HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN HESPERIDIN

A. MỞ ĐẦU
Trong y học cổ truyền Việt Nam, cây cỏ mực hay còn gọi là cây Cỏ nhọ nồi, hạn
liên thảo, mặc hạn liên, kim lăng thảo là loại cây có nhiều ứng dụng quan trọng trong
việc chữa bệnh, được dùng để điều trị các bệnh như: nôn ra máu từ dạ dày, chảy máu
cam, tiểu ra máu, xuất huyết tử cung, viêm gan mãn tính, viêm ruột, lỵ, trẻ em suy
dinh dưỡng, ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh, nấm da, ezecma, vết
loét, bị thương, chảy máu, viêm da. Ngoài ra Cỏ mực còn được dùng làm thuốc sát
trùng trong bệnh ho lao, viêm cổ họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau dạ
dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc, là thuốc cầm máu hữu hiệu nhất.
Cây cỏ mực có tên khoa học là Eclipta prostrata L. (syn. Eclipta alba L.), thuộc họ
Cúc (Asteraceae), là loại cây thân thảo hằng niên, cao từ 10-60 cm, mọc bò hoặc có khi
gần như thẳng đứng, có lông trắng, cứng, thưa. Thân màu lục hay màu nâu nhạt hay
hơi đỏ tía. Lá mọc đối, phiến lá dài và hẹp cỡ 2,5 x 1,2 cm. Mép lá nguyên hay có
răng cưa cạn, hai mặt đều có lông. Hoa trắng tập hợp thành đầu ở nách lá hay đầu
cành, các hoa cái hình lưỡi ở ngoài, các hoa lưỡng tính hình ống ở giữa. Quả bế dẹt
có 3 cạnh, có cánh dài 3 mm. Vùng phân bố của cây Cỏ mực trên thế giới khá rộng vì
nó là loài cây nhiệt đới, mọc hoang ở chỗ ẩm mát. [1]
Dựa vào các phương pháp nghiên cứu hiện đại người ta đã xác định được thành
phần hóa học của cỏ Mực gồm: β-Sitosterol, Metyl gallat, Eclalbasaponin I,
Eclalbasaponin II, Norwedelolactone, Hesperidin (Hespentin 7-O-rutinosid). Trong đó,
Hesperidin (Hespentin 7-O-rutinosid) là chất đáng được đề cập đến; bởi lẽ Hesperidin
(Hespentin 7-O-rutinosid) thường xuất hiện ở các loại cây có múi như: cam, quýt,… và
có nhiều ứng dụng trong y học hiện nay…[4]

1
B. NỘI DUNG
1. Hợp chất Hesperidin
Hesperidin [1] là một hợp chất flavonoid chủ yếu trong vỏ quả cây họ Cam (Citrus
Rutaceae) được Lebrton tách chiết vào năm 1827 từ vỏ quả cây Hesperides, sau đó nó
được tìm thấy trong rất nhiều cây họ Cam (họ Cửu lý hương). [5], [8] Hesperidin có
công thức phân tử: C

28
H
34
O
15
. Khối lượng phân tử: 610,56. Công thức cấu tạo của
Hesperidin như sau:
Hình 1: Cấu trúc của Hesperidin
Tên khoa học: (2S)-7-[[6-O-(6-Deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D- glucopyranosyl]
oxy]-2,3-dihydro-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one.
Tên khác: hesperetin 7-rhamnoglucoside; cirantin; hesperetin-7-rutinoside.
Theo cấu trúc phân tử hesperidin thuộc về nhóm flavanone. Phân tử hesperidin gồm
một phân tử aglycone hesperetin (12) liên kết với một phân tử disaccharid (rutinose).
Do đó có thể coi hesperidin là dẫn xuất β-7-rutinoside của hesperetin. Rutinose (6-O-
(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-D-glucose) là một disaccharid tạo nên bởi một phân tử
rhamnose và một phân tử glucose bằng liên kết α-1,6. Trong phân tử hesperidin,
glucose gắn với hesperetin còn rhamnose gắn với phân tử glucose.[6], [7]
Khi thủy phân hesperidin bằng kiềm thu được phloroglucinol và hesperetenic axít.
[8] Khi thủy phân hesperidin bằng axít thu được hesperetin, D-glucose, L-rhamnose.
2
Hesperidin là bột màu trắng hay nâu nhạt, không mùi, không vị. Khó tan trong nước
(1 gam trong 50 lít nước). Tan trong formamid, DMF ở 60
o
C. Tan ít trong metanol, axít
axetic nóng. Hầu như không tan trong acetone, benzene, chloroform. Tan tự do trong
kiềm loãng, pyridine tạo ra một dung dịch có màu vàng sáng.[12]
Nhiệt độ nóng chảy: 258-262 °C.
Độ quay cực: [α]
D
20 = -76° (c = 2 trong pyridine).

