Tải bản đầy đủ (.doc) (28 trang)

CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (704.13 KB, 28 trang )

1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
&
Công nghệ proteins- enzyme
Chuyên đề 7:
CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỨC
NĂNG CỦA PROTEIN
GVHD: TS. Đặng Xuân Nghiêm
Sinh viên thực hiện: Triệu Thị Linh
Mã SV: 550362
Hà nội, 4/2013
1
2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN
PHẦN 1: CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN
1. Khái Niệm
1.1Protein
1.1.1 Protein là gì?
Tất cả các tế bào sống đều chứa Protein, điều đó có nghĩa là protein là chất cần cho
sự sống. Vì người ta cho rằng Protein là thành phần quan trọng nhất trong các vật
chất của sự sống, cho nên trong tiếng anh, protein bắt nguồn từ chữ Hy Lạp có nghĩa
là “thứ nhất”. Về định nghĩa chính xác Protein là gì, có nhiều cách nói khác nhau,
nhưng tự chung lại, đều thống nhất cho rằng: Protein là hợp chất cao phân tử giữ
nhiều vai trò nòng cốt trong cơ thể. Hầu hết chúng làm việc trong tế bào đáp ứng yêu
cầu của các bào quan và mô trong cơ thể về cấu trúc, chức năng và điều hòa. Protein
được chứa trong tất cả các phần của cơ thể của bạn, làn da, cơ bắp, tóc, máu, bộ
phận cơ thể, đôi mắt, ngay cả móng tay và xương
.
1.1.2 Cấu trúc – chức năng của Protein
Theo công trình nghiên cứu :” What is protein” của Georgia C. Lauritzen thuộc đại


học Utah State: “Protein được cấu tạo từ các đơn vị nhỏ hơn được gọi là các axit
amin. Hiên nay đã phát hiện ra hơn 20 loại axit amin khác nhau. Mỗi phân tử protein
bao gồm rất nhiều các axit amin, được sắp xếp theo một trình tự ngẫu nhiên, từ đó tạo
ra hàng trăm, hàng nghìn các phân tử protein có cấu trúc khác nhau. Hầu hết các
protein là các phân tử lớn có thể chứa hàng trăm axit amin được sắp xếp trong các
ngành và các chuỗi”. Trình tự axit amin xác định cấu trúc không gian 3 chiều của
protein và chức năng chuyên biệt của chúng. Có 5 loại cấu trúc không gian, ứng với
5 chức năng của Protein như sau:
2
3
• Kháng thể
(antibody)
Đây là các protein có
khả năng bám vào các
phân tử ngoại lai như vi
khuẩn, vi rút, sau đó vô
hiệu hóa chúng để bảo
vệ cơ thể. Trong hình
bên là cấu trúc không
gian của protein kháng thể:
Immunoglobulin G (lg G).
• Enzyme
Enzyme xúc tác cho
hầu hết các phản ứng
hóa học xảy ra trong
tế bào. Chúng cũng
giúp đỡ hình thành
những phân tử mới
bằng cách đọc thông
tin di truyền lưu trữ

trong DNA.
3
4
Vídụ hình bên:
Phenylalanine
hydroxylase.
• Thông tin -
Messenger
protein thông tin, như
một số loại hormone,
truyền tải tín hiệu để
phối hợp các quá trình
sinh học giữa các tế bào,
mô, cơ quan khác nhau.
Ví dụ: hormone tăng
trưởng (Growth
hormone)
• Thành phần cấu
trúc
4
5
Những protein này cung cấp cấu trúc và nuôi dưỡng tế bào. Trong một phạm vi lớn
hơn, chúng còn cho phép tế bào di chuyển. Ví dụ: Actin
• Vận chuyển-dự
trữ
các protein này bám
vào những nguyên tử
và phân tử nhỏ bên
trong tế bào và lưu
thông trong cơ thể. Ví

dụ: Ferritin
1.2 Vai trò Protein trong sinh học
Như đã nói ở trên, Protein có vai trò cực kỳ quan trọng trong đời sống sinh học
nói chung cũng như con người nói riêng.
1.2.1 Vai trò
Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn
phân là axit amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết
5
6
peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo
nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein.
• Protein hình thành, duy trì và thay thế các tế bào trong cơ thể. Protein
chiếm tới trên 50% khối lượng khô của tế bào và là vật liệu cấu trúc của tế
bào. Thiếu protein dẫn đến suy dinh dưỡng, chậm lớn, suy giảm miễn dịch,
ảnh hưởng xấu đến chức năng của các cơ quan trong cơ thể.
• Protein là tham gia vào thành phần cơ bắp, máu, bạch huyết, hocmôn, men,
kháng thể, các tuyến bài tiết và nội tiết. Vì vậy, protein có liên quan đến
mọi chức năng sống của cơ thể (tuần hoàn, hô hấp, sinh dục, tiêu hóa, bài
tiết hoạt động thần kinh và tinh thần ).
• Protein cần thiết cho chuyển hóa bình thường các chất dinh dưỡng khác,
đặc biệt là các vitamin và chất khoáng. Khi thiếu protein, nhiều vitamin
không phát huy đầy đủ chức năng của chúng mặc dù không thiếu về số
lượng.
• Protein còn là nguồn năng lượng cho cơ thể, thường cung cấp 10%-15%
năng lượng của khẩu phần, 1g protein đốt cháy trong cơ thể cho 4 Kcal
(trong khi đó Gluxit là 4 Kcal, Lipit là 9kcal và rượu là 7kcal)
• Protein kích thích sự thèm ăn và vì thế nó giữ vai trò chính tiếp nhận các
chế độ ăn khác nhau. Thiếu protein gây ra các rối loạn quan trọng trong cơ
thể như ngừng lớn hoặc chậm phát triển, mỡ hóa gan, rối loạn hoạt động
nhiều tuyến nội tiết (giáp trạng, sinh dục), thay đổi thành phần protein

