Hướng dẫn phê duyệt phương pháp phân tích vi sinh docx

PHÊ DUYệT PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH VI SINH
TS. Nguyễn Tiến Dũng
KHÁI NIệM Về PHƯƠNG PHƯƠNG
PHÁP

Phương pháp tiêu chuẩn:

Phương pháp do các tổ chức quốc tế,
hiệp hội, các tổ chức có uy tín (AOAC.
ISO, NMKL, ) công bố và đã được phê
duyệt, (được hiểu là các phương pháp
của một tổ chức từ 2 quốc gia trở lên)

Các tiêu chuẩn, quy chuẩn quốc gia
do các Bộ, Ngành công bố, bao gồm cả
nước nhập khẩu (TCVN, FDA…)

Phương pháp tiêu chuẩn nội bộ được
phê duyệt trong hệ thống Cục QLCL
NLS&TS.
KHÁI NIệM Về PHƯƠNG PHƯƠNG
PHÁP

Phương pháp không tiêu chuẩn

Phương pháp mới do phòng kiểm
nghiệm tự nghiên cứu xây dựng và đưa
vào áp dụng.

Phương pháp được công bố trên các tạp

chí, tài liệu khoa học, hoặc nhà sản xuất
chưa được chuẩn hoá bởi tổ chức nào.

Phương pháp có sửa đổi từ phương pháp
tiêu chuẩn mà phần sửa đổi có thể ảnh
hưởng trực tiếp đến kết quả kiểm
nghiệm hoặc làm thay đổi bản chất
phương pháp gốc.
PHạM VI ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP TIÊU
CHUẩN
Phương pháp định lượng:

Độ lặp lại (Repeatability): S
r

Được thực hiện trên cùng mẫu, lặp lại n lần bởi một
KNV và cùng một điều kiện: môi trường, nhiệt độ,
thời gian nuôi cấy …

Độ tái lập (Reproducibility): S
R

Được thực hiện n mẫu, mỗi mẫu được thực hiện phân
tích ít nhất 2 lần lặp lại trên cùng một mẫu. Các
mẫu được thực hiện tại các thời gian khác nhau,
trong các điều kiện khác nhau: môi trường, thiết bị

Độ đúng (trueness): kết quả phân tích so với
mẫu chuẩn


Độ không đảm bảo đo
PHạM VI ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP TIÊU
CHUẩN

Phương pháp định tính:

Giới hạn phát hiện (LOD
50
):

Là mật độ vi sinh vật trong 01 đơn vị mẫu
phân tích mà tại đó có 50% số mẫu gây
nhiễm được phát hiện
PHạM VI ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG
PHÁP KHÔNG TIÊU CHUẩN

Phương pháp định lượng

Độ chính xác

Độ chọn lọc

Giới hạn định lượng

Độ tuyến tính

Khoảng tuyến tính

Ước lượng độ không đảm bảo đo
PHạM VI ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP

KHÔNG TIÊU CHUẩN

Phương pháp định tính

Độ chính xác

Độ đặc hiệu

Độ nhạy

Độ chọn lọc

LOD
50
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐịNH CÁC
THÔNG Số Kỹ THUậT CủA
PHƯƠNG PHÁP
PHƯƠNG PHÁP ĐịNH LƯợNG

Khái niệm

Độ chính xác của một phương pháp phân tích
là mức độ thống nhất của các kết quả thử
riêng biệt khi quy trình thử nghiệm được áp
dụng lập đi lập lại trên cùng một mẫu nhỏ
lấy từ cùng một mẫu đồng nhất

Độ chính xác bao gồm

Độ đúng (Trueness)


Độ chụm (Precision)
Xác định độ chính xác của phương pháp định
lượng là xác định độ đúng và độ chụm
Độ ĐÚNG (TRUENESS)

Khái niệm

Độ đúng của một phương pháp phân
tích là mức độ sát gần của các giá trị
tìm thấy so với giá trị thực.

Độ đúng: được biểu diễn bằng 2 giá trị:

Độ chệch (bias) của PTN

Độ chệch của phương pháp

Xác định độ đúng:

Phương pháp tiêu chuẩn: xác định bằng mẫu
chuẩn, mẫu gây nhiễm.

