở đầu 4 trang, Chương 1: Tổng quan tài liệu
35 trang, Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21 trang, Chương
3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 46 trang, Kết luận và đề nghị 2 trang;
Các công trình công bố liên quan đến luận án 1 trang; Tài liệu tham khảo 19
trang. Luận án có 18 bảng, 40 hình và tham khảo 182 tài liệu.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo tài liệu 26 tiếng Việt và 155 tài liệu tiếng Anh để
tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Bệnh khảm do virus ở cây
đậu tương, (2) Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương, và (3) Kỹ thuật
RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus.
Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp trên toàn thế giới và gây thiệt
hại lớn đến năng suất và chất lượng hạt. SMV và BYMV là hai loài virus
gây bệnh khảm và khảm vàng ở cây đậu tương, thuộc nhóm Potyvirus, họ
Potyviridae. Cây đậu tương có thể bị nhiễm đồng thời SMV và BYMV và
triệu chứng rất khó phân biệt. Nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ
dẫn tới năng suất đậu tương có thể bị giảm từ 66% - 80%.

- 25 -

CÁC CÔNG TRÌNH
CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Lo Thi Mai Thu, Le Van Son, Chu Hoang Ha, and Chu Hoang Mau
(2014). Development of RNAi-Based Vector Aims at Creating Antiviral

Soybean Plants in Vietnam. International Journal of Bioscience,
Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), Vol. 4, No. 3, pp. 208-211.
2. Lò Thị Mai Thu, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu
Hoàng Mậu (2013). Thiết kế vector mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen
CP của SMV và BYMV. Tạp chí sinh học 35 (3), tr. 129-135.
3. Lò Thị Mai Thu, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu
(2014). Chuyển gen qua nách lá mầm ở đậu tương nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens. Tạp chí khoa học&Công nghệ- Đại học Thái Nguyên, 115
(01), tr. 3-12.
4. Lò Thị Mai Thu, Lê Hồng Trang, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu
(2014). Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen kháng soybean
mosaic virus và bean yellow mosaic virus. Tạp chí khoa học&Công
nghệ- Đại học Thái Nguyên, 115 (02), tr. 111-115.
5. Lò Thị Mai Thu, Hoàng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng
Mậu (2014). Đặc điểm của đoạn gen mã hóa coat protein phân lập từ
Soybean Mosaic Virus. Tạp chí sinh học 36 (1), tr.
Các trình tự gen đã đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế
1. Lo MT., Hoang H., Le VS., Chu HH., and Chu HM. (2014). Soybean
mosaic virus SMV gene for coat protein, isolate SL1. GenBank,
Accession: HG965102.
2. Lo MT., Hoang H., Le VS., Chu HH., and Chu HM. (2014). Soybean
mosaic virus SMV gene for coat protein, isolate SL2. GenBank,
Accession: HG965103.


- 24 -

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1.1. Tách dòng và xác định được trình tự đoạn gen CP từ SMV dòng SL1,

SL2. Đoạn gen CP phân lập được có 720 nucleotide, mã hóa 240 amino
acid, trong đó số amino acid của vùng poty-coat là 208. Trình tự đoạn gen
CP của SMV dòng SL1 và dòng SL2 đã được đăng ký trên Ngân hàng gen
quốc tế với mã số HG965102, HG965103. SMV dòng SL1, SL2 phân bố
cùng nhóm với hai dòng của Trung Quốc.
1.2. Phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn
gen CPi kháng đơn loài SMV và vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi
chứa đoạn gen CPi kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV. Tạo được
chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc RNAi này.
1.3. Tạo được 26 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi
(SMV-BYMV)] có kết quả dương tính với phản ứng PCR, trong đó có 19/26
dòng cây thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn đồng thời cả
SMV và BYMV (chiếm 73,08%).
1.4. Đã chuyển thành công cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu
tương ĐT12 và DT2008. Thu được 5 dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế
hệ T
0
từ giống ĐT12 và 19 dòng cây chuyển gen từ giống DT2008 dương
tính với phản ứng PCR, hiệu suất chuyển gen đạt lần lượt là 1,35% và 2,24%.
2. ĐỀ NGHỊ
2.1. Cần tiếp tục chọn lọc, phân tích biểu hiện tính kháng đơn loài SMV và
tính kháng đồng thời cả hai loài SMV và BYMV ở thế hệ đậu tương chuyển
gen T1 và các thế hệ tiếp theo phục vụ công tác chọn giống đậu tương kháng
virus.
2.2. Nghiên cứu thiết kế cấu trúc RNAi chứa đồng thời hai hoặc một vài gen
của SMV, BYMV để tăng hiệu quả kháng virus của cây đậu tương chuyển
gen.


- 5 -

SMV và BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần chính là
protein và nucleic acid. Hệ gen của SMV và BYMV là RNA sợi đơn dương
(RNA (+)). Jayaram và đtg (1992) đã lập bản đồ và xác định trình tự
nucleotide của các chủng SMV G2 và G7 (Hình 1.2).
Gen CP là gen đặc trưng nhất ở các Potyvirus, mã hóa protein vỏ (CP)
được chia thành ba vùng: vùng đầu N, vùng lõi và vùng đầu C. Chức năng
của CP thể hiện trong sự nhân lên, capsid hóa, di chuyển của virus từ tế bào
đến tế bào và trong sự truyền virus của rệp. Sự phân loại các thành viên của
nhóm Potyvirus có thể dựa trên trình tự gen CP và trình tự amino acid của
CP. Gen CP ở SMV có kích thước là 807 nucleotide, trong đó vùng mã hóa
gồm dài 804 nucleotide mã hóa 267 amino acid, trong đó vùng Poty-coat từ
amino acid thứ 33 đến 264; còn ở BYMV, gen CP có kích thước 933
nucleotide, vùng mã hóa gồm 822 nucleotide, mã hóa 273 amino acid, trong
đó vùng Poty-coat từ amino acid thứ 37 đến 272.