máu, giảm khả năng miễn dịch sinh học của cơ thể và tăng tính cảm thụ
của cơ thể với các bệnh nhiễm khuẩn.
6
7
2. Phân tích cấu trúc Protein
2.1 Phân tích cấu trúc Protein là gì?
Như đã trình bày, mỗi một loại protein với chức năng khác nhau sẽ có một thành
phần và trình tự axit amin khác nhau, cũng như cấu trúc không gian khác nhau.
Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra những thông tin này là vô cùng cần thiết trong
sinh học. Từ các thông tin đó, chúng ta có thể biết được chính xác protein nào, có
chức năng gì, để từ tìm cách tổng hợp nhân tạo protein, hay bố sung protein cần
hoặc loại bỏ các protein có hại. Phân tích cấu trúc Protein chính là nhằm mục đích
này.
Hiện nay, trên thế giới, công tác nghiên cứu về phân tích cấu trúc protein đang rất
được đẩy mạnh. Hàng loạt các công trình nghiên cứu, các bài báo khoa học được
công bố cho phép con người có cái nhìn sâu và rộng hơn về thế giới sinh học phân tử
protein. Và chúng cũng được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực: y tế, nông nghiệp,

2.2 Các phương pháp phân tích
Protein, tuy được gọi là một “đại” phân tử của thế giới vi mô, tuy nhiên mắt thường
của chúng ta sẽ không thể nhìn thấy chúng được. Chính vì vậy, để nghiên cứu những
đối tượng này, cần sử dung những phương pháp đặc hiệu với sự trợ giúp của các
phương tiện khoa học kỹ thuật hiện đại, đó cũng chính là lý do việc phân tích cấu
trúc protein chỉ thực sự khởi sắc trong vài năm trở lại đây, theo sự tiến bộ của khoa
học kỹ thuật.
7
8
Hiện nay, có nhiều phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu protein, sau đây xin
giới thiệu sơ lược một vài phương pháp hữu hiệu nhất
2.2.1 Tinh thể học tia X (X-ray crystallography)

William Henry Bragg (1862-1942) là người đi tiên phong trong việc phát triển
phương pháp X-ray. Bragg có vô số hứng thú nghiên cứu, nhưng công trình mang lại
tên tuổi cho ông là một nhà khoa học hàng đầu là tiến bộ mang tính lịch sử của ông
trong tinh thể học tia X. Làm việc với người con trai, William Lawrence Bragg, ông
đã phát triển một phương pháp bắn phá các tinh thể với tia X năng lượng cao phát ra
bởi những ống chân không được cấu trúc đặc biệt. Khi tia X đi qua đơn tinh thể,
chúng bị nhiễu xạ theo một điều kiện do cha con Bragg khám phá ra và do đó suy
luận định lượng ra đường đi của chúng. Hình ảnh tia X nhiễu xạ có thể được chụp
trên kính ảnh, vì tia X làm phơi sáng các hạt bạc bromide khi chúng va vào. Bằng
cách khảo sát hình ảnh tia X nhiễu xạ bởi những tinh thể khác nhau, Bragg và con
trai của ông đã có thể thiết lập một số mối liên hệ toán học cơ bản giữa một cấu trúc
tinh thể nguyên tử và hình ảnh nhiễu xạ của nó. Với thành tựu này, , William Henry
Bragg và William Lawrence Bragg được tặng Giải Nobel Vật lí năm 1915.
Tinh thể học tia X (X-ray crystallography) được ứng dụng nhiều trong sinh học để
xác định cấu trúc của các đại phân tử như protein, DNA hay RNA. Và các phân tử
này phải được chuyển về dạng tinh thể. Lí do sử dụng tia X là vì ta không thể nhìn
thấy chi tiết một vật nhỏ hơn nửa bước sóng đang sử dụng. Mà kích thước nguyên tử
quá nhỏ, nên phải dùng tia X vì có bước sóng đủ ngắn để thấy được chi tiết nguyên
tử. Tuy nhiên, năng lượng sóng thì tỉ lệ nghịch với bước sóng, nghĩa là bước sóng
càng ngắn thì năng lượng càng cao, càng dễ phá hỏng mẫu phân tử sinh học. Đó là lí
do mà phải chuyển về dạng tinh thể để giảm sự phá hoại của tia X. Tuy nhiên việc
8
9
phá hoại của tia X là vẫn không thể tránh khỏi, kết quả thu được cần được xem xét
kỹ.
2.2.2 Cộng hưởng từ hạt nhân ( NMR )
Công nghệ mới này không những cung cấp thông tin về cấu trúc không gian ba chiều
của các phân tử sinh học mà còn cho biết đặc điểm nhiệt động học và từ tính của nó.
Điều nay cho thấy đây là một công cụ quan trọng cho phép đi sâu tìm hiểu chức năng
của các phân tử sinh học ở mức độ phân giải cỡ các nguyên tử trong tương lai.

Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một kỹ thuật quang phổ được sử dụng rộng rãi. Sự
đa dạng tuyệt vời của quang phổ cho phép xác định cấu trúc ba chiều của các
protein. Phần dưới sẽ cung cấp một cái nhìn tổng quan về các khái niệm lý thuyết trong
phương pháp NMR cũng như giới thiệu các bước xác định cấu trúc của một protein
bằng phương pháp này
3. Nghiên cứu về chức năng của protein
3.1. Hệ protein học (proteomics)
Việc phát triển của các kỹ thuật giải mã trình tự ADN, kết hợp với các phương pháp
tách chiết, tinh sạch và phân tích trình tự protein đã mở đường cho sự hình thành một
chuyên ngành mới gọi là hệ protein học. Proteomics là chuyên ngành nghiên cứu về
toàn bộ tập hợp protein được một mô, tế bào hoặc cơ thể tạo ra trong các điều kiện đặc
thù, phân tích mức độ phổ biến của từng protein và sự tương tác của chúng với nhau và
với các phân tử khác (ví dụ như ADN) trong quá trình hoạt động của tế bào. Nếu như
các kỹ thuật phân tích vi dãy phản ứng (microarray) có thể giúp nhận biết được sự biểu
hiện của các gen trên cở sở phân tích hệ gen, thì các kỹ thuật proteomics cho phép xác
định được hình ảnh tổng thể về toàn bộ vốn protein của một tế bào, mô hoặc cơ thể.Hệ
protein học được dựa trên ba phương pháp cơ bản: điện di hai chiều trên gel
polyacrylamid để tiến hành phân tách các protein, khối phổ để xác định khối lượng
phân tử và định tính protein (hoặc các đoạn peptit từ phân tử protein đó), và tin sinh học
9
10
để đối chiếu các phân tử protein và các đoạn peptit với các trình tự mã hóa của chúng
trong hệ gen. Một tế bào riêng lẻ thường ít nhất tạo ra hàng nghìn loại protein khác
nhau, trong khi việc sử dụng đơn lẻ phương pháp điện di truyền thống trên gel
polyacrylamid thường không đủ để phân lập và tách biệt các protein này. Vì vậy, như
tên gọi của nó, phương pháp điện di hai chiều cho phép phân tách các phân tử protein
trên gel điện di theo hai chiều được thực hiện kế tiếp nhau.
Trong bước thứ nhất, các phân tử protein được phân đoạn dựa trên điểm đẳng điện của
chúng (theo nguyên tắc hội tụ đẳng điện). Theo nguyên tắc này, khi một gradient pH
được tạo ra từ đầu này đến đầu kia của bản điện di, thì tại vị trí pH tương ứng làm trung