Phương pháp tự xây dựng: so sánh kết quả với
phương pháp tham chiếu
Độ ĐÚNG (TRUENESS)

Cách xác định độ đúng

Nếu có mẫu chuẩn hoặc mẫu gây nhiễm:


độ đúng PTN và độ đúng của phương pháp được tự
tích hợp và được biểu diễn bằng % độ lệch giữa
giá trị của mẫu chuẩn và trung bình kết quả thu
được từ PTN khi phân tích bằng phương pháp của
PTN.

Không có mẫu chuẩn:

chỉ xác định được độ đúng của phương pháp do
chính PTN xây dựng so với phương pháp tiêu
chuẩn khi áp dụng tại PTN đó
%100×=
X
X
pptc
ppm
Ts
Độ CHụM (PRECISION)

Khái niệm:

Mức độ gần nhau giữa các kết quả thử nghiệm
độc lập nhận được trong điều kiện qui định

Cách xác định:

Độ chụm bao gồm:

độ lặp lại (repeatability - S

r
)

độ tái lập (reproducibility - S
R
)
XÁC ĐịNH Độ CHụM

Tùy theo mục đích và qui mô đánh giá sẽ có các cách bố trí thí nghiệm khác nhau
Đánh giá độ chụm của phương pháp tại 1 PTN

Độ lặp lại: được thực hiện trên 1 mẫu, tại cùng 1 KNV, trong cùng 1 điều kiện

Độ tái lập: được thực hiện trên các mẫu, bởi các KNV khác nhau (cùng thực hiện 1 mẫu); các mẫu khác nhau
được thực hiện trong các điều kiện khác nhau
2
2
)(
1
1
xx
n
S
ir
−
−
=
∑
2
2

)(
2
1
iiR
yx
n
S −=
∑
Độ CHọN LọC – PP ĐịNH LƯợNG

Định nghĩa

Mức độ tác động của các đối tượng VSV
khác với VSV mục tiêu lên kết quả phân
tích

Khả năng thể hiện sự đặc trưng trong qui
trình phân tích có tính chọn lọc

Độ chọn lọc được biểu diễn bằng 2 đại lượng

Độ chọn lọc dương: khả năng phát hiện
nhiều nhất trong số các đối tượng mục tiêu

Độ chọn lọc âm: mức độ can thiệp của các
đối tượng khác với VSV mục tiêu vào qui
trình phân tích
Độ CHọN LọC - CHủNG VSV
TRONG THử NGHIệM


Chủng VSV mục tiêu (positive)

Ít nhất 30 chủng (!!!??)

Phải đại diện cho tất cả các đối tượng cần
phân tích

Có nguồn gốc khác nhau

Chủng VSV không mục tiêu (negative)

Ít nhất 20 chủng (!!!??)

Đa dạng về nguồn gốc và chủng loại
CÁCH THựC HIệN

Thực hiện với các dịch pha loãng của chủng nuôi cấy thuần khiết

Mật độ: cố định với 100 x LOD

Thực hiện lặp lại 2 lần/chủng (với PP thay thế)

Thực hiện 1 lần với phương pháp tham
chiếu

Mô tả sự xuất hiện khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy

Không cần đếm số khuẩn lạc xuất hiện

Ghi nhận vào bảng

BảNG GHI NHậN KếT QUả Độ CHọN LọC
Chủng thử nghiệm Biểu hiện khuẩn lạc
khi thực hiện với pp
tham chiếu
Biểu hiện khuẩn lạc
khi thực hiện với pp
thay thế
Chủng VSV mục tiêu
với các mật độ khác
nhau
Chủng 1
Chủng 3
Chủng 3
…
Chủng VSV không mục
tiêu
Chủng 1
Chủng 3
Chủng 3
…
Tổng hợp các hình dạng khuẩn lạc cần đếm/không đếm
DIễN GIảI VÀ ÁP DụNG KếT QUả