Hình 1.2. Bản đồ hệ gen của SMV và dự đoán các điểm cắt của protease
Bản đồ này được dựa trên cơ sở trình tự gen của SMV chủng G2 và G7 theo Jayaram và đtg,
1992. Các hộp khác nhau đề cập đến các gen khác nhau và vùng 5 'và 3' là vùng chưa dịch mã
(UTR). Các số dưới đây bộ gen đề cập đến vị trí amino acid cắt từ polyprotein và các con số
trong ngoặc đơn đề cập đến vị trí nucleotide cắt từ trình tự gen của SMV G2 và G7. CP là
protein vỏ của virus, CI là protein hình trụ; HC-Pro là thành phần trợ giúp và protease; NIb là
RNA polymerase phụ thuộc RNA; P1, P3, và NIa là protease; VPg là protein liên kết

Chuyển gen là biện pháp công nghệ được ứng dụng để tạo dòng đậu

tương kháng virus. Cho đến nay, phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng
bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua A. tumefaciens đã được ứng dụng phổ
biến và thành công đối với cây đậu tương. Kể từ khi giống đậu tương đầu tiên
được chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp thông qua A. tumefaciens lây


- 6 -

nhiễm vào nách lá mầm tổn thương trong nuôi cấy in vitro vào năm 1988,
đến nay phương pháp chuyển gen này đang được sử dụng, nghiên cứu và
ứng dụng khá phổ biến đối với cây đậu tương và đạt được những thành tựu
rất đáng khích lệ.
Virus gây bệnh trên cây đậu tương rất đa dạng về chủng loại, chủ yếu
là virus RNA. Các virus thường có phổ gây bệnh rộng, có loài gây hại tới
trên 900 loại thực vật khác nhau với những biểu hiện bệnh phức tạp, khó
nhận biết. Ứng dụng kỹ thuật RNAi bằng cách sử dụng nguồn gen của chính
virus gây bệnh và chuyển vào cây trồng, các nhà khoa học đã thành công trong
việc tạo ra cây trồng chuyển gen kháng virus dựa theo nguyên lý bất hoạt gen
sau phiên mã.
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, thiết bị, hóa chất và địa điểm nghiên cứu
Mẫu lá nghi nhiễm bệnh do SMV và BYMV được thu từ một số địa
phương được sử dụng trong thí nghiệm phân lập gen CP từ SMV.
Sử dụng giống thuốc lá Nicotiana tabacum C9-1 và hai giống đậu tương
ĐT12, DT2008 để thử nghiệm chuyển gen kháng SMV và BYMV do Phòng
Công nghệ tế bào, Viện Công nghệ sinh học. Nguồn virus SMV và BYMV sử
dụng trong lây nhiễm nhân tạo do viện Bảo vệ thực vật cung cấp.
Vector tách dòng pBT và pENTR
TM
/D-TOPO, vector chuyển gen

pK7GWIWG2(II); Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α; E. coli One Shot
®
Top
10 và A. tumefaciens CV58 pGV 2660 được dùng trong phân lập gen, thiết
kế vector chuyển gen và chuyển gen.
Hóa chất được mua tại các hãng nổi tiếng trên thế giới; các thí nghiệm
được tiến hành trên trang thiết bị của Phòng Công nghệ ADN ứng dụng,
Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ
gen, Viện Công nghệ sinh học và Phòng thí nghiệm Công nghệ gen, Phòng
thí nghiệm Công nghệ tế bào Khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại
học Sư phạm –Đại học Thái Nguyên.

- 23 -







Hình 3.31. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc
CPi (SMV-BYMV) trong các dòng cây đậu tương chuyển gen giống DT2008
(-): Đối chứng âm; 1-32: 32 dòng đậu tương DT2008 chuyển gen
M: Marker 50 bp (Thermo Scientific)
Cũng bằng phương pháp chuyển gen qua nách lá mầm hạt chín đậu
tương nhờ A. tumeffaciens, Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) chuyển gen
P5CSm vào giống đậu tương DT84 với hiệu suất là 0,24%; Nguyễn Thu
Hiền (2011) biến nạp cấu trúc chứa đoạn gen HA1 của virus H5N1 vào 650
mẫu lá mầm của giống đậu tương ĐT12 với hiệu suất chuyển gen là 1,23%.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, hiệu suất chuyển gen với cấu trúc RNAi

(pK7GW –CPi (SMV-BYMV) ở giống ĐT12 là 1,35%, ở giống DT2008 là
2,24%. Như vậy có thể thấy rằng hiệu suất chuyển gen ở cây đậu tương không
chỉ phụ thuộc vào khả năng tiếp nhận gen của kiểu gen cây đậu tương, mà còn
phụ thuộc vào đặc điểm của cấu trúc gen được chuyển vào cây đậu tương.
Bệnh do virus ở cây đậu tương có triệu chứng rất khó phân biệt, cây
đậu tương có thể nhiễm đồng thời nhiều loại virus, như SMV gây bệnh
khảm, BYMV gây bệnh khảm vàng, virus gây bệnh xoăn lá…Hai loài virus
SMV và BYMV gây bệnh khảm trên cây đậu tương được chúng tôi chọn
làm đối tượng để nghiên cứu tạo cây chuyển gen theo nguyên lý của kỹ thuật
RNAi. Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi (SMV-
BYMV) được chúng tôi thiết kế và chuyển vào cây thuốc lá và cây đậu
tương. Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của 26 dòng cây thuốc
lá chuyển gen đã thu được tỷ lệ kháng khá cao (73,08%). Những kết quả này
chứng minh tính hiệu quả của chiến lược ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo
cây chuyển gen kháng virus và là cơ sở cho việc xác định tính khả thi của
nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen kháng đồng thời hai loại virus
SMV và BYMV.

