Tiểu luận sinh học NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO

Thành viên nhóm 7:
STT Họ và tên MSV Lớp
1 Nguyễn Thị Duyên 570960 K57CNSHC
2 Nguyễn Thị Anh Đào 560785 K56CNSHA
3 Phạm Thị Huệ 560808 K56CNSHA
4 Lê Ngọc Mai 560827 K56CNSHA
5 Phùng Tiến Quang 560853 K56CNSHA
6 Phạm Thị Thảo 560866 K56CNSHA
7 Đào Trần Trung 550413 K55CNSHA
8 An Thị Yến 560895 K56CNSHA
A. ĐẶT VẤN ĐỀ:
Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những công nghệ
quan trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các
công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Nhờ đó mà người ta có
thể tạo ra được những giống cây trồng có năng suất cao, chống chịu với sâu bệnh,
mở ra khả năng lai khác loài và làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền Hiện nay,
người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách rời ở qui mô
công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế
cao.
Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân
giống thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường
thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cung cấp trên thị trường, giá thành lại
cao, do việc phải cấy chuyển, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện
bằng tay, tốn nhiều lao động lại dễ bị nhiễm.
Chính vì vậy cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới có thể tự động hóa.
Năm 1981, Taykayama và Misawa đã đề xuất một hệ thống nuôi cấy lỏng có thể
sục khí chủ động từ ngoài vào. Trong đó có ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy
lỏng lắc và nuôi cấy Bioreacter, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế
bào. Nuôi cấy Bioreacter là một phương pháp đầy hứa hẹn cho nhân giống với só
lượng lớn tế bào, phôi soma hay các đơn vị phát sinh cơ quan (củ, chồi ), và sản
xuất các hoạt chất trao đổi thứ cấp bằng sử dụng tế bào thực vật.

B.
NỘI DUNG
I.
Giới thiệu chung:
1.
Khái niệm chung:
Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures) là phương thức nuôi
tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng
trong môi trường lỏng. Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô
sẹo không có khả năng biệt hóa, trong môi trường lỏng và được chuyển động trong
suốt thời gian nuôi cấy.
Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng. Ở đó
chúng sinh trưởng,phân chia và có thể hình thành những cụm tế bào kết tập. Dung
dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào. Điều kiện quan trọng của nuôi
cấy huyền phù tế là môi trường nuôi cấy được khuấy lắc liên tục với tốc độ 100-
150 vòng/phút.
Các mô sẹo nuôi cấy trên môi trường chứa 2.4D là nguồn nguyên liệu thích
hợp để tạo huyền phù tế bào và để nhận được 100ml huyền phù tế bào thường cần
2-3g mô callus tươi.
Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm
tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.
2.
Đặc trưng cuả tế bào nuôi cấy huyền phù:
- Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn, xấp xỉ
2-3g/100ml dung dich môi trường (helgeson, 1979). Theo King và street (1977),
không có một quy trình chuẩn nào cho nuôi cấy huyền phù tế bào.
- Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp tế bào đơn, các
cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.Mức độ tách rời của
các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể được đều chỉnh
bởi thành phần môi trường.

