công nghệ sản xuất enzyme amylase

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
TRƯỜNG CAO ĐẲNG LƯƠNG THỰC - THỰC PHẨM
KHOA CÔNG NGHỆ LƯƠNG THỰC - THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN CHUYÊN MÔN 1
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
GVHD : Lê Thị Thảo Tiên
SVTH : Hồ Thị Huyền
Trân
Lớp : 08S3
Đà Nẵng , Tháng 7, Năm 2010
MỤC LỤC
Lời nói đầu
Phần 1 : Tổng quan về enzyme amylase
1.1 Lịch sử phát triển enzyme
1.2 Amylase là gì ?
1.3 Giới thiệu chung về hệ enzyme amylase
1.3.1 Định nghĩa
1.3.2 Phân loại
1.4 Đặc tính và cơ chế áp dụng enzyme α- amylase
1.4.1 Cơ chế tác dụng của enzyme α- amylase
1.4.2 Cơ chế tác dụng của enzyme α-amylase
Phần 2 : Phân lập, bảo quản giống VSV – Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
2.1 Vai trò của giống trong công nghệ enzym
2.2 Yêu cầu giống VSV trong công nghệ enzyme
2.3 Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
2.4 Quá trình phân lập giống VSV
2.4.1 Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
2.4.2 Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
2.4.3 Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
2.5 Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae

2.6 Phương pháp bảo quản giống VSV
2.6.1 Cấy truyền và bảo quản lạnh
2.6.2 Bảo quản giống trong đất hay trong cát
2.6.3 Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc
Phần 3 : Công nghệ lên men tạo enzyme α- amylase
3.1 Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt
3.1.1 Môi trường lỏng
3.1.2 Qui trình sản xuất nấm mốc giống
3.1.2.1 Nguyên liệu
3.1.2.2 Chuẩn bị mốc giống
3.1.2.3 Qui trình sản xuất
3.2 Qui trình lên men công nghiệp tạo enzyme α- amylase
3.2.1 Nguyên liệu
3.2.1 Qui trình công nghệ
3.2.3 Thu nhận enzyme α- amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae
Phần 4 : ứng dụng và kết luận
4.1 Ứng dụng
* Ứng dụng emzyme α- amylase trong công nghiệp thực phẩm
4.1.1 Ứng dụng emzyme α- amylase trong công nghiệp sản xuất mì chính
4.1.2 Ứng dụng emzyme α- amylase trong công nghiệp sản xuất bia
4.1.3 Ứng dụng emzyme α- amylase trong công nghiệp sản xuất cồn
4.1.4 Ứng dụng emzyme α- amylase trong công nghiệp sản xuất siro
4.1.5 Ứng dụng emzyme α- amylase trong công nghiệp sản xuất bánh mì
4.1.6 Ứng dụng emzyme α- amylase trong công nghiệp sản xuất glucoza và
mật
4.2 Kết luận
Phần 5 : Phụ lục
Tài liệu tham khảo

Lời Nói Đầu

Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật
và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai
tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột
chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh
bột về các đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta
sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid
hữu cơ, amino acid,….
Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá và
giai đoạn đường hoá. Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên, trong thực tế sản
xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ phân tinh bột bằng acid và bằng enzyme. Để thuỷ
phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl và H
2
SO
4
. Nhưng kết quả
cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không
mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và
ứng dụng enzym để thuỷ phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển.
Enzym amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công
nghiệp chế biến thực phẩm. Enzym amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau
như amylase từ thực vật, động vật và VSV. Amylase càng ngày càng được thay thế acid
trong sản xuất ở qui mô công nghiệp. Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase
có khả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được tách chiết
từ VSV, cụ thể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng.
Ngoài ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột:
Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá
trình tinh sạch dịch đường.
Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt), hạt bắp nảy mầm,
hay từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắp, khoai mì,… đây là những
nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nước ta. Do đó, đây là một lợi

thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển. Ví dụ: sản
xuất bánh kẹo, bia, cồn, sirô và làm mềm vải,…
Phần 1 : TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE
1.1 . Lịch sử phát hiện enzyme:
( /> Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá trình lên
men.
Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của mầm đại
mạch có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ thường.
Đây là công trình đầu tiên thu được chế phẩm ở dạng dung dịch và lịch sử enzyme
học thực sự được xem như bắt đầu từ đây.
Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Pessoz
đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng
bột.
Thí nghiệm được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết của lúa đại mạch
nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa.
Kết tủa được hình thành này có khả năng chuyển hóa tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ
mất tác dụng chuyển hóa. Danh từ diastase (từ chữ Latinh diastasis - phân cắt) là do
Payen và Persoz dùng để gọi enzyme lúc bấy giờ.
1.2 . Amylase là gì ?
( />Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các enzyme này
thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm
polysaccharide với sự tham gia của nước:
R.R’ + H-OH  RH + R’OH
Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( enzyme nội bào) và
exoamylase (enzyme ngoại bào ).
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử
nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase ( hay α-dextrin 6 –
glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và amylo1,6-
glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.
Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân

tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
 Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:
• Tinh bột: là nhóm Carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ như khoai
lang, khoai tây, khoai mì… , trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát
là (C
6
H
12
O
6
)
n
. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylase và
amylopectin ( Meyer, 1940 ). Các loại tinh bột đều có 20-30% amylase và 70-80%
amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng.
-Amylase có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da, được cấu tạo từ 200-1000
phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch xoắn dài
không phân nhánh.
-Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da, được cấu
tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-
glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi
hỗn dịch tinh bột bị đun nóng ( 60-85
0
C ) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh
bột. Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside
bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: Dịch hóa
và đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi
dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose.
- Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng cho cơ
thể con người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và tinh bột này một phần đã