500bp

500bp

- 22 -

Bảng 3.10. Kết quả chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu
tương ĐT12 và DT2008 nhờ A. tumefaciens qua nách lá mầm
Giống

Lô thí
nghiệm

Số
mẫu
biến
nạp
Số
mẫu
tạo
chồi
Số
chồi
kéo
dài
Số
chồi
ra rễ
Số cây
trồng
trên giá
thể
Số cây
sống
trên
giá thể

Số cây
dương
tính với
PCR
Hiệu
suất

chuyển
gen (%)

1 100 27 10 5 4 3
2 150 48 17 16 12 10
ĐT12
3 120 37 13 10 8 3

Tổng 370 112 40 31 24 16
5 1,35
1 250 130 50 30 26 7
2 180 75 28 19 16 6
3 220 103 45 29 25 9
DT2008

4 200 95 41 27 23 10
Tổng 850 403 164 105 90 32
19 2,24
3.4.2. Phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T
0

Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-
R từ DNA hệ gen để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các dòng đậu
tương chuyển gen, kết quả PCR nhân bản đoạn gen CPi (SMV-BYMV) có
kích thước là 573 bp từ DNA tổng số của 16 dòng cây chuyển gen từ giống
ĐT12 nhận được 5 dòng cây dương tính với PCR (T12-3, T12-10, T12-11,
T12-12. T12-16) (Hình 3.30), với hiệu suất chuyển gen là 1,35%.

Hình 3.30. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc
CPi (SMV-BYMV) trong các dòng cây đậu tương chuyển gen giống ĐT12
1-16: 16 dòng đậu tương ĐT12 chuyển gen; M: Marker 50 bp (Thermo Scientific)

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen CPi
(SMV-BYMV) với cặp mồi đặc hiệu từ DNA tổng số của 32 dòng đậu tương
chuyển gen giống DT2008 nhận được 19 dòng cây dương tính với PCR
(T08-1, T08-4, T08-5, T08-6, T08-7, T08-8, T08-9, T08-13, T08-14, T08-
15, T08-16, T08-17, T08-22, T08-24, T08-25, T08-26, T08-27, T08-29,
T08-30) (Hình 3.34), với hiệu suất chuyển gen là 2,24%.

500 bp 

- 7 -

2.2. Phương pháp nghiên cứu
Luận án sử dụng các nhóm phương pháp nghiên cứu như: (1) phân lập
gen, (2) thiết kế vector chuyển gen, (3) chuyển gen, (4) phân tích cây chuyển
gen và (4) phân tích, xử lý số liệu. Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ
tổng quát như mô tả trong hình 2.3.

Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
2.2.1. Nhóm các phương pháp phân lập gen
Thu thập mẫu bệnh và tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá đậu tương nghi
nhiễm SMV: i) Thu thập và bảo quản mẫu lá đậu tương nghi nhiễm SMV,
BYMV; ii) Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá nghi nhiễm SMV.
Phương pháp tổng hợp cDNA, nhân bản đoạn cDNA của gen CP từ
SMV bằng PCR.
Kỹ thuật tách dòng gen và xác định trình tự nucleotide: i) Tinh sạch
sản phẩm PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT, iii) Biến
nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α; iv) Chọn dòng
MẪU LÁ ĐẬU TƯƠNG
NHIỄM SMV
PHÂN LẬP GEN ĐOẠN GEN
CP TỪ SMV
THIẾT KẾ ĐOẠN BẢO THỦ
CPi-SMV VÀ CPi (SMV-BYMV)
THIẾT KẾ VECTOR RNAi
CHỨA ĐOẠN BẢO THỦ CPi
(SMV-BYMV)
Phân tích gen
CP bằng
BASLT trên
NCBI
CHUYỂN CẤU TRÚC

CPi (SMV-BYMV) VÀO
CÂY THUỐC LÁ C9-1
CHUYỂN CẤU TRÚC
CPi (SMV-BYMV) VÀO
GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
ĐT12, DT2008
Phân tích đoạn
CPi (SMV-BYMV
bằng PCR
Đánh giá tính
kháng SMV và
BYMV
Kỹ thuật
GATEWAY
Thông qua
A. tumefaciens
Xác định sự có
mặt của đoạn CPi
(SMV-BYMV)
Cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi
[CPi (SMV-BYMV)]


- 8 -

khuẩn lạc bằng colony-PCR, v) Tách chiết plasmid, vi) Xác định và phân
tích trình tự nucleotide.
2.2.2. Nhóm các phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi
Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CP của SMV
và BYMV được thiết kế theo mô hình ihpRNA bằng kỹ thuật Gateway

(Invitrogen). Các bước chính trong kỹ thuật này theo Karimi và đtg (2002),
bao gồm: (1) Thiết kế và tổng hợp nhân tạo đoạn gen CPi (SMV-BYMV)
của SMV và BYMV) và khuếch đại đoạn CPi(SMV-BYMV), (2) Lai ghép
đoạn CPi (SMV-BYMV) với vector pETR
TM
/D-TOPO
®
và (3) Thực hiện
phản ứng LR để trao đổi đoạn CPi (SMV-BYMV) từ vector pENTR
TM
/D-
TOPO
®
sang vector pK7GWIWG(II) (Hình 2.4).










Hình 2.4. Sơ đồ mô tả các bước thiết kế vector mang cấu trúc RNAi bằng kỹ
thuật Gateway

2.2.3. Phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Biến nạp pK7GW/SMV-BYMV-CPi vào tế bào A. tumefaciens
CV58C1 pGV2260 bằng xung điện.