hòa điện tích của một phân tử protein sẽ làm các phân tử protein tập trung (hội tụ) tại vị
trí đó. Trong bước thứ hai, các phân tử protein tại điểm hội tụ được tiếp tục phân tách
trên cơ sở khối lượng và kích thước của chúng khi di chuyển trên trường điện di
polyacrylamid đã được gây biến tính bởi SDS như mô tả ở trên. Do các phân tử protein
được đồng thời phân tách dựa trên hai thuộc tính (điểm đẳng điện và trọng lượng phân
tử), nên hàng nghìn loại protein khác nhau có thể được phân tách khỏi nhau trong một
thí nghiệm duy nhất. Sau khi được phân đoạn theo phương pháp điện di hai chiều, mỗi
loại protein riêng biệt sẽ được đưa vào phân tích khối phổ để xác định chính xác khối
lượng phân tử. Như đã nói ở trên, để tăng hiệu quả phân tích, thông thường protein
được cắt thành các đoạn peptit nhỏ nhờ sử dụng protease thay cho việc phân tích phân
tử protein ở dạng nguyên vẹn có phân tử lượng lớn và cấu trúc phức tạp. Kỹ thuật phân
tích MS /MS cho phép giải trình tự chi tiết của các đoạn peptit và xác định phân tử
protein.
Cuối cùng các dữ liệu về trình tự hệ gen hoàn chỉnh của một cơ thể và các trình tự
peptit từ các loại protein được quan tâm nghiên cứu sẽ được đưa vào phân tích bằng các
phần mềm sinh tin học để có thể xác định được một trình tự mã hóa đặc thù trong hệ
gen tương ứng với loại protein có chức năng được quan tâm nghiên cứu. Như vậy, các
nghiên cứu hệ gen học (genomics) và hệ protein học (proteomics) có mối quan hệ chặt
chẽ trong các nghiên cứu di truyền học phân tử.
10
11
3.1.1. điện di hai chiều trên gel polyacrylamid
Điện di trên gel polyacrylamide để tách các protein có kích thước khác nhau
Polyacrylamide có khe hở giữa các phân tử nhỏ hơn agarose và do đó phù hợp cho
protein, bởi vì đây là những thường nhỏ hơn các phân tử DNA. Khi một điện
trườngđược áp dụng cho một mẫu protein, những người có kích thước nhỏ hơn có
thể đi vòng quanh khe hở của acrylamide dễ dàng hơn và sẽ di chuyển ra khỏi cực
âm nhanh hơn protein lớn hơn.
Hình 9.1 Gel Polyacrylamide SDS điện di Một khi một protein đã được đun sôi
trong SDS, nó được tích điện âm. Tổng số đoạn tương quan với kích thước của

protein. Sau khi được nạp vào một mẫu tốt của một loại gel polyacrylamide, các
protein di chuyển đi từ cực âm và về phía cực dương. Khả năng sàng lọc của gel cho
phép các protein nhỏ hơn để di chuyển nhanh hơn so với lớn hơn. Quãng đường đi
trong một thời gian nhất định là tỷ lệ thuận với khối lượng của các phân tử.
Điện di gel polyacrylamine hai chiều
11
12
Các protein được tách ra nhờ đi qua một ống gel polyacrylamine theo gradient nồng
độ pH từ 3 đến 10, nó di chuyển đến khi bị vô hiệu hóa, sau đó lấy ống gel ra và xử
lí bằng SDS, các protein được tách theo kích thước, và chúng di chuyển từ âm sang
dương, mảnh nào có khối lượng nhỏ, chạy xa hơn những protein có khối lượng lớn
Tóm lại phương pháp điện di gel polyacrylamine dùng để phân tách các protein có
khối lượng khác nhau.
3.2.phương pháp khối phổ
3.2.1. phương pháp khối phổ kế tiếp
Phương pháp khối phổ kế tiếp (MS/MS) có thể được dùng để xác định các vùng
trình tự protein khác nhau. Khối phổ là phương pháp xác định chính xác khối lượng
của các các phân tử nhỏ. Một cách vắn tắt phương pháp này được mô tả như sau:
phân tử cần phân tích được cho bay qua một thiết bị (trong điều kiện chân không)
trong điều kiện tốc độ di chuyển của nó tương quan với tỉ số khối lượng / điện tích.
Trên cơ sở này người ta có thể đo được thời gian bay của phân tử và xác định được
12
13
khối lượng của nó. Đối với các phân tử sinh học có kích thước nhỏ như các chuỗi
peptit và các phân tử protein nhỏ, thì trọng lượng phân tử của nó có thể xác định
chính xác đến từng Dalton.
Để xác định khối lượng phân tử protein bằng phương pháp MS /MS, trước tiên
phân tử protein thường được cắt thành các đoạn peptit có trình tự ngắn (thường dưới
20 axit amin) nhờ sử dụng enzym đặc hiệu, chẳng hạn như trypsin. Hỗn hợp các
đoạn peptit này sau đó được đưa vào phân tích khối phổ và chúng phân tách nhau ra