Tác dụng chữa bệnh của hesperidin được các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm
trong hai thập kỷ vừa qua và đã có một số lượng lớn ấn phẩm được công bố về ứng
dụng hesperidin trong điều trị bệnh.[6], [11] .
Hesperidin cũng như các flavonoid khác có tác dụng kháng viêm, chống ôxy hóa,
chống dị ứng, chống ung thư. Hesperidin có tác dụng làm bền thành mạch và giảm tính
thấm của mao mạch nên được sử dụng trong điều trị bệnh cao huyết áp và bệnh trĩ. Tác
dụng chữa ho của hesperidin là do khả năng chống dị ứng nhờ tính chất ức chế việc
giải phóng histamine từ các tế bào lớn. Hesperidin khi dùng phối hợp với vitamin C có
tác dụng cộng hưởng và hỗ trợ hấp thụ vitamin C.
2. Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế hesperidin
Các hợp chất flavonoid là các polyphenol nên trong môi trường kiềm chúng chuyển
thành dạng polyphenolat có khả năng tan trong nước. Với hesperidin thì ngoài việc
chuyển thành dạng polyphenolat nó còn chuyển thành dạng hesperidin chalcone. [7],
[10] Các dẫn xuất này có khả năng chuyển đổi thuận nghịch thành hesperidin [9] theo
sơ đồ sau:
3
Hình 2. Hesperidin chuyển sang các dạng dẫn xuất của nó.
Theo cô Nguyễn Ngọc Hạnh, quá trình chiết citroflavanoid có thể tiến hành theo sơ
đồ sau:
Hình 3: Sơ đồ điều chế Citroflavonoid
Ngoài cách chiết, cô lập trên, ngày nay người ta sản xuất Hesperidin dựa trên các
tiến bộ khoa học kỹ thật dựa theo sơ đồ sau:
4
Hình 4. Sơ đồ công nghệ sản xuất Hesperidin
Hay cụ thể hơn là sơ đồ quy trình sau:
5
Hình 5: Quy trình tách chiết Hesperidin
Quy trình công nghệ tách, chiết Hesperidin từ các nguyên liệu chứa Hesperidin bao
gồm các công đoạn sau: [2],[3]
• Nghiền nguyên liệu chứa Hesperidin:

Các nguyên liệu chứa Hesperidin được nghiền với máy nghiền cỡ sàng 3mm đảm
bảo sau khi chiết có thể loại bỏ bã dễ dàng mà vẫn đảm bảo hiệu suất cũng như năng
suất của quá trình chiết;
• Chiết Flavanoit toàn phần bằng dung dịch kiềm
Công đoạn này được thực hiện trong thiết bị có khuấy hoặc bơm tuần hoàn với các
điều kiện sau:
- Tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu là: 4/1 – 6/1 (TT/KL);
- pH của hỗn hợp chiết: 11- 12;
- Nhiệt độ chiết: 30- 40
0
C;
6
- Thời gian chiết: 2 giờ.
Sau khi kết thúc giai đoạn chiết sẽ lọc bỏ bã và tạp chất không tan, thu được dịch
lọc. Điều chình pH của dịch lọc này về giá trị 4- 5 để kết tinh flavonoid trong 24 giờ.
Sau 24 giờ đem lọc, rửa bằng nước 5 lần. Sau đó sấy ở 60
o
C trong 8 giờ thu được
flavonoid toàn phần. Lọc thu Flavanoit toàn phần.
• Chiết Hesperidin ra khỏi hỗn hợp Flavanoit toàn phần:
Do hesperidin hầu như không tan trong acetone, benzene, chloroform nên chung tôi
tiến hành tách hesperidin ra khỏi hỗn hợp flavonoid toàn phần như sau: Flavonoid toàn
phần thu được ở trên được đem chiết rắn – lỏng bằng axêton 3 lần, sau đó chiết bằng
etyl axetat với tỷ lệ rắn/lỏng: 1/5 (TT/KL). Thời gian mỗi lần chiết là 0,5 giờ, sẽ thu
được hesperidin thô.
• Tinh chế sản phẩm:
Hòa tan Hesperidin thô trong metanol ở nhiệt độ sôi với tỷ lệ Hesperidin/metanol
1/200 (TT/KL): Lọc dung dịch thu được qua giấy lọc để loại bỏ tạp chất không tan;
chỉnh nồng dộ dung môi về 85% bằng nước; để kết tinh ở 25
0