Chuyển cấu trúc RNAi mang vùng gen CPi (SMV-BYMV) vào cây
thuốc lá Nicotiana tabacum C9-1 thông qua vi khuẩn A. Tumefaciens.
Chuyển vector chứa cấu trúc RNAi mang đoạn gen CPi (SMV-BYMV)
vào giống đậu tương ĐT12 và DT2008 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens


- 21 -

Thí nghiệm chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) đối với giống đậu tương
ĐT12 ở 3 lần biến nạp trong 370 mẫu thu được 112 mẫu tạo chồi và có 40
chồi kéo dài trên môi trường chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, trong
đó 31 chồi ra rễ, đem trồng 24 cây trên giá thể và đã nhận được 16 cây T0
sống và phát triển trên giá thể. Đối với giống đậu tương DT2008 với 850 mẫu
trong 4 lần biến nạp thu được 403 mẫu tạo chồi, chọn được 164 chồi kéo dài
trên môi trường chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, trong đó 105 chồi
ra rễ, mang 90 cây trồng trên giá thể và đã nhận được 32 cây T0 sinh trưởng
và phát triển trên giá thể (Bảng 3.10).












Hình 3.28. Tạo cây đậu tương chuyển gen từ giống DT2008 bằng kỹ thuật

lây nhiễm A. tumefaciens tái tổ hợp qua nách lá mầm hạt chín
A – Nách lá mầm hạt chín; B - Gây tổn thương nách lá mầm trong dịch khuẩn và lây
nhiễm 30 – 40 phút; C - Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối trong 5 ngày; D - Cảm ứng
tạo đa chồi trên SIM lần 1 trong 2 tuần (bổ sung BAP 2 mg/l + kanamycin 50 mg/l); E - Cắt
bỏ lá mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM trong 2 tuần (bổ sung GA
3
0,5 mg/l
+ IAA0,1 mg/l + kanamycin50 mg/l); G - Ra rễ trên môi trường RM (bổ sung IBA 0,1 mg/l)
trong 20 ngày; H - Ra cây (giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng).

Náchlá mầm

A B C D
E G H

- 20 -

khảm và xoăn, còi cọc và sinh trưởng kém. Trong khi đó, các dòng cây
kháng hoàn toàn vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường, lá xanh tốt.
Các giống thuốc lá K326 và Longjiang 911 được chuyển cấu trúc mang
gen CP của TMV theo cơ chế RNAi thông qua Agrobacterium tumefaciens
có khả năng kháng TMV tương ứng là 83% và 90% (Yan và đtg, 2007).
Zhang và đtg (2012) đã đề cập đến thiết kế cấu trúc RNA kẹp tóc chứa đoạn
lặp lại đảo chiều của cDNA CP của virus Y ở khoai tây (PVY) và chuyển
vào cây thuốc lá, khả năng kháng PVY của các dòng thuốc lá chuyển gen là
83,54%… Ở Việt Nam, thành công đầu tiên ứng dụng kỹ thuật RNAi trong
tạo cây chuyển gen kháng virus là công trình nghiên cứu tạo các dòng cây
thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng CMV là 70,9%, kháng PVY là
84,1%, kháng TMV là 74,5% và khả năng kháng đồng thời hai loại virus
TMV và CMV lên tới 70,8%. Trong nghiên cứu này đoạn gen CPi của hai

loại SMV và BYMV được sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc
pK7GW-CPi (SMV-BYMV) chuyển vào cây thuốc lá và thu được kết quả
khả quan, với 73,08% dòng cây chuyển gen kháng hoàn toàn đối với SMV
và BYMV, thuộc nhóm cây chuyển gen có tính kháng cao đối với virus.
Chúng tôi cũng đồng tình với quan điểm của Kumar và Sarin (2013) cho
rằng, việc sử dụng các can thiệp bằng kỹ thuật RNAi đã cung cấp một cách
tiếp cận thân thiện với môi trường để tạo ra cây trồng kháng virus và côn
trùng, mà cho đến nay khó có kỹ thuật nào thay thế.
3.4. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG CẤU TRÚC RNAi
3.4.1. Kết quả chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây đậu tương
Tiến hành chuyển cấu trúc vector CPi (SMV-BYMV) vào mô đậu tương
của hai giống ĐT12 và DT2008 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens bằng kỹ
thuật lây nhiễm qua nách lá mầm hạt chín theo quy trình chuyển gen ở đậu
tương đã được tối ưu (Hình 3.28).

- 9 -

Phương pháp xác định hiệu suất chuyển gen: Mỗi mẫu biến nạp là
mảnh lá mầm được tái sinh chồi từ nách lá mầm và qua hai lần chọn lọc
bằng kháng sinh. Các chồi sống sót sau chọn lọc được chuyển sang môi
trường ra rễ và đưa ra trồng trên giá thể. Số cây sống trên giá thể của mỗi
mẫu biến nạp dương tính với PCR lập thành một dòng cây chuyển gen. Hiệu
suất chuyển gen được tính theo công thức:
Hiệu suất chuyển gen =
Số dòng cây chuyển gen dương tính với PCR
Tổng số mẫu biến nạp
100(%)

2.3.4. Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen
Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR

Phân tích, đánh giá khả năng kháng SMV và BYMV bằng phương
pháp lây nhiễm nhân tạo.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN CP CỦA SMV
3.1.1. Tách dòng và xác định trình tự nucleotide đoạn gen CP từ SMV
Kết quả so sánh 96 trình tự gen CP của SMV bằng BLAST trong NCBI
cho thấy các trình tự gen CP trên GenBank có độ tương đồng từ 94% đến
100% và kích thước vùng tương đồng được xác định có số lượng hơn 700
nucleotide. Từ kết quả so sánh và xác định vùng tương đồng của các trình tự
gen CP và dựa vào trình tự gen CP có mã số X63771 trên GenBank chúng
tôi đã thiết kế cặp mồi PCR SMVcp-F/SMVcp-R để nhân đoạn tương đồng
của gen CP dự tính có kích thước là 720 nucleotide.
RNA tổng số được tách chiết từ lá đậu tương, tiến hành phản ứng phiên mã
ngược để tạo cDNA và tiến hành phản ứng PCR. Phản ứng PCR khuếch đại
đoạn gen CP được thực hiện và kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel
argarose và nhận được một băng DNA đặc hiệu với kích thước khoảng 0,7kb,
đúng với kích thước được dự đoán khi thiết kế cặp mồi PCR (Hình 3.1).