VD: trong nhiều trường hợp, tăng tỷ lệ auxin/cytokinin sẽ sản sinh nhiều
khối tế bào xốp.
- Chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù: có dạng đường cong
chữ S với các pha sinh trưởng sau:
+Pha tiềm sinh (Lag-phase): ở pha này không xảy ra sự tăng về khối lượng
và số lượng tế bào (A).
+Pha số mũ (Exponential phase): ở pha này sự phân chia và sự tăng khối
lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất. Ngoài ra sự sinh trưởng tế bào cũng tăng
nhanh (B).
+Pha tuyến tính (Linear log-phase): được đặc trưng bởi sự sinh trưởng của
tế bào diễn ra ổn định liên tục (C).
+Pha ổn định: ở pha này hoạt tính phân bào giảm mạnh, số lượng và khối
lượng tế bào ổn định (Stationary phase-D).
+Pha suy thoái (Dead phase): sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao,
giảm xuống và dần đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyển (E).
- Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy truyền vào
giai đoạn đầu của pha ổn định và ở thời điểm khi sự kết tập của tế bào là lớn nhất.
Sự kết tập của tế bào là lớn nhất trong khoảng 18-25 ngày, với huyền phù sinh
trưởng mạnh có thể ngắn hơn, từ 6-9 ngày. Ở lần cấy truyền đầu tiên, dịch nuôi cần
được lọc nhằm loại bỏ cụm tế bào lớn. Lượng tế bào đem cấy truyền phải đủ lớn để
đảm báo mật độ tế bào, vì khi thấp quá các tế bào sẽ không sinh trưởng được.
VD: đối với tế bào cây sung dâu (Acerpseudoplatanus) mật độ thích hợp
9-15.10
3
tb/ml.
- Theo King (1980), những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy,sinh
trưởng và trao đổi chất trong dịch huyền phù gọi là dòng tế bào, có đặc điểm sau:
+ Khả năng tách tế bào cao.
+Hình thái tế bào đồng nhất.
+ Nhân rõ ràng và tế bào chất đậm đặc.

+ Nhiều hạt tinh bột.
+ Tương đối ít các yếu tố mạch.
+ Có khả năng nhân đôi trong 24-72h.
+ Mất tính toàn năng.
+ Quen với chất sinh trưởng.
+ Tăng mức đa bội thể.
3.
Môi trường nuôi cấy:
Về bản chất các tế bào huyền phù là loại tế bào callus, do đó môi trường
nuôi cấy calus có thể sử dụng để khởi đầu việc nuôi cấy huyền phù tế bào với việc
cải tiến hàm lượng và tỉ lệ auxin/cytokinin cho phù hợp để có được các tế bào
phân tán tốt trong môi trường lỏng lắc.
Huyền phù tế bào được duy trì bằng sự cấy chuyển liên tục ở đầu pha ổn
định và ở thời điểm khi sự kết tập của tế bào là lớn nhất.
4.
Các chỉ tiêu sinh trưởng:
- Số lượng tế bào:
Trước khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C
trong 5 – 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài phút.
Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buồng đếm hồng cầu.
Kết quả: số lượng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy.
- Thể tích tế bào:
Lấy ngẫu nhiên một thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/
phút trong thời gian 5 phút.
Thu tế bào và đem xác định thể tích.
Kết quả: Số ml tế bào/thể tích môi trường nuôi cấy.
- Khối lượng tươi:
Thu thập tế bào trong một thể tích dịch xác định.
Rửa bằng nước cất vô trùng
Làm khô trong chân không.

Cân để xác định khối lượng.
- Khối lượng khô:
Lấy một thể tích mẫu xác định.
Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào trên giấy lọc Whatman.
Sấy khô trong 12h ở 800C đến khối lượng không đổi.
- Xác định chỉ số nguyên phân (chỉ số phân bào):
Huyền phù tế bào được cố định trong hỗn hợp Aceto-orcein : Acid Acetic
(3:1) sau đó chuyển sang lam kính. Nhỏ 1 giọt Aceto-orcein lên mẫu, hơ trên ngọn
lửa đèn cồn, để nguội trong 5 phút. Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sát
dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100. Xác định các kỳ trong khoảng 1000 tế
bào. Tỷ lệ % các tế bào đang phân bào gọi là chỉ số nguyên phân.
Tổng số tế bào phân bào x 100
Chỉ số phân bào(%) =
Tổng số tế bào kiểm tra
- Khả năng sống của tế bào: nhuộm bằng flurescein diacetate (0,01%) và
quan sát màu xanh dưới sự chiếu sáng tử ngoại (ultraviolet).
II.
Kĩ thuật sử dụng trong nuôi cấy huyền phù tế bào
1.
Nuôi cấy dịch thể động :
1.1. Nuôi cấy chìm liên tục :
- Các tế bào được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng do chúng
được ngâm hẳn vào dung dịch môi trường. Khí đưa vào phải đảm bảo vô trùng.
Quá trình thông khí còn ngăn chặn và làm giảm sự kết dính của các tế bào với
nhau.
- Theo Thomas và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có
dung tích 25ml, tốc độ phù hợp nhất của máy lắc là 100 – 120 vòng/phút.
- Thể tích của môi trường lỏng cũng phải phù hợp với kích thước
bình nuôi cấy, thường chiếm 20% thể tích bình. Các nuôi cấy quy mô nhỏ và trong
những thời gian ngắn, có thể sử dụng máy khuấy từ ở tốc độ 250 vòng/phút và thời