dựa trên tỉ số khối lượng / điện tích. Các đoạn peptit riêng rẽ sau đó sẽ bị bắt giữ và
phân đoạn thành các chuỗi peptit thành phần. Khối lượng của mỗi peptit thành phần
được xác định bằng phổ khối như minh họa trên hình 15. Sự kết hợp các dữ liệu về
khối lượng của các đoạn peptit thành phần sẽ cho biết trình tự rõ ràng của phân tử
protein ban đầu. Cũng giống như trong phương pháp biến tính
dman, việc xác định được trình tự của của khoảng 15 axit amin là đủ để so sánh với
trình tự protein được luận ra từ các trình tự ADN đã được giải mã.
13
14
Kỹ thuật MS /MS thực sự là một kỹ thuật có tính cách mạng trong việc xác định và
giải trình tự protein. Trong phương pháp này, thông thường chỉ cần một lượng mẫu
nhỏ và hơn hết là có thể phân tích hỗn hợp nhiều loại protein đồng thời.
4.2.2. Khối phổ ion hóa bằng tia điện
Máy dò kết hợp tồn tại có thể sử dụng cả hai TOF và bẫy ion tứ cực. Lợi thế mà ESI
hơn MALDI là các protein được phân lập từ HPLC không yêu cầu chuẩn bị đặc biệt
và có thể được sử dụng trực tiếp. Những bất lợi của ESI là khối lượng tối đa khoảng
5000. Việc sử dụng quang phổ khối lượng sẽ trở nên phổ biến như các kỹ thuật cải
tiến. Ví dụ, surface-enhanced laser desorption-ionization (SELDI) khối phổ lấy
các mẫu chất lỏng và ion hóa các protein mà tuân theo một thanh kim loại được điều
trị. Kỹ thuật này cho thấy nhiều hứa hẹn cho các chất dịch cơ thể như máu và nó
14
15
được kỳ vọng, sẽ giúp trong việc xác định một hồ sơ các protein đặc biệt cho các
nhóm bệnh khác nhau. Có lẽ một ngày bệnh nhân sẽ được chẩn đoán mắc bệnh ung
thư trước khi phát hiện có bất kỳ triệu chứng nào. Một sự thay đổi trong hồ sơ
protein trong máu của họ có thể thông báo các tế bào ung thư đang hình thành.
MALDI và ESI là đủ nhạy để phát hiện những thay đổi trong các protein do để
glycosyl hóa, phosphoryl hóa, …. Kỹ thuật này có thể xác định amino acid được sửa
đổi chỉ cần có một ion cụ thể bị thay đổi.
Giả trình tự peptid sử dụng khối phổ

Xác định các chuỗi peptide của một peptide ngắn là dễ dàng đạt được bằng cách sử
dụng các kỹ thuật quang phổ khối lượng hiện tại. Xác định trình tự toàn bộ của một
protein là quá phức tạp vào thời điểm này, nhưng một ngày nào đó có thể là khả thi.
Để xác định trình tự, một mẫu protein tinh khiết phải được lấy hoặc cắt một vị trí từ
một loại gel hai chiều hoặc bằng cách thanh lọc HPLC. Protein này sau đó được
phân hủy thành những mảnh bằng cách sử dụng một protease như trypsin, mà cắt
protein ở phía bên đầu cuối của carboxy-arginine và lysine. Cắt một protein thành
các peptide giúp làm giảm các đặc tính không mong muốn của toàn bộ protein Ví
dụ, các protein màng tế bào kỵ nước và dính lại với nhau, và phân giả thành các
mảnh peptide phá hủy đặc tính này. Vấn đề tính hòa tan có thể cũng thường được
giải quyết bằng cách tiêu hóa một protein thành các peptide. Xác định trình tự của
các peptide sẽ mang lại trình tự của protein ban đầu.
Phương pháp phổ biến nhất xác định các chuỗi peptide bắt đầu bằng cách tách các
peptide bằng cách sử dụng một cột HPLC gắn trực tiếp vào máy quang phổ khối
lượng. Cột là một ống mao dẫn siêu nhỏ để giữ thể tích mẫu càng nhỏ càng tốt. Pha
động một dung môi hữu cơ tách các peptide theo thứ tự kỵ nước của chúng. Từ ống
ống mao dẫn HPLC, các mẫu nhập vào buồng khối phổ kế. Mỗi peptid được ion hóa
thành nhiều mảnh. Đối với các peptide, các ion thông thường bao gồm một hình thức
nhân đôi proton hóa (M+2H)+2 , M là khối lượng của peptide và H + là khối lượng
của proton. Các đỉnh ion được vẽ so với khối lượng để tính tỷ lệ hoặc m / z. Đối với
15
16
các ion peptide nhân đôi proton hóa, điều này sẽ là khối lượng của ion chia cho 2. Ví
dụ, nếu các peptide ban đầu là 1232,55 dalton, ion proton hóa đôi sẽ có một khối
lượng của 1232,55 dalton + (2 × 1,0073) cho lượng hydro bổ sung . đỉnh cao sẽ xuất
hiện tại 617,2828.
(Lưu ý: khối lượng để tính tỷ lệ là nơi đỉnh cao được vẽ, có nghĩa là, khối lượng cho
ion này là 1234,5646 và phí là +2 đỉnh xuất hiện tại m / z hoặc 1234,5646 / 2. Khi
phổ kế khối tách ion peptide, bước đầu tiên là để xác định trạng thái điện tích ion.
Thường là một cụm các đỉnh xảy ra cho mỗi ion peptide