- 10 -

Sản phẩm PCR được tách khỏi bản gel và tinh sạch và gắn trực tiếp vào
vector tách dòng pBT sau đó được biến nạp vào tế bào E. coli DH5. Tiến
hành chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR, kết quả điện di cho thấy sản
phẩm colony-PCR xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 0,7kb
(Hình 3.2).
Kết quả giải trình tự nucleotide cho thấy đoạn gen CP phân lập từ SMV
dòng SL1 và SL2 gây bệnh khảm trên cây đậu tương thu tại Sơn La có 720
nucleotide. Khi so sánh với trình tự của đoạn gen CP trên Ngân hàng gen
quốc tế có mã số X63771 (trình tự sử dụng để thiết kế cặp mồi nhân đoạn
gen CP) bằng BLAST trong NCBI cho thấy đoạn gen CP (cDNA) mà chúng

tôi phân lập được từ SMV dòng SL1 có độ tương đồng là 100%, còn trình tự
đoạn gen CP phân lập từ dòng SL2 có độ tương đồng là 99,3%, và hai trình
tự đoạn gen CP của dòng SL1 và SL2 có độ tương đồng là 99,3%. Như vậy
có thể kết luận rằng trình tự cDNA mà chúng tôi phân lập được là đoạn gen
CP mã hóa protein CP của SMV dòng SL1 và SL2.








Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản
phẩm RT-PCR khuếch đại
đoạn gen CP (cDNA) của SMV
(1, 2: SL1, SL2; M: Thang DNA
chuẩn 1 kb)
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm
colony- PCR từ khuẩn lạc (M: thang DNA
chuẩn 1 kb; 1, 2, 3- Gen CP khuếch đại từ
khuẩn lạc) dòng SL1; 4, 5, 6: Gen CP
khuếch đại từ khuẩn lạc dòng SL2)

3.1.2. Phân tích sự đa dạng của trình tự gen CP của các dòng SMV
Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen CP của SMV dòng
SL1 và SL2 (Việt Nam) với 18 trình tự gen CP đã công bố trên GenBank (8
dòng Nhật Bản, 2 dòng Hàn Quốc, 2 dòng Mỹ, 4 dòng Trung Quốc, 1 dòng

1 2 M


1kb

0,7kb


0,7kb
M 1 2 3 4 5 6

- 19 -











Kết quả đánh giá tính kháng bệnh virus khảm của 26 dòng cây thuốc lá
chuyển gen và 10 cây đối chứng được trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả lây nhiễm nhân tạo và khả năng kháng SMV, BYMV
của các dòng thuốc lá chuyển gen T0 và cây đối chứng
không chuyển gen
Ghi chú: (+); (++); (+++) mức độ biểu hiện bệnh nhẹ, trung bình và nặng.

Kết quả thống kê ở bảng 3.9 cho thấy tỷ lệ kháng hoàn toàn của các

dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) khá
cao (19 cây kháng/26 cây lây nhiễm), tương ứng với 73,08%). Những cây
đối chứng và các dòng cây chuyển gen nhiễm bệnh đều biểu hiện có lá bị
Các dòng cây chuyển gen Đối chứng không chuyển gen
Lần
lây
nhiễm

S
ố cây
được
lây
nhiễm

Số cây
kháng
hoàn
toàn
Số
cây
biểu
hiện
bệnh
Tỷ lệ
kháng
(%)
Số
cây
được
lây

nhiễm

S
ố cây
kháng
hoàn
toàn
Số cây
bi
ểu hiện
nhiễm
bệnh nặ
ng
Tỷ lệ
kháng
(%)
1 26 22 4 (++) 84,62 10 3 7 (+++) 30,33
2 22 22 0 100 3 0 3 (+++) 0
3 22 19 3 (+) 86,36 0 0
Tổng 26 19 7 73,08 10 10 0

A
B
C D
Hì
nh 3.2
7
.
H
ì

nh
thá
i
lá củ
a m
ộ
t s
ố
dòng thuốc lá chuyển gen và cây
đối chứng không chuyển gen
A. Dòng cây chuyển gen T0-5 kháng
virus;
B: Dòng cây chuyển gen T0-12 nhiễm
nhẹ virus;
C: Dòng cây chuyển gen T0-9 nhiễm
nặng virus;
D: Cây đối chứng không chuyển gen
nhiễm nặng virus.


- 18 -

sản phẩm DNA bằng điện di và cho kết quả DNA đảm bảo chất lượng cho
phản ứng PCR.
Tiến hành kiểm tra sự có mặt của cấu trúc CPi (SMV-BYMV) bằng
phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R. Kết quả
điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn CPi (SMV-BYMV) cho thấy đoạn
DNA thu được có kích thước là 573 bp ở tất cả 26 dòng cây thuốc lá (Hình
3.28). Kích thước này hoàn toàn phù hợp với kích thước của cấu trúc CPi
(SMV-BYMV). Vì vậy, có thể khẳng định cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-

BYMV) đã được chuyển thành công vào cây thuốc lá giống C9-1.