gian cho quá trình nuôi cấy thường từ 10 – 15 ngày.
- Sau đó, các mẫu nuôi cấy phải được cấy chuyển sang môi trường
mới để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào.
1.2. Nuôi cấy chìm tuần hoàn :
Các tế bào được nhúng chìm vào môi trường dịch thể, xen kẽ với những
khoảng thời gian được đưa ra ngoài môi trường.Quá trình được thực hiện nhờ sự
chuyển động “bập bênh” của các bình nuôi cấy. Khi chuyển động: Khối tế bào ở
đầu này được đưa vào môi trường. Khối tế bào ở đầu kia tiếp xúc với không khí.
2. Nuôi cấy huyền phù tế bào bằng Bioreactor:
Hệ thống Bioreacter có rất nhiều nhưng phổ biến nhất là hệ thống
Bioreacter kiểu Air-lift và hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời.
II.1.
Cấu tạo chung:
Chứa các thành phần như bộ điều chỉnh nhiệt độ - pH, thùng chứa dung
dịch dinh dưỡng, hệ thống cung cấp không khí, hệ thống cánh khuấy (một só thiết
bị được thay bằng bộ sục khí nén từ dưới lên ).
Nguyên tắc hoạt động của từng thiết bị phụ thuộc vào từng công nghệ sản
xuất.
II.2.
Bioreacter không có cánh khuấy:
Đây là kiểu Bioreacter đơn giản, được thiết kế với một bộ phận sủi bọt
khí ở phía dưới đáy bình, nó có tác dụng khuấy trộn môi trường và cung cấp oxy,
lượng oxy cung cấp ảnh hưởng đến sự phát triển của đối tượng. Dòng khí vào pha
lỏng phải được thổi qua một màng lọc có các lỗ kích thước nhỏ 0.01 – 0.1mm.
Chính nhờ sự nhỏ mịn của các bong bóng khí đã làm giảm đáng kể sự cọ xát cho
các tế bào nên tế bào ít bị tổn thương, nhất là đối với những tế bào có nhạy cảm
cao.
- Ưu điểm:
+Khả năng nhân sinh khối rất nhanh, chồi phát triển tương đối đồng đều.
+Hệ thống này rất phù hợp cho những quá trình nhân sinh khối tế bào và

nhân sinh khối rễ do khả năng chịu được sự ngập chìm trong môi trường.
+Thực tế hiện nay người ta đang sử dụng hệ thống này vào sản xuất giống
hay sinh khối như nuôi củ hoa Lily, hoa thu Hải đường hay nhân sâm của phân
viện sinh học Đà Lạt.
- Khuyết điểm:
+ Sự cung cấp Oxy không được đồng đều trong toàn bộ môi trường.
+ Hiện tượng thủy tinh thể do ngập chìm hoàn toàn và liên tục.
+ Khó áp dụng một cách đồng loạt cho nhiều giống khác nhau.
+ Nuôi cấy trong môi trường lỏng dễ bị nhiễm vi sinh vật như nấm, vi
khuẩn, côn trùng
II.3.
Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS):
II.3.1.
Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống:
Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi
Teisson và cộng sự năm 1999:
- Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh
trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy.
- Cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ.
- Cung cấp sự hòa trộn đầy đủ.
- Có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động.
- Hạn chế sự nhiễm.
- Giá thành hạ.
Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một
nguyên tắc là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ
xác định. Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một
bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với
hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển. Các mẫu cấy
thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa polypropylene thành một cụm, điều này
giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy

thông thường.
Tóm lại, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ
phận chủ yếu sau:
- Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để hút môi trường từ ngăn chứa
lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại.
- Hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiển chu kỳ ngập.
- Hệ thống ống dẫn và van điều khiển.
- Các màng lọc.
- Bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh.
Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời,
nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mục
đích nuôi cấy khác nhau.
Ở nước ta, Phân viện Sinh học Đà Lạt đã chế tạo thành công hệ thống nuôi
cấy này và đã thành công trong việc nhân giống nhanh loài hoa African violet.
Trên thị trường đã có một số hệ thống đã được thương mại hóa như: Hệ thống
RITA, hệ thống bình đôi BIT, hệt thống Plantima. Tất cả các hệ thống này đều tuân
theo những điều kiện là tránh sự ngập nước liên tục, có thể thay đổi môi trường,
điều khiển tự động và hạn chế sự nhiễm.
II.3.2.
Ưu điểm:
+ Phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Phát sinh
chồi và phôi soma không bị biến dị với tần số cao.
+ Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi luôn cao hơn so với hệ thống
thông thường trên môi trường rắn hay Bioreacter thông thường.
+ Cây tái sinh và phôi soma thu được luôn có chất lượng tốt hơn, tỉ lệ sống
sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh.
+ Hạn chế hiện tượng thủy tinh thể.
+ Tiết kiệm công lao động và không gian nuôi cấy, giảm chi phí sản suất.
+ Giảm hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh
trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy.

II.3.3.
Khuyết điểm:
+ Chưa khảo sát được mật độ nuôi cấy.
+ Giá thành của thiết bị rất đắt, chưa được tự chế tạo trong nước.
+ Các thông số kĩ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối
ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây.
II.3.4.
Ảnh hưởng của hệ thống ngập chìm tạm thời lên chất lượng nuôi cấy:
Khi nuôi cấy chồi trong hệ thống TIS thì lá nhỏ hơn lá trong môi trường
nuôi cấy lỏng. Những cụm chồi phát triển từ các chồi bên trong Bioreacter thường
có hình cầu và chồi có xu hướng phát triển tỏa tròn xung quanh tâm. Do đó một
số chồi con có kích thước không lớn. Chồi cây có thân dài hơn và ra nhiều lá hơn
so với nuôi cấy trên môi trường thạch. Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập
chìm tạm thời lên sự phát triển chồi có thể là kết quả của việc sử dụng những bình
chứa dung tích lớn.
III.
Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào trong nhân giống vô tính
- Quy trình nuôi cấy:
Quy trình nuôi cấy huyền phù tế bào thường qua hai bước cơ bản là nuôi
cấy callus và nuôi cấy dịch huyền phù:
- Nuôi cấy callus: Callus là dòng tế bào ban đầu, tương tự mô sẹo
tạo ra để hàn gắn vị trí tổn thương của cây. Khi đã có callus, tiến hành cấy chuyển
nhiều lần trong môi trường thạch mềm vì nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng
mô sẹo khá lớn.
- Nuôi cấy dịch huyền phù: Callus được cấy
chuyển sang môi trường lỏng chuyển động bằng cách lắc hoặc khuấy. Đây là giai
đoạn rất quan trọng, nghiên cứu khảo sát được môi trường và điều kiện nuôi cấy
thích hợp cho tế bào phát triển tốt nhất và có hàm lượng hoạt chất cao nhất có tính
chất quyết định thành công của quá trình nuôi cấy tế bào. Trong quá trình nuôi cấy,
các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi

trường. Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các
cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển
và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ
cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Mức độ tách rời của tế bào trong
nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng
cách thay đổi thành phần môi trường.
- Sự phát sinh phôi soma:
Sự phát sinh phôi soma cũng được áp dụng trong việc nhân giống cây
trồng với số lượng lớn trong Bioreactor tự động. Do có kích thước tương đối nhỏ
và đồng đều kích cỡ, chúng không phải cắt thành những mảnh nhỏ và tách rời khi
nuôi cấy trong môi trường tăng sinh.
Tính toàn năng của tế bào thực vật, khả năng tạo phôi mới và sự biểu hiện
kiểu hình là cơ sở để đưa ra giả thiết về sự phân lập và nuôi cấy tế bào thực vật
trong môi trường lỏng, đặc biệt là giúp kích thích tạo phôi đơn bội. Quá trình phát
sinh phôi soma được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường kích thích có chứa
auxin (thường dùng 2,4D) và nước dừa ban đầu. Sau đó, dùng nhiều xytokinin,
myo-inosiol và giảm lượng nitrogen. Khi các cụm tiền phôi được tạo thành thì hạ
thấp hoặc lấy bớt nồng độ auxin trong môi trường. Sau đó, trình tự giống như quá
trình tạo phôi giao tử (đơn bội) sẽ diễn ra.
Phôi soma thường nhỏ và thích hợp cho các quy trình nhân sinh khối,
chúng có thể được phân tách, đưa vào khuấy trộn, sau đó cất trữ hay tạo ra cây con
trực tiếp. Sản lượng và chất lượng phôi soma của nhiều loài thực vật đã được cải
thiện nhờ vào hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời.
- Sự nhân chồi:
Hệ thống ngập chìm có tác dụng thúc đẩy việc nhân chồi. Khi nuôi cấy
trên hệ thống lỏng, kết quả sinh trưởng chồi thu được tốt hơn cấy chuyền trên môi
trường rắn.
Trong hệ thống Bioreacter chồi có thể tăng trưởng liên tục, vì thế cho phép
thu hoạch chồi sau mỗi tháng trong khoảng thời gian 19 tháng mà không cần cấy
chuyền. Điều quan trọng là chồi thu được trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm có

chất lượng tốt hơn và dài hơn so với chồi trên môi trường rắn.
Sau khi thu hoạch, cây con được chuyển ra nuôi ở môi trường tự nhiên bình
thường như trên môi trường thạch.
IV.
Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào trong sản suất sinh khối tế bào
thực vật và các hợp chất có giá trị cao
1.
Nhân sinh khối callus:
Trong những năm gần đây, việc nuôi cấy nhân sinh khối callus đang được
chú ý nhiều để sản xuất các hoạt thứ cấp.
Khi nuôi cấy callus trên hệ thống Bioreactor để thu nhận các sản phẩm
thứ cấp thì hiệu suất mang lại rất cao. Hiện nay cũng có một số sản phẩm sản xuất
từ hệ thống này như Alkaloid: morphinan alkaloid.berberine, tropane alkaloid,
cardinolides; các hợp chất kháng ung thư :amptorthecin, homoharringtonine,
podophyllotoxin, vinca alkaloid, taxol, saponin
Và cũng đã có một số thành công trong việc sử dụng Bioreactor nuôi cấy
huyền phù tế bào như cây thông đỏ, cây dừa cạn, cây sam Triều Tiên, cây lan
gấm với thể tích của bình nuôi cấy từ vài chục lít đến vài chục nghìn lít.
Saurbh C. và cộng sự (2001), khi nuôi cấy trong hệ thống Bioreactor 3L,
thì sinh khối và hợp chất podophyllotoxin thu được từ nuôi cấy huyền phù cây
Polophyllum hexandrum là 6,5g/l và 4,26mg/l trong 22 ngày.
2.
Một số hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy huyền phù tế bào
thực vật:
- Diosgenin:
Có ở cây Củ nâu. Tác dụng chống viêm; chữa sốt, đái buốt, đái vàng, thấp
khớp, đau lưng, đau dây thần kinh. Việc nuôi cấy trong bioreactor đã thu được
năng suất diosgenin cao hơn so với hiệu suất có được từ nguyên liệu tự nhiên,
diosgenin chiếm 7.8 % khối lượng khô, trong khi chỉ chiếm 2 % với nguyên liệu
thực vật thu hái trong tự nhiên.

