Phân tích trình tự nucleotit gen hormon sinh trưởng ppt

Phân tích trình tự nucleotit gen hormon sinh trưởng
của một số giống lợn Việt nam
1.Giới thiệu

Số lượng hormone sinh trưởng ở lợn có liên quan đến
khả năng vỗ béo, thành phần thân thịt, chất lượng thịt
và khả năng chống lại các stress (Geldmann và cộng
sự, 1997). Sự đa hình gen hormone sinh trưởng còn
ảnh hưởng đến khả năng tăng trọng ngày, tỷ lệ nạc,
mỡ và nồng độ hormone sinh trưởng trong huyết
thanh (Nielsen và cs, 1995). Sự khác biệt về số lượng
hormone sinh trưởng là do sự sai khác di truyền ở
gen hormone sinh trưởng và các gen điều hoà khác
của trục hormone.
Gen hormone sinh trưởng của lợn nằm trên cánh tay
p của nhiễm sắc thể số 12 (Yerle và cs, 1993;
Chowdhary và cs, 1994) vùng mã hoá gồm 5 exon có
chiều dài khoảng 1,7 kb (Vize và Wells, 1997).
Mục đích của chúng tôi là tiến hành giải trình tự đoạn
gen từ nucleotit 380 đến nuleotit 802 của một số
giống lợn nội nhằm phát hiện ra sự thay đổi của một
số nuleotit trong exon II của gen hormone sinh
trưởng.


2. Đối tượng và phương pháp

2.1. Đối tượng: ADN được tách từ mẫu máu của các giống lợn nội (Móng Cái, ỉ
và H?mông).

2.2. Phương pháp lấy mẫu và tách ADN: Mỗi mẫu lấy 0,5 ml máu (chống đông

bằng EDTA) và sử dụng 100 m

l máu để tách ADN theo phương pháp kít của
hãng Sepagene (Nhật bản).

2.3 Phương pháp nhân gen (PCR): Chúng tôi sử dụng primer được thiết kế
bởi Eiji Kobayashi và cs (1999), có trình tự như sau:

Mồi xuôi: 5?-GAGGCCAAGTTTTAAATGTCCCTG-3?

Mồi ngược: 5?-GTGTAAACTGAAGGGGATTCCCAA-3?

Thành phần và điều kiện phản ứng PCR theo phương pháp Eiji Kobayashi và cs
(1999).

2.4 Phương pháp giải trình tự gen: Giải trình tự nucleotit được thực hiện theo
các bước sau: Sản phẩm sau PCR được làm sạch bằng Pre-sequence kít: gồm 5 m

l ADN-PCR cần xác định trình tự, 0,5 m

l exonuclease III (10 UI trong 20 mM
Tris-HCl pH7,5; 5 mM 2 mercaptoethanol; 50% Glycerol); 0,5

m

l shrimp
alkaline phosphatase (2 UI/

m

l trong 25 mM Tris-HCl pH7,6; 1 mM MgCl2;
0,1mM ZnCl2; 50% Glycerol). ủ phản ứng ở 370C trong 15 phút, sau đó ủ ở
800C. Thêm vào phản ứng 2 m

l Big dye terminator, 3 m

l 5x Buffer, 9 m

l nước
cất và 5 pmol ADN mồi (xuôi hoặc ngược). Thực hiện phản ứng nhân gen gồm 25
chu kỳ với chu kỳ nhiệt như sau: 940C/30 giây, 500C/10 giây, 600C/ 4 phút. Kết
thúc phản ứng nhân gen mẫu được lọc qua cột G-50 Superfine và giải trình tự trên
cả hai sợi ADN của gen hormone sinh trưởng.

3
.
Kết quả và thảo luận:

3.1. Kết quả nhân gen (PCR):

Chúng tôi sử dụng phương pháp PCR nhân đoạn gen dài 422 bp từ 3 giống lợn nội
khác nhau, kết quả được thể hiện qua ảnh 1.

M: marker số 10 (pBR322/MspI); Hàng 2-7: Đoạn gen nhân sau PCR.

3.2. Kết quả giải trình tự:

Giải trình tự trực tiếp sản phẩm sau PCR cho thấy ở vị trí nucleotit 507 thì G/C
được thay bằng C/T (ảnh 2), G/C ở vị trí nucleotit 555 được thay bằng G/A và ở vị
trí nucleotit 556 thì C/G được thay bằng C/A. Do C/T thay cho G/C ở vị trí

nucleotit 507 tạo nên 2 bộ ba mã hoá GTG thay cho GCG. ở hai vị trí nucleotit
555 (G/A) và 556 (C/A) tạo ra 4 bộ ba mã hoá là GGC, GGA, GAC và GAA (ảnh
3) từ đó tạo nên những axit amin mới.