Hình 3.28. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định sự có mặt của
cấu trúc CPi (SMV-BYMV) trong các dòng cây thuốc lá chuyển gen
1-26: 26 dòng thuốc lá chuyển gen; (+) Đối chứng dương là plasmid pK7GW-CPi (SMV-
BYMV; (-) Đối chứng âm là sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách từ cây thuốc lá không
chuyển gen; M: Marker 1kb (Thermo Scientific)

3.3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng SMV và BYMV của các dòng
thuốc lá chuyển gen trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo
Kiểm tra tính kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV của 26 dòng
thuốc lá chuyển gen dương tính với PCR và 10 dòng đối chứng không
chuyển gen được lây nhiễm nhân tạo với SMV và BYMV bằng dịch chứa
virus qua ba lần, mỗi lần cách nhau 15 ngày. Sau mỗi lần lây nhiễm, các
dòng thuốc lá được quan sát sự biểu hiện của virus bằng cảm quan. Hình
3.27 thể hiện hình thái lá cây thuốc lá kháng bệnh, nhiễm bệnh của các dòng
cây chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen.


- 11 -

Canada, 1 dòng Ucraina), sơ đồ hình cây được thiết lập (Hình 3.6) cho thấy
20 dòng virus phân bố ở 4 nhóm (I, II, III, IV) với khoảng cách di truyền
4,8%; dòng SL1, SL2 (Việt Nam) và hai dòng có mã số X63771, U25673

(Trung Quốc) phân bố trong cùng một nhóm (Nhóm II) với hệ số tương
đồng khoảng 99%.








Tiếp tục phân tích mối quan hệ dựa trên trình tự amino acid suy diễn
cho thấy 20 dòng SMV chia làm hai nhánh, nhánh thứ nhất chỉ có một dòng
– nhóm V (AAV48873) và nhánh thứ hai có 19 dòng còn lại (Nhóm I, II, III,
IV) với khoảng cách di truyền là 7,1%. Hai dòng SL1, SL2 (Việt Nam) và
hai dòng Trung Quốc có quan hệ gần nhau, phân bố trong nhóm I.
Khoảng cách di truyền được tính trên cơ sở so sánh trình tự nucleotide
của của đoạn gen CP giữa 20 dòng SMV là 4,8% (Hình 3.6), còn dựa trên
trình tự amino acid thì khoảng cách di truyền giữa 20 dòng SMV lại lớn hơn
rất nhiều, là 7,1%. Kết quả phân tích phù hợp với nhận xét cho rằng các
Potyvirus lây nhiễm trên cây họ đậu và các loài thực vật khác có sự biểu hiện
sự đa dạng về đặc tính sinh học hơn là sự đa dạng về trình tự nucleotide
trong nucleic acid. Để phân biệt các loài, các chủng virus có thể tiến hành so
sánh trình tự nucleotide, đặc biệt là vùng đầu 3’ không mã hóa của hệ gen
virus và trình tự gen CP. Cách tiếp cận phân tích trình tự amino acid của CP
và trình tự nucleotide của gen CP từ các Potyvirus đã được coi là công cụ

I
II
III
IV

Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về
mối quan hệ di truyền giữa
các dòng SMV thiết lập dựa
trên trình tự đoạn gen CP
phân lập từ 20 dòng SMV
từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn
Quốc, Mỹ, Trung Quốc,
Canada, Ucraina
(SL1- dòng SL1; SL2- dòng
SL1; 18 dòng SMV có mã số
trên GenBank)

- 12 -

mạnh, không chỉ để nghiên cứu phân loại các loài virus thuộc chi, mà còn đối
với các chủng trong Potyvirrus. McKern và đtg (1993) phân tích sự phát sinh
loài dựa trên trình tự nucleotide của Potyvirus cho thấy, các thành viên có trình
tự với hệ số tương đồng là 38% - 71% được nhận dạng là các loài virus khác
nhau; còn các thành viên có trình tự với hệ số tương đồng ít nhất là 90% được
nhận dạng là cùng chủng virus. Các chủng virus riêng biệt cũng đã được phân
biệt bởi sự thay đổi trong hệ gen của chúng.
3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đơn loài SMV
3.2.1.1. Thiết kế đoạn gen CPi từ vùng bảo thủ của gen CP từ SMV
Theo cơ chế RNAi, sự ức chế RNA ngoại lai chỉ xảy ra khi có sự
tương đồng cao giữa các siRNA và RNA đích. Chính vì vậy vùng bảo thủ của
gen CP ở SMV được lựa chọn ở SMV để thiết kế và tổng hợp đoạn gen CPi
của SMV (CPi-SMV), phục vụ thiết kế vector mang cấu trúc RNAi. Đoạn gen
CPi của SMV (ký hiệu là CPi-SMV) được thiết kế có số lượng nucleotide là
294 nucleotide và cặp mồi mồi SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri được thiết kế để

nhân bản đoạn CPi-SMV.
3.2.1.2. Khuếch đại đoạn gen CPi-SMV và tạo vector pENTR
TM
/D-TOPO
tái tổ hợp
Khuếch đại đoạn CPi-SMV bằng phản ứng PCR với enzyme Pfu và cặp
mồi đặc hiệu SMV-CP-Fi/SMV-CP-Ri và sản phẩm PCR được kiểm tra
bằng điện di trên gel agarose thu được đoạn CPi-SMV có kích thước 0,294kb
đúng bằng kích thước của đoạn CPi khi thiết kế (Hình 3.9).
Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn CPi-SMV được tinh sạch và gắn vào vector
pENTR tạo plasmid tái tổ hợp chứa đoạn CPi-SMV (pEN-CPi-SMV).
Vector tái tổ hợp pEN-CPi - SMV được biến nạp và nhân dòng trong tế bào
vi khuẩn E.coli One Shot®. Kết quả tách plasmid (Hình 3.12A) và kiểm tra
sản phẩm PCR trực tiếp từ plasmid bằng cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-
Fi/SMV-CPi-Ri (Hình 3.12B) cho thấy đoạn CPi-SMV có kích thước 294 bp
đã được gắn vào vector nhân dòng pENTR
TM
/D-TOPO

tạo vector tái tổ hợp
pEN-CPi-SMV.