- Codein:
Có ở Cây anh túc (Papaver somniferum), tác dụng giảm đau và giảm ho.
Cây anh túc là nguồn của hai hợp chất rất quan trọng trong y học là morphine và
codein. Sản xuất morphin đã được thực hiện bằng việc nuôi cấy huyền phù tế bào
tế bào cây anh túc.
- Steviol:
Có trong Cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana), là chất tạo vị ngọt được biết đến
rộng rãi. Nuôi cấy callus là giai đoạn tiền đề để nuôi cấy huyền phù tế bào trong
tích lũy steviol.Trong nuôi cấy callus, hiệu suất đạt tới 36.4 %.
- Taxol:
Có trong cây thông đỏ (Taxus brevifolia). Đây là một nhóm chất trong hóa
trị liệu ung thư, điều trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi, khối u ác
tính, và các dạng u bướu khác.
- Scopolamine và hyoscyamine:
Có nhiều trong các cây thuộc họ Solanaceae, là hai loại alkaloid được sử
dụng để trị co thắt và gây mê. Nuôi cấy huyền phù tế bào cà độc dược (Datura
metel) có bổ sung tropic acid (như một tiền chất) thì có thể tăng hàm lượng
alkaloid lên 15 lần.
- Saponin và sapogenin:
Là một dược phẩm quý giá, có nhiều trong rễ cây nhân sâm (Panax
ginseng). Tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, chống suy nhược cơ thể, tăng
cường sinh lực.
Nuôi cấy huyền phù tế bào cây P. ginseng đang tiến hành trên quy mô
công nghiệp. Đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới
tập trung nghiên cứu nhiều nhất.
- Betalaine:
Là một nhóm các chất nhuộm màu thực phẩm, bao gồm betaxanthine (màu
vàng) và betacyane (màu đỏ). Thành tựu nuôi cấy cơ quan cây Beta vulgaris, nuôi
cấy callus và huyền phù của Portulaca americana. Củ cải đỏ (Beta vulgaris).
V.

Ứng dụng trong nuôi cấy thông đỏ đê thu nhận Taxol:
1.
Một số giá trị từ cây thông đỏ:
- Thông đỏ (Taxus) được coi là một nguồn dược
liệu quan trọng sau việc khám phá một hợp chất diterpene amide chống ung thư
mới với tên thương mại là “Taxol” từ vỏ rễ, hạt phấn, hạt, lá, thân non, thân gỗ của
cây thông đỏ Thái Bình Dương (Taxus brevifolia). Nó còn là nguồn dược liệu rất
quý trong y học, từ lâu trong dân gian đã dùng lá của loài cây này để trị hen suyễn,
viêm phế quản, nấc, tiêu hoá… cành và vỏ dùng trị bệnh thực tích giun đũa, nước
sắc của thân non dùng trị đau đầu…đặc biệt vào năm 1994 một số nhà khoa học
trên thế giới công bố: “từ cây thông đỏ có thể tìm thấy các hoạt chất để chữa trị
bệnh ung thư cụ thể là Taxol chiết suất từ vỏ các loài: T. brevifolia, T. cuspidata,
T.yunnanensis, T. baccata và T. wallichiana,… đều có chất lượng và hiệu suất cao
được dùng để chữa trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư đầu, cổ và có triển
vọng xử lý hắc tố (melenomas)
- Taxol đã được Cục quản lý thực phẩm & dược phẩm Hoa Kỳ
(FDA) chứng nhận khả năng chữa ung thư buồng trứng và ung thư vú, chống
các khối u ác tính, ung thư phổi và một số dạng khối u rắn khác. Nuôi cấy mô
Taxus spp. được coi như một cách tiếp cận rất khả quan trong việc cung cấp nguồn
nguyên liệu quý này vì nó có thể tạo ra một lượng lớn cây trong thời gian ngắn ở
điều kiện có thể kiểm soát được.
2. Quy trình nuôi cấy
- Mẫu nuôi cấy: có thể lấy phần ngọn, lá,…mẫu dùng để nuôi cấy phải có
những tính chất sau:
+Mẫu tế bào phải được lấy từ cây biết chắc chắn có khả năng sinh tổng hợp
chất cần thiết và có khả năng được tổng hợp hay chuyển hoá cao nhất.
+Mẫu phải sạch bệnh và đang trong giai đoạn phát triển mạnh nhất.
- Khi mẫu cấy tạo thành mô sẹo, cấy mô sẹo này vào trong môi trường
lỏng dùng để nuôi cấy tế bào đơn, môi trường nuôi cấy ở đây là:
+ Khoáng MS (Murashige-Skoog)

