Chương 7: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ AXIT NUCLEIC pot

Chương 7 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ
AXIT NUCLEIC
1. Nguyên tắc cơ bản của kĩ thuật đọc trình tự (DNA
sequencing)
- Là kĩ thuật xác định tất cả những hợp phần do nucleotide hình
thành nên phân tử DNA.
-
Các công trình đầu tiên về “DNA sequencing” được công bố bởi
Maxam và Gilbert (1977), Sanger và cs (1977).
-
Cấu trúc của chuỗi DNA là dây xoắn đôi, liên kết với nhau bởi
liên kết hidro. Trên mỗi dây có một chuỗi các base, tập hợp của
bốn nucleotide : A, T, C, G.
-
Kĩ thuật DNA sequencing dựa trên kĩ thuật điện di, sử dụng gel
loại polyacrylamide có độ phân giải cao.
2. Phương pháp hóa học (Maxam và Gilbert)
Dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự
bằng phương pháp hóa học.
Trước hết DNA được đánh dấu bằng P
32
ở một đầu. Sau đó, chúng
được chia thành năm phân đoạn, mỗi phân đoạn được xử lí với
một chất hóa học chuyên biệt (có khả năng biến đổi đặc hiệu 1 loại
nucleotide)  phân cắt DNA ngay tại vị trí có nucleotide bị biến
đổi.
Kết quả: tạo ra 5 tập hợp, mỗi tập hợp là các oligonuclotide có kích
thước khác nhau nhưng đều kết thúc tại cùng một loại nucleotide.
Tiến hành điện di trên gel polyacrilamide, vị trí các oligonucleotide
tương ứng với kích thước của chúng.
Hóa chất Base bị ảnh hưởng

Dimethyl sulfate pH 8 G
Piperidine formate pH 2 A+G
Hydrazine A+ T
Hydrazine + 1,5 M NaCl C
Nhiệt độ cao (90
0
C), 1,2 M NaOH A >C
Các hóa chất sử dụng trong xử lí các base chuyên biệt
Giải trình tự một đoạn
oligonucleotide theo
phương pháp hóa học
3. Phương pháp enzyme học của Sanger thông qua việc sử dụng
các dideoxynucleotide.
Dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme DNA polymerase mạch bổ sung
cho trình tự DNA mạch đơn cần xác định trình tự.
Sử dụng 4 loại nucleotide thông thường + 4 dideoxynucleotide.
Dideoxynucleotide là deoxynucleotide, nhóm 3’ OH được thay thế
bằng H
2
Khi các Dideoxynucleotide bắt cặp bổ sung với nucleotide tương
ứng trên mạch gốc thì phản ứng tổng hợp ngừng lại do không tạo
được liên kết phosphodister.
Nguyên tắc của phương pháp giải trình tự theo Sanger
Giải trình tự một
đoạn
oligonucleotide
theo phương pháp
enzyme học
4. Các phương pháp cải biên từ phương pháp của Sanger


Xác định trình tự bằng máy tự động:
Trong kĩ thuật này, không dùng các đồng vị phóng xạ, thay vào đó
là các hóa chất có khả năng phát huỳnh quang (fluochrome).
Mỗi loại Dideoxynucleotide được đánh dấu bằng fluochrome có
màu khác nhau.
Tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại
Dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu.
Điện di  kết quả được đọc nhờ hệ thống vi tính

Kết hợp phương pháp PCR và sử dụng các Dideoxynucleotide
Chỉ sử dụng khi vùng cần xác định trình tự đã được biết trước, và
trong phát hiện đột biến điểm.