- 17 -

được trình bày ở bảng 3.8. Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, với 60 mảnh lá cây
thuốc lá C9-1 biến nạp sử dụng thí nghiệm có 38 mảnh sống sót, tạo ra 82 chồi
và thu được 131 cây con in vitro sống sót trên môi trường MS có bổ sung
kháng sinh cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l. ĐC1 là thuốc lá không
chuyển gen được cấy lên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh thu
được 105 cây sống. Các cây thuốc lá sau khi ra rễ trên môi trường có kháng

sinh chọn lọc được chuyển trực tiếp ra bầu đất. Kết quả thu được với 40 cây ra
bầu đất, có 26 cây sống sót với các biểu hiện xanh tốt, mập mạp.




Hình 3.24. Kết quả tái sinh và chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây
thuốc lá C9-1
A: Mảnh lá sau khi rửa khuẩn được cấy trên môi trường chọn lọc; B: Các cụm chồi được tạo thành
sau hai tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc; C: Các chồi màu xanh được tách ra trên môi
trường chọn lọc; D: Chồi cây chuyển gen sau 3 tuần trên môi trường tạo rễ; E: Hình thái rễ
của cây thuốc lá chuyển gen trên môi trường chọn lọc; F: Cây thuốc chuyển gen trồng trên
bầu đất
Bảng 3.8. Kết quả biến nạp cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào mảnh thuốc lá C9-1
Cấu trúc RNAi Số mảnh
lá biến
nạp
Số mảnh
lá sống
sót
Số cụm
chồi tạo
thành
Số cây
sống sót
Số cây
ra bầu
đất
Số cây
trồng tại

nhà lưới
pK7GW-CPi
(SMV-BYMV)
2 x 30=60 38 82 131 40 26
ĐC0* 30 0 - - - -
ĐC1* 30 30 79 105 10 10
Ghi chú: * ĐC0 là thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung
kháng sinh; * ĐC1 là thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không
bổ sung kháng sinh
3.3.2. Kết quả phân tích cây thuốc lá chuyển gen
3.3.2.1. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
DNA tổng số được tách từ các mẫu lá non của 26 dòng cây thuốc lá
chuyển gen ở thế hệ T0 trồng tại nhà lưới sau 3 - 4 tuần ra cây và kiểm tra

A

B

C

D

E

F


- 16 -

khi tách chiết được kiểm tra bằng enzyme giới hạn Xba I và Hind III và kết

quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt được trình bày ở hình 3.22.
Vector chuyển gen mang cấu trúc pGW/SMV-BYMV-CPi được biến
nạp vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens và tiếp tục chọn dòng bằng phản ứng
colony-PCR với cặp mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri.








Nghiên cứu biện pháp tăng cường quá trình phiên mã của gen chuyển
trong cây chủ được tập trung tìm hiểu vùng điều khiển, đặc biệt là promoter-
nhân tố khởi đầu sự phiên mã. Trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật
người ta thường sử dụng một số promoter như 35S, act, mas… trong đó 35S
là một promoter mạnh. Trong nghiên cứu này, cấu trúc RNAi được thiết kế
mang đoan gen CPi và promoter 35S thực nghiệm chuyển vào cây thuốc lá
C9-1 và kết quả bước đầu đánh giá mức độ biểu hiện tính kháng trên cây
thuốc lá chuyển gen đã cho thấy tính khả thi của nghiên cứu này.
3.3. KẾT QUẢ TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG SMV
VÀ BYMV
3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây thuốc lá
Tiến hành chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây thuốc lá,
thông qua việc biến nạp chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector
pK7GW-CPi (SMV-BYMV) vào tế bào của các mảnh lá cây thuốc lá
Nicotiana tabacum C9-1 đã được cắt tổn thương 4 cạnh và nuôi cấy trên
môi trường cảm ứng MS trước 2 ngày (Hình 3.24).
Tiến hành 2 lần biến nạp cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào các mảnh lá
thuốc lá với 30 mảnh lá/ lần, sau các giai đoạn nuôi cấy và chọn lọc, kết quả

1,0kb 
Hình 3.22. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt
Vector pK7GW bằng enzym Xba I và Hind III
M: thang DNA chuẩn 1 kb; giếng 1 là pK7GW gốc, cắt
bằng Xba I và HindIII thu được 2 đoạn DNA khoảng
1463bp và 3310bp; giếng 2-3: pK7GW-CPi (SMV-
BYMV) cắt bằng Xba I và HindIII thu được 2 đoạn DNA
khoảng 1,1kb và 3,0kb

- 13 -








A B
Hình 3.9. Hình ảnh điện di
sản phẩm PCR đoạn CPi
của SMV
M: Thang DNA 1kb; CPi:
Đoạn CPi (0,294 kb) khuếch
đại từ đoạn CPi -SMV
Hình 3.12. A: Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả
tách plasmid tái tổ hợp pEN-CPi-SMV; B: Sản
phẩm PCR nhân đoạn CPi – SMV từ plasmid tái tổ
hợp pEN-CPi-SMV bằng cặp mồi đặc hiệu SMV-
CPi-Fi/SMV-CPi-Ri (M; Thang DNA chuẩn 1kb;

1, 2, 3, 4: Dòng plasmid tái tổ hợp)