3.3. Thảo luận:
Kết quả giải trình tự gen hormone sinh trưởng từ 3
giống lợn nội cho thấy ở vị trí 506-509 nếu có sự thay
thế C/T ở vị trí 507 sẽ tạo ra hai bộ ba mã hoá (GCG
và GTG) do đó tạo ra axit amin mới là Alanine
(GTG) thay cho valine (GCG) trong trình tự axít
amin (Pirchner và cs, 1996). Ngoài ra còn có 2 axit
amin khác được tạo ra bởi sự thay thế G/A ở vị trí
nucleotit 555 và C/A ở vị trí nucleotit 556 cũng dẫn
đến sự thay thế các axit amin mới trong trình tự axit
amin (Kirkpatrick và cs, 1993) đó là từ Glycine
(GGC hoặc GGA) thành Glutamic (GAA) hoặc từ
Aspartic (GAC) thành Glutamic (GAA). Chính sự
thay đổi các nucleotit trong vùng exon II đã tạo nên
sự đa hình của gen hormone sinh trưởng ở lợn. Từ đó
ảnh hưởng trực tiếp tới hàm lượng hormone sinh
trưởng có trong huyết thanh của lợn.
4. Kết luận:

Đoạn gen hormone sinh trưởng của 3 giống lợn:
Móng Cái, ỉ, H?mông, được nhân lên từ nucleotit 380
đến nucleotit 802 có độ lớn 422 bp nằm trong vùng
intron I, exon II và intron II của gen hormone sinh
trưởng.
Trong vùng exon II, trình tự của các nucleotit có sự

đột biến tại các điểm nucleotit vị trí 507, 555 và 556
đã tạo nên sự thay đổi trình tự axit amin trong phân
tử Protein mà gen mã hoá từ đó tạo nên sự đa hình
của gen hormone sinh trưởng của lợn.
5. Tài liệu tham khảo

1. C. Knorr; G.Moser; E.Muler and Geldmann :Association of GH gene veriants
with performce traits in F2 generation of European wild boar,Pietrain and Meishan
pigs. Anim.Genet,1997, 28:124-128.

2. Chowdhary,B.P; Thomsen,P.D; Harrbitz,L; Landset,M; Gustarsson,I; 1994:
Precise localization of the genes for Glucose Phosphate Isomerase(GPI), calcium
release chanel (CRC), hormone sensitive lipase(LIPE), and growth hormone(GH)
in pigs using nonradioactive in situ hybridization. Cytogenet.cell genet. 67, 211-
214.

3. Eiji Kobayashi, Shin-ich Shimanuki, Toshimi Matsumoto, Santoshi Yanai,
Tomiji Akita and Mitsuzu Minezawa: Genetic variations of the porcine growth
hormone gene. The Journal of Animal Genetics Vol.27, N0 March 1999.

4. Kirkpatrick,B.W,1992: Hae III and MspI polymorphisms are detected in the
second exon of the porcine growth hormone gene. Anim.Genet 23:180-181.

5. Kirkpatrick,B.W; Casa.S and Carillo,E.1993: Double-strand DNA cofirmation
polymorphisms as a source of highly polymorphic genetic markers. Anim.Genet
24:155-161.

6. Nielsen,V.H; Larsen,N.J; Agergaard,N.1995 : Association of DNA
polymorphism in the growth hormone gene with basal plasma growth hormone
concentraction and production traits in pigs. J.Anim. Breed genet.112:205-212.

7. Vize,P.D, Wells J.R.E 1987: Isolation and charactorization of the porcine
growth hormone gene. Gene 55: 339-344.

8. Yerle,M; Lahbib-Mansais,Y; Thomsen,P.D; Gellin,J,1993: Localization of the
porine growth hormone gene to chromosome 12p1. Anim.Genet 24:129-131.

6. Summary

The Nucleotide Sequence Analysis of Vietnam
Native Pig? s
Growth Hormone Gene
Nguyen Van Hau, Pham Doan Lan, Nhu Van Thu, Lê Thi Thuy, Đinh Van
Chinh

This experiment was aimed to study the arrangement of a porcine growth hormone
(pGH) gene by PCR technique. A 422 bp fragment containg the second exon of
pGH gene was amplified in using DNA sample of three breeds of Vietnamese
native pig. Using sequencing method there were three base substitutions (at
position 507, 555 and 556) to be founded.

Analysing the nucleotide sequence of Vietnam native pig it revealed that a C/T
substitution at nucleotide position 507 caused the polymorphism at nucleotide 506
-509. Meanwhile both G/A substitution at nucleotide position 555 and C/A
subsitution at nucleotide position 55b resulted in the polymorphic bands at
position 555- 558. The C/T substitution at position 507 (GCG for GTG) resulted in
substitution of alanine for valine. Another two amino acid changes caused by base
substitution in the second exon of pGH gene. So that amino acid substitution
would be either from glycine (GGC or GGA) to Glutamic acid (GAA) or from
Aspartic acid (GAC) to Glutamic acid (GAA). These mutations caused amino

acid substitutions in the amino acid sequence of porcine growth hormone.


Nguyễn Văn Hậu, Phạm Doãn Lân, Nhữ Văn Thụ,
Lê Thị Thuý và Đinh Văn Chỉnh