+ Ngoài ra còn bổ sung thêm: nước dừa; 2,4-D hoặc các loại auxin khác;
bột chiết nấm men, bổ sung saccharose,…
- Đầu tiên mô sẹo được nuôi cấy trong các bình tam giác thể tích 200ml
có chứa 20ml môi trường và đặt trên máy lắc có tốc độ 90-100 vòng/phút, nuôi ở
nhiệt độ 28-30
o
C, với ánh sáng 3000 lux, cứ khoảng 2-3 ngày lấy mẫu ra kiểm tra
bằng cách đếm đưới kính hiển vi, xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào.
- Sau 1-2 tuần trong bình nuôi cấy sẽ tạo huyền phù tế bào :
+ Tế bào có khả năng sinh phôi
+ Tế bào không có khả năng sinh phôi
- Sau 8 ngày sẽ thu được sinh khối, chuyển toàn bộ sinh khối này sang quá
trình nuôi kế tiếp, dung tích mỗi lần nuôi sau nhiều hơn lần nuôi trước khoảng 10-
15 lần, cứ như vậy nhân giống cho đến khi đủ lượng giống cho sản xuất lớn, tỷ lệ
giống trong sản xuất lớn khoảng 1-5%.
- Hiện nay đã thiết kế những thiết bị nuôi cấy tế bào đơn với dung tích hàng
chục m
3
thiết bị lên men ở đây tương tự như trong công nghệ vi sinh vật. Đối với
các thiết bị nuôi cấy tế bào đơn không có hệ thống cung cấp oxygen mà chỉ có cách
khuấy thì cần phải có hệ thống chiếu sáng đảm bảo cho quá trình tự dưỡng của tế
bào xảy ra .
VI.
KẾT LUẬN
Với nhiều ưu điểm vượt trội của mình, phương pháp nuôi cấy huyền phù
tế bào đang được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu cũng như trong thực tiễn sản
xuất. Khi tìm được điều kiện thích hợp, các nhà khoa học có thể phát triển quy mô
nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy sinh học Bioreactor có dung tích khác nhau.
Sau khi nghiên cứu thành công quy trình nuôi cấy tế bào trong phòng thí nghiệm,
các nhà khoa học tiếp tục triển khai các phòng sinh khối tế bào thực vật. Từ đó sử

dụng các kỹ thuật chiết tách để thu nhận các hợp chất cần thiết. Nuôi cấy huyền
phù tế bào đang mở ra nhiều định hướng phát triển cho tương lai.
Tuy nhiên, do cơ sở vật chất cơ bản cho một phòng thí nghiệm nuôi cấy
huyền phù tế bào còn cao nên ở Việt Nam, hướng nuôi cấy huyền phù tế bào chỉ
dừng lại ở mức nghiên cứu.
Trong những năm gần đây, Việt Nam đã thành công trong những quy trình
áp dụng các phương pháp của nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất ra các chế
phẩm sinh học, y học
Tài liệu tham khảo:
/>hoc-thuc-vat-22650/
/>ginseng-ca-meyer-168630