được chuyển hóa thành disaccharide và glucose. Carbohydrate có mặt trong hầu hết các
loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là đường và tinh bột.
• Glycogen: là một loại Cabohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ trong cơ thể
động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng
trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, VSV, glucogen được cấu tạo từ các
glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glycoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối
với nhau bằng liên kết α-1,6-glycoside. Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử
lượng ở trong khoảng 2 triệu-3 triệu Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta
ăn quá nhiều Carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự
trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan.
1.3 Giới thiệu chung về hệ enzyme amylase
( />1.3.1 Định Nghĩa :
- Enzyme amylase là một loại enzyme có ý nghĩa về mặt sinh lý, thương mại và lịch sử
còn gọi là diastase.
- Enzyme có cả ở thực vật lẫn động vật
- Enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải liên kết glucoside
nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước.
3.1.2 Phân loại:
Gồm 4 loại chính sau:
a) α -amylase (α - 1,4 glucan 4 – glucanhydrolase)
Amylase có khả năng phân cắt các liên kết 1,4 – glucoside của cơ chất một cách ngẫu
nhiên và là enzyme nội bào. α - amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà
còn có khả năng phân hủy các hạt tinh bột nguyên vẹn.
b) β - amylase (β - 1,4 glucan 4 – maltohydrolase)
- β - amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết 1,4 glucan trong tinh bột, glucogen và
polysacsccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch. Maltase được
hình thành do sự xúc tác của β - amylase có cấu hình β .
c)γ - amylase (glucoamylase hay – 1,4 – glucan – glucohydrolase)
- glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết – 1,4 lẫn – 1,6 glucoside, ngoài ra còn có
khả năng thủy phân các liên kết – 1,2 và 1,3 glucoside.

- Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen. amylopectin,
dextrin thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại amylase khác.
d) Oligo-1,6-glucosidese hay dextrinnase tới hạn ( dextrin-6-glucanhydrolase)
- Enzyme này thủy phân liên kết β-1,6. glucoside trong isomaltosse, panose và các
dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được.
- Ngoài ra các loại enzyme amylase sau sẽ thủy phân liên kết α-1,6 glucozit trong
polisaccharit và các dextrin cuối:
 Dextrin-6-glucanhidrolase
 Amylopectin-6- glucanhidrolase
 Oligodexxtrin-6- glucanhidrolase hay dextrinnase
1.4 Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym α-amylase
1.4.1 Đặc tính của enzym α-amylase [1]
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-
amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine,
tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼
tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme:
- α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.
- Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir
1956;Fisher,Stein, 1960 ).
- Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.
- Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.
- Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 ).
- α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30
nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự
hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme
( Modolova, 1965 ). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác
động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu
phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ
chất. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến
hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg

2+
. Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi
các kim loại nặng như Cu
2+
, Ag
+
, Hg
2+
. Một số kim loại như :Li
+
, Na
+
, Cr
3+
, Mn
2+
, Zn
2+
,
Co
2+
, Sn
2+
, Cr
3+,
không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase.
Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau ( g/100g
protein ): alamine=6,8 ; glycine= 6,6; valine= 6,9, leucine= 8,3; Isoleucine= 5,2; prolin=
4,2, phenylalanine= 4,2; tyrosine=9,5; trytophan= 4,0; xetin= 6,5; trionin= 10,7, cystein +
cystine= 1,6; glutamic acid= 6,9; amide= 1,5 ( Akabori et amiloza, 1954 ). Không giống

các α-amylase khác, amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide.
Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên 1 mol enzyme
(Akabori et amiloza, 1965 ). Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng
nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử
enzyme.
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn.
Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và maltose. Đối với nấm sợi tỉ lệ
là 1:3,79 (Hanrahan, Caldwell, 1953 ). Fenikxova và Eromsina (1991) cho biết rằng các
maltopentose và maltohexose bị thủy phân theo sơ đồ sau:
G5 G4+G1; G6 G2 + G4 hay 2G3 ( chính ) hoặc G5 + G1 ( ít )
1.4.2 Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase
( />α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase). α-amylase từ các nguồn khác nhau có
nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside
nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên,
không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy
phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc đột rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn.
+ Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ):Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy
phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột
giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ).
+ Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị
thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị
thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác
dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc
glucose (vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7
gốc glucopiranose).
+ Sau đó, các poliglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose
colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và maltose.
Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và
87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì

không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử
amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói
trên ( 72% maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose,
maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy
phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít
maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy,
người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase:
+ Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp
+ Giai đoạn đường hóa:
Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide
Amylase oligosacharide poliglucose
Maltose maltotriose maltotetrose

Phần 2
Phân lập, bảo quản giống VSV
Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae

Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường. Quá trình
này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp. Bản chất của 2 quá
trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức và phương diện thì khác nhau
hoàn toàn.
Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn của VSV. Tự
tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên. Các VSV và vật
chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp, không đồng đều về chủng loại
và về số lượng. Mặt khác, quá trình lên men này không được kiểm soát, bao gồm nhiều
pha và không định hướng. Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn định; do dó, chất
lượng sản phẩm kém không đồng nhất.

Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập giống
VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quá trình thu nhận,
tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn ( Sản phẩm tạo ra mang tính định
hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV cho đến cuối quá trình thu nhận
sản phẩm). Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện .
2.1 Vai trò của giống trong công nghệ enzyme
Trong công nghệ sản xuất enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:
- Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy
- Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hay là hoạt tính
enzyme)
- Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất
- Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm
Như vậy, giống VSV có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ VSV
2.2 Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản
xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ enzyme cần
phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là:
- Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải có số
lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình trao đổi chất, để
chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ thể mình trong
một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV cần tổng hợp nhiều chất. Do đó, sản
phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác. Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một
sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và
chất lượng.
- Giống phải cho năng suất sinh học cao.
- Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện
sản xuất công nghiệp.
- Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa
phương nơi nhà máy đang hoạt động.
- Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV thuần

khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
- Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn; dễ dàng tách sản
phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống.
- Giống phải ổn định trong bảo quản và dể dàng bảo quản.
 Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên men công
nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết.
2.3 Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
( />Hình 1: Condium of Aspergillus oryzae

Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang
khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều
ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào
( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là
cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.oryzae
thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử
phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là
những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào
nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng
hoa cau…
Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào
( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các
thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở
lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen
,vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi
vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới.

2.4 Quá trình phân lập giống VSV
VSV phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường đến nơi có địa
thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt VSV.Ở những nơi giàu chất hữu cơ, những nơi nghèo
chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ thế người, động vật, nơi có

nhiệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhiệt độ cao. VSV có khả năng thích nghi trong
mọi hoàn cảnh môi trường. Chính nhờ khả năng tuyệt vời này mà VSV có khả năng tồn
tại ngay cả trong hoàn cảnh khắc nghiệt nhất.
Thông thường để phân lập một giống chủng VSV để thu nhận enzyme thì có 3
cách phân lập:
+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
+ Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
+ Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập cho
phù hợp nhất. Mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng biệt. Sau đây là
1 số ưu điểm:
2.4.1 Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
-Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh được thì cần
phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển hóa nhanh cơ chất có
trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào. Điều này thì không thích hợp cho
việc sinh tổng hợp enzyme ( ở quy mô sản xuất công nghiệp ) với một loại enzyme thật
sự mạnh.
-Do phát triển trong điều kiện tự nhiên, VSV phải cùng lúc đối phó với hàng loạt
các yếu tố ngoại cảnh và phải phân giải rất nhiều loại cơ chất khác nên VSV bắt buộc
phải tổng hợp nhiều loại enzyme với một nỗ lực rất lớn.
-Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt
đáng kể các giống VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự nhiên,
được gọi chung là các chủng VSV hoang dại. Chúng đã quá quen thuộc với sự thay đổi
thất thường của điều kiện tự nhiên. Khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công
nghiệp với nhiều điều kiện môi trường cố định, đòi hỏi các loài VSV giống phải có một
thời gian thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp. Huấn luyện chúng thích nghi với
điều kiện sản xuất công nghiệp là điều rất cần thiết.
-Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập
trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa và đặc điểm này để chúng ta
có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV sinh tổng hợp enzyme mà ta cần.

Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp protease cao, ta phải
tìm nơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập VSV có khả năng
sinh tổng hợp amylase ta cần phải tìm nơi có chứ nhiều tinh bột trong tự nhiên.
-Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài VSV, VSV trong
điều kiện tự nhiên luôn xảy ra những thường biến và đột biến. Những đột biến thường
cho ra hai hiệu ứng: Thứ nhất gây cho cá thể chết; thứ hai là nhiều đột biến tạo ra loài
mới có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất cao. Việc tìm ra những đột biến kiểu này thì
hết sức có ý nghĩa và rất cần tiến hành. Và một lợi điểm nữa là, những đột biến có lợi
kiểu này thường rất bền vững. Rất thích hợp để đưa vào sản xuất ở qui mô công nghiệp.
2.4.2 Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
-Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều
kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua giai đoạn sản xuất
thử, thí nghiệm.
-Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã được
chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hoá hơn hẳn các
giống vi sinh vật hoang dại.
-Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men, dịch nước
thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả năng thu nhận được
những chủng có bản năng sinh tổng hợp cao thường rất cao.
2.4.3 Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có thể rất
nhiều tế bào VSV giống bị thoái hoá, nhưng cũng còn nhiều tế bào không bị thoái hoá.
Việc phân lập lại từ nguồn giống này nhiều khi lại đạt được những kết quả tốt.
2.5 Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae
( />Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase. Ở
nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase này là
tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ cung cấp
nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất
chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có
thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới

tại phòng thí nghiệm.
Quá trình lấy mẫu: Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát
đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rủ sạch
cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao nyclon và mang về phòng
thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm phân lập:
Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây
Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô
trùng sau đó đảo trộn mẫu.
Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ông nghiệm khác
có chứa 90ml nước cất vô trùng.
Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10
-3
, 10
-4
ở những ống nghiệm tiếp theo.
Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm
mốc phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar).
Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ
phòng trong vòng 3 ngày.
Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện
những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc.
Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy. Có tác
dụng là chất chỉ thị cho tinh bột.
Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng
với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong máy làm
đông.
-Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ).
Đổ 10ml H
2

O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm.
Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù.
Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi
trường sinh trưởng của nấm.
Bảng 1:Môi trường sinh trưởng của nấm mốc Asp.Oryzae
KH
2
PO
4
1,4 MgSO
4
.7H2O 0,1
NH
4
NO
3
10 FeSO
4
.7H2O 0,01 PH = 6,5
KCl 0,5 Hồ tinh bột 20
Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi
Autoclave ở 121
0
C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem ủ ở 25
– 30
0
C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau khi nhân giống thành công có
thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ, để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống
ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp.
2.6 Phương pháp bảo quản giống vsv

Mục đích của bảo quản giống VSV dùng trong sản xuất enzym là đảm bảo tính ổn
định trong quá trình tổng hợp enzym và tính ổn định của hoạt tính enzym. Có các phương
pháp để thực hiện quá trình này như sau:
2.1.6 Cấy truyền và bảo quản lạnh
Phương pháp dựa trên nguyên tắt là VSV sẽ hạn chế quá trình trao đổi chất trong
điều kiện lạnh ở một khoảng thời gian nhất định. Trong thời gian này VSV có khả năng
bảo tồn được khả năng sinh tổng hợp enzym.
Cách thực hiện: Ống giống VSV được cấy truyền vào 3-5 ống nghiệm có môi
trường tối thiểu. Trong đó một ống dùng để kiểm tra, một ống dùng cho sản xuất hoặc
nghiên cứu và một ống dùng để bảo quản.Có thể làm thêm hai ống để tránh sai sót do
thao tác đối với những người mới bắt đầu làm công tác bảo quản giống.
Sau khi cấy truyền, ống giống cần được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ lạnh từ 4-7
0
C.
Sau thời gian định kỳ, sẽ phải cấy truyền trở lại, thao tác này được thực hiện liên tục.
2.6.2 Bảo quản giống trong đất hoặc trong cát
Phương pháp dựa trên nguyên tắt: Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm thấp, vsv
có bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzym trong thời gian dài. Phương pháp
này rất phù hợp và có hiệu quả đối với nấm mốc Asp. oryzae.
Trước khi sử dụng , đất, cát phải được làm sạch và sấy đến độ ẩm < 5%. Asp.
oryzae được nuôi cho đến khi tạo bào tử. Người ta trộn bào tử với đất hoặc cát đã được
làm sạch và sấy khô. Sau đó hỗn hợp này cho vào bao, hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ
thường.
2.6.3 Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc
Phương pháp dựa trên nguyên tắt bào tử nấm mốc được giữ trong hạt ngũ cốc đã
xử lý nhiệt có độ ẩm < 8% và giữ được khả năng sinh tổng hợp enzym trong một thời
gian dài.
Người ta thực hiện bảo quản giống trong hạt ngũ cốc như sau: Giống ống nấm
mốc được nuôi trong môi trường hạt ngũ cốc cho đến khi tạo nhiều bào tử. Bào tử cùng
thành phần môi trường được sấy khô ở nhiệt độ < 50

o
C cho đến khi độ ẩm < 8%, đưa vào
bao, hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường.


Phần 3
Công nghệ lên men tạo enzym α-amylase
3.1 Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt

Thiết kế công nghệ:Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường được
thực hiện theo phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không
chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh
và một số quá trình lên men truyền thống.
3.1.1 Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát triển
trên bề mặt môi trường. Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là:
- Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không phức tạp.
- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so
với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương
pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại.
- Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme
và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành
công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.
- Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường đặc là
môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu
vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những ưu điểm cần quan tâm để khắc phục
và hoàn thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là:
Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này VSV phát

triển trên bề mặt môi trường ( môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần
nhiều diện tích.
 Môi trường lỏng
Ở môi trườn lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc
ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) và pha khí ( không khí ). Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất
dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O
2
từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp
enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi
trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV.
Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề
mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều rộng và
chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác.
Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi
trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở
phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh
dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao.
Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong kháy nuôi cấy có
chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý.
 Môi trường đặc
Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme,
người ta thường sử dụng môi trường đặc . Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào
trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi
trường.
Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh
dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme
ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong
sinh khối VSV.
VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi
trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường

nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có
độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại , không khí không thể xâm
nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV
phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý.
Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme, người
ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí
dễ xâm nhập vào lòng môi trường. Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn(môi trường
đặc ) này rất thích hợp cho len men ở nấm mốc Asp.oryzae.
3.1.2 Qui trình sản xuất nấm mốc giống
3.1.2.1 Nguyên liệu cho sản xuất mốc giống
Gạo nếp:Nước 14% ,Glucid 79,4%, Lipid 1,5% và protein 8,2% trong đó Protein của
gạo nếp chủ yếu là glutein(oryzaine)và glubuline ngoài ra còn một ít lẫn Cozine và
Prolamin.
Glucid của gạo nếp chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose và hemicellulose.Trong tinh bột
chủ yếu là amylopectin.Ngoài ra còn chứa một số vitamin như B
1
,B
2
,B
6
,PP và E.
Gạo tẻ:Nước 13,84%; Glucid 77,55%; Protein 7,35%; Lipid 0,52%; cellulose 0,18% và
muối khoáng :0,54%.
Bột Mì:Nước 11,6%; Glucid 72%; Lipid 4,8%,Protein 9%; cellulose 1,5% và muối
khoáng 1,2%.
Bắp mảnh:Nước 11,4%; Glucid 78,9%; Lipid0,8%; Protein8,5%,cellulose 0,4% và
muối khoáng 0,4%.
3.1.2.2 Chuẩn bị mốc giống
Nuôi cấy giồng bao gồm:
-Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm

-Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ)
-Trên sàng, khay (nhân giống lớn)
 Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng
Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển
những mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác.Yêu cầu ống giống
phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một loài VSV nào
khác.Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng.
 Nuôi cấy giống trong bình tam giác
Cách làm môi trường trong bình tam giác:
Môi trường gạo:gạo tẻ loại tốt, nấu cơm như nấu bình thường, hạt cơm chín đều
không qúa nhão và không qúa khô.Độ ẩm khoảng 45% để nguội bớp rời thành từng hạt
cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm. Đậy nút bình tam giác bằng giấy chống
ẩm. Hấp thanh trùng ở P = 1atm trong vòng 30-45 phút.
Môi trường ngô mảnh: Ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5 mm cho nước vào theo tỷ
lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn đều trong khay để 1-2 giờ cho ngấm nước đều. Bóp
tơi cho vào bình tam giác khác thành lớp dày 1cm. Đậy nút bình bằng giấy chống ẩm.
Hấp thanh trùng đồng thời làm chín ở P = 1atm, 120
0
C, trong thời gian 60 phút, lấy ra để
nguội lắc cho khỏi vón cục.
Môi trường cám: Chọn cám tốt, mới nhưng loại thô không cần mịn hạt, sau đó làm tương
tự như đối với ngô mảnh.
Thường sử dụng các bình tam giác dung tích 0,3-0,5 lít hay 1 lít có cổ rộng. Sau khi
chuẩn bị môi ttrường trong bình thuỷ tinh ta tiến hành nuôi cấy nấm mốc. Trước tiên cần
phải chuẩn bị lấy 5ml nước vô trùng cho vào các ống nghiệm. Sau đó, đổ nước vô trùng
cho bào tử hoà vào trong nước đồng thời cấy chuyển chúng sang bình tam giác. Trung
bình cứ một ống nghiệm có thể cấy chuyển sang 2-3 bình tam giác có dung tích 1 lít, lắc
cho giống phân bố đều trong môi trường và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện
thích ứng. Thường nuôi khoảng 5-6 ngày là được. Yêu cầu cơ bản trong giai đoạn này là
làm sao tạo được nhiều bào tử mạnh khoẻ. Trường hợp nào thấy bình bị nhiễm thì phải

loại bỏ ngay.
 Nuôi cấy mốc trên khay
Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay: Nguyên liệu thường dùng là ngô mảnh có kích
thước 0,2-0,5mm. Trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng lượng so với ngô nếu hấp dưới
áp lực cao. Trộn xong để khoảng 3-4 giờ cho ngô ngấm nước đều rồi hấp chín. Thời gian
hấp khoảng 3-4 giờ, dài hơn so với thời gian hấp cám hay gạo. Nguyên liệu sau khi hấp
phải chín đều, không được quá bết hoặc quá khô. Độ ẩm còn lại 45-50% là vừa.
Cách gieo cấy và nuôi mốc trên khay: Nguyên liệu dỡ ra, làm nguội nhanh. Nếu ít có thể
bóp bằng tay cho tơi ra, nếu nhiều cho qua máy đánh tơi và dùng quạt thổi. Sau khi làm
nguội đến 26-28
0
C thì trộn nước giống từ bình tam giác vào với tỷ lệ 0,5-1% hoặc với tỷ
lệ cao hơn.
Sau khi trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao (0,3m). Đặt ở nhiệt độ 30-
32
0
C, độ ẩm 85-100%. Thời gian ủ 6-8 giờ, nhiệt độ khối môi trường lên tới 34-36
0
C và
bào tử đã nảy mầm gần hết nhưng chưa thành sợi dài. Lúc này cần rải môi trường thành
lớp mỏng 2-3cm cần giữ cho nhiệt độ môi trường không vượt quá 36
0
C. Lượng nhiệt tỏa
ra nhiều nhất ở khoảng 10-14 giờ sau khi trộn giống. Sau khi nuôi 34-36 giờ, nhiệt độ
khối môi trường bắt đầu giảm, cần phải điều chỉnh nhiệt độ lên 34-35
0
C, để duy trì sự
hình thành bào tử của nấm mốc.
Thời gian nuôi mốc giống trên khay thường vào khoảng 60 giờ. Nếu thấy hình thành bào
tử chậm thì có thể kéo dài đến 70-72 giờ. Mốc giống khi lấy ra thường có độ ẩm 32-35