2. Để xác định trình tự peptide, hai vòng của khối phổ được sử dụng Này được gọi là
cùng khối phổ bởi vì ion là một trong những sản xuất trong vòng đầu tiên của khối
phổ. sau đó ion được phân mảnh bởi va chạm với một khí như hydro, argon, hoặc
heli. Như trước đây, các mảnh vỡ ion được phân cách dựa vào khối lượng của chúng
để tính tỷ lệ. Mỗi đỉnh thường thay đổi bởi một amino axit, và sự khác biệt kích
thước giữa các đỉnh núi xác định. chuỗi axit amin.Đôi khi quang phổ thu được cho
một ion peptide là mơ hồ, cơ sở dữ liệu như vậy của quang phổ ion peptide được sử
dụng để so sánh.
16
17
4.2.3 Xác định trình tự peptide bằng phương pháp khối phổ
Xác định trình tự peptide của chuỗi peptide ngắn dễ dàng thực hiện nhờ các kỹ
thuật quang phổ khối lượng hiện tại.( hình 9.12). tuy nhiên để xác định toàn bộ trình tự
peptide của một protein là hết sức khó khăn. Để xác định trình tự một mẫu protein tinh
khiết phải được lấy bằng cách cắt một điểm trên gel hai chiều hoặc lọc HPLC. Protein
này sau đó được phân thành các mảnh nhỏ hơn nhờ protease như trypsin , mà cắt
protein ở phía bên đầu cuối của carboxy-arginine và lysine
17
18
Cắt một protein thành các peptide giúp làm giảm các đặc tính không mong muốn của
toàn bộ protein Ví dụ, các protein màng tế bào kỵ nước và dính lại với nhau, và phân
giả thành các mảnh peptide phá hủy đặc tính này. Vấn đề tính hòa tan có thể cũng
thường được giải quyết bằng cách tiêu hóa một protein thành các peptide. Xác định
trình tự của các peptide sẽ mang lại trình tự của protein ban đầu.
Phương pháp phổ biến nhất xác định các chuỗi peptide bắt đầu bằng cách tách các
peptide bằng cách sử dụng một cột HPLC gắn trực tiếp vào máy quang phổ khối lượng.
18
19
Cột là một ống mao dẫn siêu nhỏ để giữ thể tích mẫu càng nhỏ càng tốt. Pha động một
dung môi hữu cơ tách các peptide theo thứ tự kỵ nước của chúng. Từ ống ống mao dẫn

HPLC, các mẫu nhập vào buồng khối phổ kế. Mỗi peptid được ion hóa thành nhiều
mảnh.
Đối với các peptide, các ion thông thường bao gồm một hình thức nhân đôi proton hóa
(M+2H)+2 , M là khối lượng của peptide và H + là khối lượng của proton. Các đỉnh ion
được vẽ so với khối lượng để tính tỷ lệ hoặc m / z. Đối với các ion peptide nhân đôi
proton hóa, điều này sẽ là khối lượng của ion chia cho 2. Ví dụ, nếu các peptide ban đầu
là 1232,55 dalton, ion proton hóa đôi sẽ có một khối lượng của 1232,55 dalton + (2×
1,0073) cho lượng hydro bổ sung . đỉnh cao sẽ xuất hiện tại 617,2828. (Lưu ý: khối
lượng để tính tỷ lệ là nơi đỉnh cao được vẽ, có nghĩa là, khối lượng cho ion này là
1234,5646 và phí là +2 đỉnh xuất hiện tại m / z hoặc 1234,5646 / 2. Khi phổ kế khối
tách ion peptide, bước đầu tiên là để xác định trạng thái điện tích ion. Thường là một
cụm các đỉnh xảy ra cho mỗi ion peptide.Nếu đỉnh là 1 dalton thì trạng thái tích điện
của peptide là 1. Nếu đỉnh là 0,5 dalton thì trạng thái tích điện là 2.Để xác định trình tự
peptide, hai vòng của khối phổ được sử dụng Này được gọi là cùng khối phổ bởi vì ion
là một trong những sản xuất trong vòng đầu tiên của khối phổ. sau đó ion được phân
mảnh bởi va chạm với một khí như hydro, argon, hoặc heli. Như trước đây, các mảnh
vỡ ion được phân cách dựa vào khối lượng của chúng để tính tỷ lệ. Mỗi đỉnh thường
thay đổi bởi một amino axit, và sự khác biệt kích thước giữa các đỉnh núi xác định.
chuỗi axit amin.Đôi khi quang phổ thu được cho một ion peptide là mơ hồ, cơ sở dữ
liệu như vậy của quang phổ ion peptide được sử dụng để so sánh.
4.2.4. Định lượng protein bằng phương pháp khối phổ
Khối phổ có thể dùng để định lượng một lượng peptide cụ thể từ một lượng protein, mà
có tương quan trực tiếp với protein đó ( hình 9.14). để so sánh các số liệu tương đối của
protein thì ta phải tiến hành thí nghiệm các mẫu trong điều kiện khác nhau.
 Mẫu 1 trong điều kiện acid amin gắn đồng vị nặng Các đồng vị nặng thường là
deuterium, 2 H, nhưng cũng có thể là 13 C hoặc 15 N
 Mẫu 2 là các tế bào nuôi trong điều kiện bình thường
 Hai mẫu được trộn lẫn và phân tích bằng sắc ký lỏng ghép với khối lượng ESI
19
20