Sử dụng kết quả đánh giá để bổ sung vào các bước của phương pháp

Lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng

Giới hạn đếm

Khẳng định sinh hóa


Các lưu ý có thể có liên quan đến sự ổn định
của kết quả
GIớI HạN PHÁT HIệN (LOD) VÀ
GIớI HạN ĐịNH LƯợNG (LOQ)– PP
ĐịNH LƯợNG

Mức tới hạn (Critical level – LC)

là mật độ VSV mục tiêu thấp nhất mà pp có thể
phát hiện được (không cho giá trị định lượng
chính xác)

Tại giá trị này khả năng phát hiện chính xác là β~50%

Giới hạn phát hiện (LOD)

là mật độ VSV trong 1 đơn vị mẫu mà tại đó khả
năng phát hiện của phương pháp là 1- β (50%
đến 95%)
LOD = X
o
+ 3.3 S
o


X
0
: kết quả trung bình phân tích lặp lại nhiều lần từ mẫu trắng


S
o
: độ lệch chuẩn của mẫu trắng (mẫu có mật độ gây nhiễm thấp)
GIớI HạN PHÁT HIệN (LOD) VÀ
GIớI HạN ĐịNH LƯợNG (LOQ)– PP
ĐịNH LƯợNG

Giới hạn định lượng:

là mật độ vi sinh vật thấp nhất trong
đơn vị mẫu mà phương pháp cho phép
định lượng có độ chính xác đạt yêu cầu
của PTN.

Thông thường LOQ được xác định bằng
công thức tương ứng với hệ số biến
động CV ≤ 10%
LOQ = X
o
+ 10 S
o
CÁCH XÁC ĐịNH CÁC THÔNG Số
LC, LOD, LOQ

Xác định gián tiếp

Phân tích lặp lại nhiều trên mẫu trắng để xác
định S
o
Lặp lại ít nhất là 6 lần, thông thường là 10 lần/

đối tượng mẫu
Mẫu trắng thường được chọn là mẫu tự nhiên có
mật độ nhiễm thấp
(Mẫu trắng được hiểu là mẫu âm tính, mẫu có
mật độ nhiễm bằng 0 hoặc gần 0 – ISO 16140)

Tính độ lệch chuẩn S
o
từ các kết quả nhận được

Tính X
o
: nếu thực hiện song song với pp tham
chiếu khác
(X
o
là kết quả trung bình nhiều lần lặp lại bằng
PP tham chiếu)
CÁCH XÁC ĐịNH CÁC THÔNG Số
LC, LOD, LOQ

Xác định trực tiếp

Thực hiện phân tích với các mật độ khác nhau: 3,
10, 30, 100 … CFU/đơn vị mẫu. Mỗi nồng độ
nhiễm lặp lại 6 lần.

Xác định mật độ nhiễm có tỉ lệ phát hiện khoảng
50%/đơn vị cấy (LC).


Áp dụng các công thức
LC = 1,65 S
o
LOD = 3,3 S
o
LOQ = 10 S
o
ĐỘ TUYẾN TÍNH

Định nghĩa

Là khả năng của phương pháp khi
phân tích trên một nền mẫu biết
trước cho kết quả phù hợp với giá trị
hiện diện trong mẫu, khi gia tăng
hàm lượng đối tượng phân tích thì
gia tăng kết quả một cách tương ứng

Là khả năng suy đoán kết quả phù
hợp với hàm lượng vi sinh vật hiện
diện trong mẫu trong qua các độ pha
loãng khác nhau
PHƯƠNG TRÌNH TUYếN TÍNH
-
Suy đoán kết quả dựa vào phương trình hồi qui tuyến tính
-
Phương trình có dạng: Y = mX + b
trong đó
Y: kết quả suy đoán
X: Giá trị biết trước

m: hệ số tuyến tính (giá trị mong muốn
=1)
b: Độ lệch gốc (giá trị mong muốn = 0)
-
Phương trình lý tưởng: Y = X
Đồ THị BIểU DIễN MốI TƯƠNG
QUAN GIữA CÁC ĐạI LƯợNG
Phương pháp tham chiếu
Phương pháp mới
Giới hạn biến động
(Variability)
Giới hạn qui định
Vùng dương tính
giả
Vùng âm tính giả
Giới hạn tới hạn
(CL)
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Dường hồi qui tuyến tính