3.2.1.2. Kết quả tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi CPi- SMV)
Tiến hành thí nghiệm tái tổ hợp giữa vector pEN- CPi- SMV với vector
nhận pK7GWIWG2(II), trong thành phần phản ứng LR gồm plasmid pEN-
CPi-SMV, vector pK7GWIWG2(II) và nước khử in on, tiệt trùng tạo vector
chuyển gen mang cấu trúc CPi –SMV (pK7GW-CPi-SMV). Biến nạp vector
pK7GW-CPi-SMV vào tế bào E.coli One Shot để khuếch đại plasmid mang
đoạn CPi-SMV và tiến hành chọn dòng. Kết quả tách plasmid pK7GW-CPi-
SMV từ những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR. Kiểm tra
plasmid tái tổ hợp pK7GW-CPi-SMV bằng enzyme giới hạn XbaI và HindIII,
kết quả điện di thu được sản phẩm cắt gồm 3 đoạn DNA tương ứng với kích thước
khoảng 8,1kb, 3,1kb và 0,85kb (Hình 3.14). Kết quả trên đã khẳng định vector
chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi-SMV (pK7GW-CPi-SMV)
đã được thiết kế thành công.
3.2.1.3. Tạo vi khuẩn A. tumefaciens chứa vector chuyển gen
Vector mang cấu trúc pK7GW-CPi-SMV được biến nạp vào tế bào vi
khuẩn A. tumefaciens CV58C1. Sự có mặt của vector chuyển gen pK7GW-
CPi-SMV trong vi khuẩn A. tumefaciens được kiểm tra bằng phản ứng

1 2 3 4

M 1 2 3 4
294 bp


0,29kb
0,2 kb
0,3kb

M CPi

- 14 -

colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/SMV-
CPi-Ri. Các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp dương tính với phản ứng PCR
được lưu giữ để phục vụ cho các thí nghiệm tạo cây chuyển gen.









3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng hai loài
SMV và BYMV
3.2.2.1. Thiết kế đoạn gen CPi từ hai loài SMV và BYMV
Đoạn gen CPi của cả hai loài SMV và BYMV có ký hiệu CPi (SMV-
BYMV) với kích thước 573 nucleotide được thiết kế bao gồm đoạn bảo thủ
của gen CP ở SMV có kích thước là 294 nucleotide và đoạn bảo thủ của gen
CP ở BYMV có kích thước là 279 nucleotide, dựa trên phân tích đoạn gen
CP ở đầu 3’ của SMV và BYMV đã phân lập và các trình tự được công bố
trên GenBank. Cặp mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri mà chúng tôi thiết kế
và sử dụng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn CPi (SMV-BYMV).
3.2.2.1. Khuếch đại vùng CPi (SMV-BYMV) và tạo vector pENTR
TM
/D-

TOPO tái tổ hợp
Khuếch đại vùng CPi từ đoạn gen CPi (SMV-BYMV) bằng PCR với cặp
mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri đã thiết kế và sản phẩm được kiểm tra bằng
điện di trên gel agarose cho thấy có một băng điện di DNA có kích thước
0,573kb đúng như kích thước đoạn CPi như đã thiết kế (Hình 3.17).
Sản phẩm PCR nhân bản đoạn CPi (SMV-BYMV) được làm sạch và gắn
vào vector nhân dòng pENTR
TM
/D-TOPO tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn
3310

8,1kb
3,1kb
0,85kb

1 2 3 4 5 M
1,0kb
3,0kb
2,0kb
3310
1463
Hình 3.14. Kết quả kiểm tra điện di sản
phẩm cắt Vector pK7GW bằng enzym
Xba I và Hind III (Giếng 1-2-3-4: pK7GW-
CPi (SMV-BYMV) cắt bằng Xba I và HindIII
thu được 3 đoạn DNA, trong đó có đoạn
với kích thước 0,85kb; M: thang DNA
chuẩn 1kb; giếng 5 là pK7GW gốc, cắt
bằng Xba I và HindIII thu được 2 đoạn
DNA khoảng 1463bp và 3310bp)

- 15 -

CPi (pEN-CPi (SMV-BYMV). Vector tái tổ hợp pEN-CPi (SMV-BYMV)
được biến nạp và nhân dòng trong tế bào vi khuẩn E.coli. Sử dụng phản ứng
colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-
CPi-R và cặp mồi M13-F/M13-R (Hình 3.19). Tách plasmid và kiểm tra
plasmid tái tổ hợp pEN-CPi (SMV-BYMV) bằng PCR trực tiếp từ plasmid với
cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R.








A B
Hình 3.17. Hình ảnh điện
di sản phẩm PCR vùng
CPi của SMV và BYMV
M: Thang DNA 1kb; CPi:
Đoạn CPi khuếch đại từ đoạn
CPi (SMV-BYMV) có kích
thước 573 nucleotide
Hình 3.19. Sơ đồ ghép nối và kết quả điện di kiểm tra
sản phẩm colony-PCR đoạn CPi (SMV-BYMV) trong
vector pEN-CPi (SMV-BYMV)
A: Sơ đồ ghép nối đoạn CPi (SMV-BYMV) vào vector

pENTR
TM
/D-TOPO

; B: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm
colony-PCR đoạn CPi (SMV-BYMV) (1, 2: Đoạn CPi khuếch
đại với cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R; 3: đoạn CPi +
attL1, attL2 với cặp mồi M13-F/M13-R; M: thang DNA 1kb)

3.2.2.2. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi CPi (SMV-BYMV)
Trong thí nghiệm này, plasmid pEN-CPi (SMV-BYMV) tiếp tục tham
gia phản ứng LR với vector tiếp nhận pK7GWIWG2(II) với sự xúc tác của
hỗn hợp enzyme LR Clonase
TM
II để tạo vector chuyển gen pK7GW-CPi
(SMV-BYMV) (Hình 3.22) theo cơ chế tái tổ hợp giữa vector pEN- CPi
(SMV-BYMV) với vector pK7GWIWG2(II). Vector chuyển gen pK7GW-CPi
(SMV-BYMV) được dòng hóa vào tế bào E.coli và được chọn dòng bằng
phản ứng colony-PCR. Vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) sau

0,5kb
0,5kb
1,0kb
M CPi