5.PROTEIN TAGGING SYSTEMS
Hệ thống gắn thẻ protein là những công cụ để phân lập và tinh sạch protein mục tiêu
duy nhất từ một hỗn hợp. Protein mục tiêu được hợp nhất về mặt di truyền với một đoạn
DNA mã hóa cho một"Tag", tạo ra một gen lai. Gen này được đưa vào một vector thích
hợp. Các cấu trúc gen được biến nạp vào một vật chủ thích hợp. Khi các tế bào đã
trưởng thành và bị phá vỡ để giải phóng các protein, protein mục tiêu có thể dễ dàng bị
cô lập vì tag của nó.Nhiều loại tag được sử dụng để cô lập protein vì bản chất hóa học
và kích thước của thẻ có thể ảnh hưởng không tốt đến các protein mục tiêu. Tag được
sử dụng rộng rãi đầu tiên là polyhistidine hoặc His6 bao gồm sáu loại histidine liên tiếp.
Histidine liên kết rất chặt chẽ với các ion niken nên ta gắn protein tinh khiết trên một
cột có chứa ion Ni2+. Khi gắn vào cột His6 protein được lấy ra bằng cách phá vỡ các
ion Ni2+.Vì His6 rất ngắn nên protein mục tiêu ít bị ảnh hưởng.Protein có thể được sản
xuất trong hai vi khuẩn hoặc một dòng tế bào. Protein có thể được phân lập từ một
lysate di động sử dụng các kháng thể liên kết với hạt hoặc gắn vào một cột.Chỉ có
protein gắn thẻ gắn vào hạt / cột là tách ra từ các kháng thể bằng cách thêm cờ peptide.
20
21
Ba loại tag phổ biến bao gồm protein A từ vi khuẩn Staphylococcus, glutathione-S-
transferase (GST) từ Schistosoma japonicum, và protein maltose liên kết (MBP)
từEscherichia coli. Một khi các tế bào chủ có chứa gen lai, protein dung hợp được cô
lập bởi làm sạch thẻ protein. Một kháng thể đặc hiệu có thể liên kết với protein A và
làm giảm độ pH dể tạo ra các phản ứng tổng hợp protein. MBP liên kết với maltose và
protein dung hợp được tạo ra bằng cách thêm maltose. GST liên kết với bề mặt
củaglutathione và glutathione được sử dụng để giải phóng protein. Sau khi phản ứng
tổng hợp protein đã được phân lập glutathione phải được cắt để tách các protein mục
tiêu từ các protein. Một tính năng hữu ích của các thẻ còn là sự hiện diện của protease
tại vị trí phân cắt giữa các protein mục tiêu và các protein gắn tag
4. Tương tác giữa protein với protein
4.1. The yeast two-hybrid system
21

22
Là kĩ thuật sinh học phân tử được dùng để khám phá các tương tác protein-
protein, và tương tác protein-DNA bằng cách kiểm tra tương tác vật lý giữa hai
protein hoặc một loại protein duy nhất và một phân tử DNA tương ứng
Đi tiên phong bởi Stanley Fields và Song vào năm 1989, kỹ thuật này đã được
thiết kế để phát hiện các tương tác protein-protein bằng cách sử dụng GAL4
phiên mã kích hoạt của nấm men Saccharomyces cerevisiae . Protein GAL4 kích
hoạt một loại protein liên quan trong việc sử dụng galactose, hình thành cơ sở lựa
chọn. Kể từ đó, cùng một nguyên tắc đã được điều chỉnh để mô tả nhiều phương
pháp thay thế bao gồm phát hiện tương tác protein-DNA, DNA-DNA và sử dụng
Escherichia coli thay vì nấm men
Ứng dụng:
22
23
 Xác định trình tự rất quan trọng cho sự tương tác
 Xác định chức năng của protein
Sự gắn kết của một kích hoạt phiên mã protein GAL4 để vùng promoter của gen
reporter kích hoạt phiên mã và dịch mã. DNA liên kết(DBD) với các yếu tố promoter
RNA polymerase, nơi nó kích hoạt phiên mã. Trong hệ thống hai-lai, các protein khác
nhau được tạo ra bằng cách lai gen mồi là DBD hợp nhất về mặt di truyền với
protein mục tiêu và mồi AD hợp nhất với protein đang được sàng lọc để tương tác với
mồi. Khi các DBD và AD liên kết với nhau thì chúng sẽ kích hoạt phiên mã của gen
reporter. Có hai vectơ là cần thiết để thực hiện phân tích hai-lai
Vector đầu tiên có một hoặc nhiều nguồn nhân bản cho các protein mồi 3 'của GAL4-
DBD. Vector thứ hai có một nguồn nhân bản cho protein Prey 5 'của GAL4-AD . Cả hai
plasmid phải được thể hiện trong cùng một tế bào nấm men. Các gen reporter phải được
thiết kế dưới sự kiểm soát của các trình tự nhận biết GAL4.Gen reporter thông thường
bao gồm HIS3 mã hóa cho một enzyme trong con đường histidine hoặc URA3.
Nguyên tắc Hai Lai
Phân tích (A) các yếu tố phiên mã men có 2 yếu tố: các DBD (màu tím) công nhận các