% có thể dùng ngay làm giống cho công đoạn sản xuất. Nếu không dùng ngay thì phải
đem sấy khô đến độ ẩm 8%, giữ dùng dần hoặc là cung cấp giống cho các nơi sản xuất.
Nhiệt độ phòng sấy không được quá 40
0
C. Các bao mốc giống cần được bảo quản nơi
thoáng, mát ( có thể bảo quản lạnh 4-5
0
C ) tránh ánh nắng. Thời gian bảo quản tùy điều
kiện có thể, từ 1-2 tháng hoặc lâu hơn.
3.2.1.3 Qui trình sản xuất
Cấy chuyển
Chuẩn bị môi trường thạch
nghiêng
Nuôi cấy 30-32
o
C trong 5-6
ngày
Giống trong
ống thạch
nghiêng
Trộn đều bào tử
Ống mốc giống
Nước vô trùng
Chuẩn bị môi
trường trong
bình tam giác
Nuôi cấy 30-32
o
C trong 5-6
ngày

Mốc giống
trong bình tam
giác
Trộn giống 0,5 –
10%
Ngô mảnh hấp
thanh trùng
Làm tơi
Sấy khô
Nuôi mốc 60 h
Bao gói
Mốc giống
cho sàn
xuất


2.3 Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase
3.2.1. Nguyên liệu
Nguồn tinh bột: Ở nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa dạng
và phong phú.Ví dụ tinh bột từ gạo ( gạo tẻ, gạo nếp), ngô (bắp), sắn, …Nhưng để phù
hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô công nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho
giá thành sản phẩm. Do vậy, nguồn nguyên liệu cần được quan tâm và chú trọng về mức
độ rẻ tiền và dể kiếm. Đây là một lợi thế rất quan trọng cho nhà sản xuất và cho cả người
tiêu dùng để có giá thành thấp và được sản xuất đại trà.Sau đây, giới thiệu một số nguồn
nguyên liệu dễ tìm:
Bảng 2:Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo
Thành phần dinh dưỡngĐơn vị tính Hàm lượng/100g
Protein g 6
Tinh bột g 82
Lipid (tổng số) g 0,8

Cellulse g 0,6
Nước g 10,2
Năng lượng kcal 361

(Viện Nghiên cứu dinh dưỡng thuộc Đại học Mahidol, Thái Lan,1999)
- Protein của gạo chiếm khoảng 8-9%, chủ yếu là glutelin và glubuline. Ngoài ra còn
cólẫn ít : cozine và prolamin. Lượng protein thoái hoá và biến tính dần trong quá trình
bảo quản.
- Glucid thì chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose hemicellulose.Trong tinh bột chủ
yếu là amylopectin, có chứa một ít chất khoáng như: P,K,Mg,…Ngoài ra còn có một số
Vitamin:B
1
, B
2
, B
6
, PP, H, C, E và carotenoid.
Bảng 3:Thành phần dinh dưỡng của ngô:
Thành phần dinh dưỡng /100g Bắp nếp Bắp ngọt
Protein 9,1 12,9
Tinh bột 72,8 69,3
Lipid(tổng số) 2,2 3,9
Cellulose 1,8 2,9
Nước 11,2 9,5
Khoáng 2,9 1,5
(Cortez và Wild-Altamirano,1972)
Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn
gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc
khác.Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả. Hai
loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển. Mặt khác khi tạo

môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính
cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu.
Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho
thêm trấu với tỷ lệ thích hợp cho từng loại enzym đươc tạo ra từ VSV. Thực chất cho
trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống để không khí có
thể lưu thông trong lòng môi trường. Chính vì thế ta thấy rằng nấm mốc Asp. oryzae
không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường mà còn phát triển rất mạnh trên bề mặt hạt
môi trường. Hay nói cách khác, chủng nấm mốc Asp.oryzae có khả năng phát triển ở giữa
hai pha rắn và pha khí của môi trường.Trong trường hợp này, nó có khả năng phát triển
hẳn trong lòng môi trường nhưng nó vẫn hoàn toàn mang ý nghĩa của quá trình lên men
bề mặt.
+ Thành phần dinh dưỡng của sắn(khoai mì):
Sắn là loại củ chứa nhiều tinh bột, rất thích hợp là nguồn cơ chất cảm ứng cho quá
trình tổng hợp enzym amylase ở nấm mốc Asp.oryzae. Củ sắn gồm ba phần chính: vỏ,
thịt củ và lõi. Ngoài ra còn có cuống và rễ củ.
-Vỏ gồm hai phần: Vỏ gỗ ở bên ngoài, cấu tạo chủ yếu là cellulose, thường chiếm
khoảng 1,5-2% khối lượng củ, vỏ cùi cũng cấu tạo từ cellulose nhưng trong vỏ cùi còn có
mủ sắn là các polyphenol, chiếm tới 85-90% polyphenol của củ sắn .
-Thịt chứa nhiều tinh bột, ít protein và một lượng dầu, lượng polyphenol ở đây có
khoảng 10-15%, nhưng các polyphenol gây trở ngại khi chế biến, đặt biệt là để sắn chảy
mủ sẽ làm cho bột sắn biến màu, thay đổi mùi vị khó ăn trực tiếp khi luộc, khó thoát
nước khi sấy hay phơi khô sắn lát hay săn bột.
-Thành phần hoá học tươi của sắn: Tinh bột:20-34%; protein: 0,8-1,2%; chất béo:
0,3-0,4%; cellulose: 1-3,1%; chất tro: 0.54%; polyphenol: 0,1-0,3%; và nước: 60-74,2% .
3.2.2. Qui trình công nghệ
Thuyết minh qui trình:
Nguyên liệu: Trong phương pháp lên men bề mặt, cấu trúc chính là cám mì, cám gạo.
Hai loại này là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để
nuôi nấm không cần bổ xung thêm chất khác nữa. Tuy nhiên do là phế liệu của công nghệ
xay xát, nhưng làm cũng tương đối đắt tiền. Hơn nữa trong quá trình nuôi nấm, các chất

Nguyên liệu
Xử lý nguyên liệu
Hấp thanh trùng
Làm nguội
Trộn giống VSV
Nuôi cấy
Thu nhận phế phẩm
enzyme thô
Chế phẩm enzyme thô
đem tinh chế
Nghiền mịn
Trích ly
Lọc
Kết tủa enzyme
Thu nhận kết tủa
Sấy kế tủa
Tinh chế kết tủa
Thu nhận chế phẩm
enzyme tinh khiết
Enzyme tinh khiết
Giống VSV
Nhân giống
Giống cho sản xuất
Chế phẩm ezyme thô
đem sử dụng
Bã
Dùng trong chăn nuôi
Cồn hoặc Sulfat amon
Sử dụng chế phẩm
ezyme tinh sạch

dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay thế hoặc pha trộn thêm một số cấu
tử rẻ tiền hơn. Mặt khác cấu tử bổ sung vào (trấu, mạt cưa,…) để làm tăng độ xốp giúp
cho hệ sợi nấm phát triển tốt hơn tận dụng tối đa nguồn cơ chất để sinh ra hoạt lực
enzyme cao nhất. Đặc biệt chú ý, cám không được chứa tinh bột dưới 20-30%. Nên dùng
cám tốt, cám mới không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không
quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%.
Hấp thanh trùng: Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải
thanh trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không
chứa VSV ngoại lai, cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1-1,5 atm trong thời gian 45-60
phút. Để thuận lợi cho việc thanh trùng có hiệu quả, cũng như tạo điều kiện cho nấm sợi
phát triển, trước khi thanh trùng, người ta thường dùng HCl hay H
2
SO
4
để điều chỉnh pH
môi trường.
Sau khi thanh trùng môi trường được làm nguội người ta bắt đầu nuôi cấy để thu nhận
enzyme.
Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi
trường đã thanh trùng, ủ thành đống vài giờ, giống mốc có thể nuôi cấy riêng ở phòng thí
nghiệm hay tại các phân xưởng nhân giống hoặc là giống thương phẩm có bán ở nơi cung
cấp giống. Các loại giống này thường chứa nhiêu bào tử. Khi cấy vào môi trường dinh
dưỡng, chúng sẽ phát triển thành tế bào nấm mốcvà tạo ra các loại enzyme mà ta mong
muốn.Tỷ lệ giống đưa vào nuôi cấy thường vào khoảng 0,5-20% so với khối lượng của
môi trường.
Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với
chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này
được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy
phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí.Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi
phát triển là 28-32

0
C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm
sợi phát triển.
Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là
môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối
môi trường.
Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc
vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu
kiện nuôi cấy.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp
bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai
đoạn này có những thay đổi sau:
-Nhiệt độ tăng rất chậm.
-Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.
-Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.
-Khối môi trường còn rời rạc.
-Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được
đưa nhiệt độ cao quá 30
0
C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ
bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất
mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường
trong lòng môi trường.
-Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt
thường.
-Môi trường được kết lại khá chặt
-Độ ẩm môi trường giảm dần

-Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45
0
C.
-Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi.
-Enzyme amylase được tổng hợp mạnh.
-Lượng O
2
trong không khí giảm và CO
2
sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải
được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-30
0
C là tốt nhất.
Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản
như sau:
-Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại.
-Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống
20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở
30
0
C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó luợng enzym amylase tạo
ra sẽ giảm xuống . Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất
cần thiết.
Thu nhận sản phẩm:
Kết thúc qúa trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym amylase, chế phẩm
này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra, chúng còn chứa sinh
khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường).
Để đảm bảo cho chế phẩm enzym thô α-amylase không bị mất hoạt tính nhanh
người ta thường sấy khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường dùng
ở đây là máy sấy chân không- có thể xem ở phần phụ lục). Độ ẩm cần đạt được sau khi

qúa trình sấy kết thúc là nhỏ hơn10% độ ẩm. Để đảm bảo hoạt tính enzym không thay
đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-40
0
C. Enzym α-amylase ở nấm mốc Asp.oryzae sẽ
bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên đến 60-70 độ C.
Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải
qúa trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch
enzym. Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau:
-Toàn bộ khối lượng enzym thô amylase được đem đi nghiền nhỏ.Mục đích của
qúa trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm
thô.Khi thành tế bào được phá vỡ ,các enzym nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ
dàng thoát khỏi tế bào.Phần lớn enzym amylase ngoại bào khi được tổng hợp và thoát
khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường.Khi ta nghiền nhỏ, enzym
thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn.
-Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường
hợp này đượcdùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ
không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát
thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100
o
C để loại
bỏ nước và tiêu diệt VSV.
Trích ly: Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym α-amylase.
Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước
như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần
nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc
( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc
ăn).
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước,
các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách enzym
ra khỏi vật chất này.

Qúa trình kết tủa enzym α-amylase: Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa
enzym nhờ những tác nhân gây tủa.Trong công nghệ tinh chế enzym, người ta thường
dùng cồn và sunfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác
nhân gây tủa khác.
Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả
những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym. Khi đổ chất làm kết tủa enzym
vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính.
Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng như
sau: Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulfat amon.
Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau
đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7
O
C) theo thời gian, các enzym sẽ
được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng
paste (độ ẩm lớn hơn 70%W).
Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản
người ta sấy kết tủa enzyn α-amylase ở 40
O
C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W
( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương – có thể xem ở phần phụ lục).
Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym α-amylase ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn
chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzym ngoài enzym amylase ta quan
tâm, chẳng hạn enzym α- amylase này còn chứa hoạt tính protase có tính acid và
cellulose do đó muốn thu nhận được enzym có độ tinh khiết cao hơn ta phải tinh chế
enzym α-amylase kết tủa bằng các qúa trình lọc Gel hay sử dụng phương pháp cố định
enzym ,…
3.2.3 Thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus
Oryzae( /> 3.2.3.1 Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm
Khi nuôi VSV tạo amylase có 2 quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình
tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hoặc ngoài môi trường.

Ở một số VSV, quá trình sinh tổng hợp amylase tiến hành song song với quá trình
sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng khối. Trong
trường hợp này, sinh tổng hợp enzyme amylase kết thúc ở pha logarit cùng đồng thời với
sự ngưng sinh trưởng và sự bắt đầu pha phát triển ổn định tiếp theo sau.
Tuy nhiên theo ý kiến của nhiều tác giả, sự tạo thành amylase cực đại thường xảy
ra sau khi quần thể tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng. Trong trường hợp này, sinh trưởng
của VSV hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme amylase trong canh trường, chỉ sau
khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực lớn.
3.2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng enzym
 Ảnh hưởng các nguồn Nitơ dinh dưỡng
Nguồn dinh dưỡng Nitơ hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng
để nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người ta dùng muối vô cơ Natri
Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo α-amylase. Hàm lượng
thường sử dụng là 0,91%. Nari Nitrat và Amoni Nitrat có hiệu qủa hơn so với các loại
muối khác ( Kali Nitrat, Magie Nitrat, Amoni Sunfat….).
Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này
và ức chế tổng hợp amylase khác .Ví dụ:Kết qủa thí nghiệm Fenikvova và cộng tác viên
về việc sử dụng các nguồn Nitơ từ những muối khác nhau.
Bảng 4 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các enzyme amylase
Nguồn Nitơ Liệu lượng muối, % theo
N
Hoạt động enzyme sau 6 ngày nuôi đối với
100ml
α-amylase Glucomylase
NaNO
3
0,30 145 8000
NaNO
3
0,15 26 3300

(NH
4
)
2
SO
2
0,15 - -
NH
4
NO
3
0,15 98 4100
NH
4
NO
3
0,30 45 4900
NH
4
H
2
PO
4
0,30 5,5 8000
( Sách Công nghệ enzym của Nguyễn Đức Lượng chủ biên, 2004)
Ngoài ra cũng cần phải xác định tỷ lệ giữa nguồn carbon và Nitơ trong môi trường
phù hợp cho mốc Asp.oryzae phát triển. Tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về
carbon và Nitơ có ý nghĩa lớn đối với sự sinh tổng hợp sinh khối của nấm Asp.oryzae và
sự tạo thành amylase
Ảnh hưởng của Amino acid

Amino acid là những cấu tử hợp thành phân tử enzym, trong đó có một số các
amino acid không đồng nhất về giá trị dinh dưỡng nên sử dụng hỗn hợp amino acid sẽ có