Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện và xác định nấm gây potx

Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện và
xác định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn eucalyptus
obliqua L. Her




I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bạch đàn là loài cây phổ biến tại bang Tasmania
(Australia), chiếm khoảng 883.000 ha trong tổng số 3,17
triệu ha rừng tự nhiên tại bang này, bao gồm loài E.
obliqua. Gỗ bạch đàn được sử dụng để đóng đồ gia dụng,
trong công nghiệp được dùng làm nguyên liệu giấy. Tuy
nhiên, một số loài nấm gây mục gỗ tấn công cây bạch đàn
sống, một số khác lại gây hại trên gỗ gia dụng, gỗ thành
phẩm. Nấm mục gỗ gây cho gỗ bị biến chất, làm mất màu,
mất trọng lượng và độ bền. Xác định đư
ợc nấm bệnh và các
đặc điểm sinh thái của chúng sẽ mang lại các lợi ích quản
lý. Có rất nhiều loài nấm không thể nuôi cấy trong điều
kiện phòng thí nghiệm (Johannesson và Stenlid 1999) bởi
vậy một số kết quả phân lập nấm bệnh không phản ánh
chính xác loài nấm gây bệnh trong mô thực vật. Bên cạnh
đó, hầu hết các loài nấm thuộc lớp Basidiomycetes, loài
nấm gây mục gỗ chủ yếu, có thể phân lập được nhưng hệ
sợi lại không sinh ra bào tử hữu tính, đó là đặc điểm chính
để xác định bằng phương pháp hình thái (Nobles 1948). Đã
có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định nấm gây
bệnh mục gỗ, như phân lập sợi nấm và xác định bằng hình
thái sợi, nhuộm màu hóa học, cộng hưởng phân tử từ,
phương pháp huyết thanh (hay phương pháp ELISA)

(Jasalavich 2000). Bên cạnh đó, phương pháp phân tử PCR
(Polymerase Chain Reaction) có thể sử dụng để khuyếch
đại các phân đoạn điển hình của DNA, ưu điểm của ph
ương
pháp này là cho kết quả nhanh, chính xác và phát hiện nấm
bệnh ở giai đoạn rất sớm mà một số phương pháp trên
không thể áp dụng. Phát hiện nấm bệnh bởi phương pháp
PCR và xác định nấm bệnh bằng phương pháp xác định
trình tự chuỗi trực tiếp từ các mẫu mô thực vật sẽ tránh
được các bước khó khăn trong phân lập và duy trì sợi nấm
tinh khiết trên môi trường nhân tạo. Vùng sao chép nội bộ
ITS (internal transcribed spacer) của ri-bô-xôm DNA là
vùng phù hợp cho sự phân biệt các loài nấm (Mitchell et al.
1995). Bài viết này trình bày kết quả nghiên cứu về ph
ương
pháp sinh học phân tử được áp dụng để phát hiện và xác
định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn E. obliqua tại bang
Tasmania.
II. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Nội dung
Phát hiện nấm trong mẫu gỗ mục bằng kỹ thuật DNA
Giám định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn
E. obliqua bằng kỹ thuật DNA.
2. Vật liệu
Đề tài sử dụng 26 mẫu gỗ mục được lấy mẫu từ các khúc
gỗ mục ở giai đoạn trung bình của rừng bạch đàn E.
obliqua tại Tasmania để xác định nấm mục gỗ bằng
phương pháp phân tử và được thực hiện tại Phòng thí
nghiệm Sinh học phân tử, khoa Khoa học Nông nghiệp,
trường Đại học Tasmania, Australia.

3. Phương pháp
Tách DNA: Lấy phoi gỗ mục được thực hiện theo phương
pháp của Jasalavich và đồng tác giả (2000) bằng cách sử
dụng khoan sách tay. Phương pháp khử trùng bề mặt và
thay thế mũi khoan trong mỗi lần khoan được áp dụng để
tránh sự lấy nhiễm DNA giữa các mẫu gỗ. Tách DNA của
các loài nấm mục gỗ sử dụng phương pháp glassmilk của
Glen và đồng tác giả (2002). Cho một lượng nhỏ phoi gỗ
đ
ến vạch 200 µl trên ống eppendorf 1.5 ml. Tán nhỏ các vật
liệu trên trong ống eppendorf bằng chày kết hợp với nitơ
lỏng. Thêm vào đó khoảng 300-500 µl chất tách chiết DNA
(Reader & Broda 1985). Ống eppendorf được ủ trong bể
nước ở nhiệt độ 65
o
C trong 60 phút. Sau đó được ly tâm
với tốc độ 14,000 vòng/phút trong 15 phút. Khoảng 200 µl
dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới trong có
chứa 800 µl NaI 100% (trạng thái lạnh) và 7 µl glassmilk.
Hỗn hợp được làm lạnh và lắc đều trong vòng 15 phút để
DNA gắn vào glassmilk, sau đó được ly tâm với tốc độ
14,000 vòng/phút trong 10 giây. Phần kết tủa đư
ợc rửa sạch
bằng dung dịch đệm và cồn. Sau đó hỗn hợp được ly tâm,
tách phần kết tủa và làm khô. Phần kết tủa được hòa tan
trong 25 µl dung dịch TE (10 mM Tris HCl pH8, 1 mM
EDTA), hỗn hợp được ủ trong bể nước ở 45
o
C trong vòn
g 5