nguồn quy định trên DNA, và AD (màu đỏ) kích hoạt RNA polymerase bắt đầu phiên
mã của gen reporter. Để phân tích hai-lai, hai protein(Bait và Prey) được tổng hợp một
cách riêng biệt dựa trên yếu tố DBD và AD của các yếu tố phiên mã. (B) Các protein
Bait và protein Prey không tương tác và gen reporter không được hoạt hóa. (C) protein
Bait liên kết với Prey, mang yếu tố phiên mã nửa vời RNA polymerase được hoạt hóa
và gen reporter được biểu hiện.
Vectors Phân tích Hai Lai Có hai vector cần thiết cho phân tích hai-lai là: Vector mồi đã
mã hóa cho DBD và cho protein Bait. Vector Prey có mã vùng cho AD và cho protein
Prey. Hai cấu trúc khác nhau được thể hiện trong cùng tế bào nấm men. Nếu Bait và
Prey tương tác thì gen reporter được biểu hiện. Gen này mã hóa β-galactosidase, phân
cắt X-gal, tạo màu xanh. Một reporter sử dụng là lacZ từ E. coli, mã hóa β galactosidase
cả vi khuẩn và men lacZ nhanh chuyển sang màu xanh khi liên kết với X-Gal. Các hệ
thống men hai-lai đã được sử dụng để xác định tất cả các tương tác protein trong men
23
24
protein bởi kết hợp hàng loạt sàng lọc Men có khoảng 6000 protein khác nhau,và một
trong số này đã được gắn vào cả hai vectơ qua PCR.
4.2. Tương tác protein CO-IMMUNOPRECIPITATION
Co- immunoprecipitation là một kỹ thuật để kiểm tra các tương tác protein trong tế bào
chất chứ không phải trong nhân. Protein mục tiêu được kết tủa từ các lysate với một
kháng thể. Gel sẽ hiển thị protein mục tiêu, các kháng thể, protein A Co-
immunoprecipitation thường được sử dụng để xác nhận các kết quả từ men hai-lai phân
tích, đặc biệt là protein động vật có vú. Các lysate tế bào được thu và chia vào hai mẫu.
Một phức hợp protein được phân lập từ các mẫu đầu tiên, trong khi đó phức hợp protein
24
25
B được phân lập từ mẫu thứ hai Các protein khác nhau từ mỗi mẫu được phân cách bởi
SDS-PAGE. Nếu hai protein tương tác, cả hai protein sẽ được tìm thấy trong cả hai
mẫu. Co- immunoprecipitation xác định xem hai protein có kết hợp với nhau trong tế
bào chất.

Định tính protein dựa trên phương pháp thẩm tách miễn dịch (immunoblotting)
Mặc dù có bản chất khác ADN và ARN, việc xác định sự có mặt của một loại
protein trong số các protein có trong mẫu sinh học theo nguyên tắc gần giống với
các phương pháp thẩm tách (còn gọi là lai) Southern và Northern (tương ứng với
trường hợp của ADN và ARN). Tuy vậy, đối với protein, phương này định tính
này dựa trên dựa trên nguyên tắc miễn dịch đặc thù của protein nên còn được gọi
là phương pháp thẩm tách miễn dịch (immunoblotting) hay phương pháp thẩm
tách (lai) Western. Trong phương pháp thẩm tách miễn dịch, các phân tử protein
sau khi được phân tách trên điện di được chuyển và gắn lên màng. Màng này sau
đó được ủ trong một dung dịch chứa kháng thể đặc hiệu với loại protein tinh sạch
được quan tâm nghiên cứu. Kháng thể sẽ tìm thấy loại protein tương ứng ở trên
màng lọc và gắn vào. Cuối cùng, bằng việc sử dụng phản ứng enzym hiện màu,
người ta có thể quan sát được vị trí kháng thể liên kết trên màng. Như vậy, tất cả
các phương pháp lai Southern, Northern và Western đều có điểm chung là sử
dụng các hợp chất chọn lọc để quan sát sự có mặt của một hoặc một số loại phân
tử đặc thù trong các hỗn hợp phức tạp.
5. Protein array
Giống như phương pháp ELISA, phương pháp này sử dụng kháng thể với các protein
khác nhau gắn vào bề mặt vật rắn. các mẫu thử nghiệm được phân lập và đánh dấu bằng
huỳnh quang.
Tiến hành trong hai điều kiện:
 Mẫu 1 dán nhãn với Cy3, phát huỳnh quang màu xanh lá cây
 Mẫu 2 dán nhãn với Cy5, phát huỳnh quang màu đỏ
25

×