phút. Ống eppendorf được ly tâm ở 14,000 vòng/phút trong
2 phút, phần hỗn hợp chứa DNA được chuyển sang ống
eppendorf mới, bảo quản ở 4
o
C.
Khuyếch đại PCR: Vùng ITS 1 và 2 được khuyếch đại từ
DNA vừa thu trên bằng cặp mồi được thiết kế điển hình
cho nấm ITS1-F (Gardes và Bruns 1993) và ITS4 (White et
al. 1990). Trong 50 µl phản ứng PCR, 10 µl DNA được sử
dụng như bản mẫu. Mỗi phản ứng PCR gồm có 1x
polymerase chất đệm (Fisher Biotec), 2 mM MgCl
2
, 0.2
mM dNTPs, 0.25 µM cho mỗi loại mồi, và 0.08 U TTH
+

polymerase (Fisher Biotec) và 0.2 mg/ml chất BSA
(Bovine Serum Albumin, Fisher Biotec). Thông s
ố khuyếch
đại PCR như sau: bước khởi đầu tách đôi sợi DNA ở 95
o
C
trong 3 phút. Sau đó là 35 chu kỳ: tách sợi DNA ở 94
o
C
trong 30 giây, gắn mồi ở 55
o
C trong 30 giây, kéo dài ở
72
o

C trong 30 giây, ở chu kỳ cuối cùng sự kéo dài được
thực hiện ở 72
o
C trong 7 phút. Phản ứng được thực hiện
trên máy PCR loại PTC 225 Peltier Thermal Cycler.
Điện ly: các sản phẩm PCR được đi
ện ly trên bản gel (2,5%
agarose) ở 4 volts/cm, trong 30 phút. Thang DNA 100bp
(Fisher Biotec) được sử dụng để ước lượng kích cỡ DNA.
Bản gel được nhuộm trong ethidium bromide (1µg/1ml),
lắc ở tốc độ chậm trong 15 phút. DNA được quan sát dưới
tia cực tím và được chụp ảnh với máy ảnh Kodak
EDAS290.
Tách dòng nấm từ sản phẩm PCR: Sau khi được khuyếch
đại (PCR), các sản phẩm PCR từ các mẫu gỗ mục có nhiều
dải DNA trên bản gel được tách dòng bằng bộ kít tách
dòng, sử dụng véc-tơ pGEM
R
-T (Promega). Quá trình gắn
DNA vào véc-tơ pGEM
R
-T được tuân thủ theo hướng dẫn
của nhà sản xuất. Sản phẩm (các dòng) sau đó được phân
tích biến động chuỗi bằng phương pháp PCR – RFLP. Các
enzym giới hạn Hinf I và Tag I được sử dụng riêng rẽ để
cắt các dòng. Sản phẩm cắt được điện ly trên bản gel 25 cm
với 2.5% Hi-Resolution agarose (Progen Industries
Limited) ở 100 volts trong 5 giờ. Các dòng của mỗi mẫu gỗ
được phân nhóm dựa trên hình thái PCR-RFLP và đại diện
của mỗi nhóm được khuyếch đại PCR (như trên) và xác

định trình tự chuỗi.
Xác định trình tự chuỗi phân tử DNA: 90-100 µl sản
phẩm PCR được làm sạch bằng bộ kít MO BIO
Laboratories, Inc. UltraClean
TM
PCR Lean-up. Phản ứng
xác định trình tự chuỗi: sử dụng bộ kít Quick Start với một
số thay đổi như sau: Mỗi phản ứng xác định trình tự chuỗi
DNA gồm 10 µl, trong đó sử dụng 3-5 µl DNA mẫu cùng
với 3.2 pmol mồi (ITS1-F) và 2 µl DTCS Quick Start
Master Mix. Kết tủa bằng cồn: 0.25 µl của 20 mg/ml
glycogen, 2 µl của 3 M Sodium Acetate và 2 µl của 100
mM Na
2
-EDTA được bổ xung vào mỗi phản ứng. Trình tự
chuỗi DNA được xác định trên hệ thống phân tích gen và
được sửa trên phần mềm Chromas Lite, phiên bản 2.0,
2004. Các chuỗi DNA được sắp xếp trên ClustalW
(Thompson et al. 1994). Sau đó các chuỗi DNA này được
so sánh sự giống nhau với các dữ liệu trên ngân hàng gen,
sử dụng phần mềm BLAST (Altschul et al. 1997) trên
BioManager (ANGIS 2005) và với các dữ liệu cá nhân, sử
dụng phần mềm FASTA, phiên bản 3.4 (Pearson và
Lipman 1998). Ngoài ra phân tích sự tiến hóa cũng được
thực hiện. Các chuỗi DNA mẫu và DNA tham khảo được
sắp xếp với nhau, biểu đồ Dendrogram được tạo trên phần
mềm ClustalW và DNA ml trên phần mềm Phylip (ANGIS
2005; Felsenstein 1998) sau đó được xem trên phần mềm
TreeView, phiên bản 1.6.6.