C trong 24 giờ; lọc tinh
thể Hesperidin, rửa lại bằng metanol. Sau đó sấy sản phẩm ở 60
0
C trong 8 giờ.
3. Định tính, định lượng Hesperidin
Hesperidin thành phẩm thu được được phân tích bằng các phương pháp phân tích
hóa lý như: đo điểm chảy, IR, LC-MS H
1
-NMR, C
13
-NMR, HPLC … để xác định cấu
trúc, hàm lượng.
Sau đây là kết quả của việc phân tích bằng các phương pháp:
• Sản phẩm hesperidin có nhiệt độ nóng chẩy : 252 – 261
o
C.
• Phổ UV của sản phẩm [3]
Trên phổ đồ có các số sóng đặc trưng ở 2925 cm
-1
là dao động của liên kết CH. Pick
đặc trưng với cường độ cao nằm ở số sóng 3473 cm
-1
là của nhóm OH. Pick 1647 là
của nhóm C=O. Pick 1606 là dao động của liên kết C=C trong vòng thơm. Pick 1130
-1195 cm
-1
là số sóng đặc trưng của nhóm chức C-O.
7
Hình 6: Phổ đồ UV của Hesperidin
• Phổ khối MS của hesperidin [3]

Phổ MS của hesperidin được ghi cả ở chế độ ion âm (negative mode) và dương
(positive mode). Phổ MS của hesperidin ghi ở dạng negative mode có các pic đặc trưng
tương ứng với số m/z của các ion: [M-H]
-
= 609, ion tạo thành do mất một đơn vị
rhamnose có [M-H-146]
-
= 463, mất tiếp một đơn vị glucô có [M-H-146-162]
-
= 301. Ở
chế độ ion dương phổ MS tương ứng có [M+H]
+
= 611, ion tạo thành do mất một đơn
vị rhamnose có [M+H-146]
+
= 465, mất tiếp một đơn vị glucô có [M+H-146-162]
+
=
303 và một pic đặc thù cho lớp chất này hình thành do sự chuyển vị nội phân tử của ion
[M+H]
+
tạo thành ion [M+H-162]
+
= 449 do mất một đơn vị glucô.
8
Hình 7: Sơ đồ phân mảnh của hesperidin
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1
H-NMR của hesperidin [3]
Phổ

1
H-NMR của hesperidin được ghi ở 500 MHz trong DMSO có: δ: 12,0 (1H,
s, 5-OH); 9,09 (1H, s, 3’-OH); 6,93 (3x1H, m, H-2’, H-5’và H-6’); 6,14 và
6,12 (2x1H, j= 2,1 Hz, H-6 và H-8); 5,51 (1H, t, j=3,1Hz, H-2); 5,49 (1H, d, H-1, Gl);
5,16 (1H, d, H-1, Rh); 3,791, (3H, m, OCH
3
); 3,634, 3,301 (2H, m, H-6, Gl); 3,55
(2x1H, m, H-5, Rh, H-5, Gl); 3,44 (4x1H, m, OH, Gl và Rh) 3,386, 3,132 (2x1H, H-3);
1,09 (3H, d, H-6, Rh).
Kết quả trên hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu đã công bố. [13]
Qua dữ liệu phổ cho thấy có 1 nhóm OH ở vị trí C5 và 1 nhóm OH ở vị trí C5’. Ở
vị trí C2 chỉ có 1 proton còn ở vị trí 3 có 2 proton.
9
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
13
C-NMR của hesperidin [3]
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
13
C-NMR của hesperidin được ghi trong dung môi
DMSO (phụ luc 4) có: δ: 197,0 (s, C=O), 165,146 (s, C-7), 163,039 (s, C-5), 162,499
(s, C-9), 147,98 (s, C-4’), 146,459 (s, C-3’), 130,914 (s, C-1’), 117,964 (d, C-6’),
114,147 (d, C-2’), 112,085 (d, C-5’), 103,338 (d, C-10), 100,597 (d, C-1, Rh), 99,482
(d, C-1, Gl), 96,4 (d, C-6), 95,571 (d, C-8), 78,374 (d, C-2), 76,277 (d, C-3, Gl),
75,539 (d, C-4, Gl), 72,999, d, C-2, Gl), 72,089 (d, C-4, Rh), 70,715 (d, C-3, Rh),
70,276 (d, C-2, Rh), 69,62 (d, C-5, Gl), 68,319 (d, C-5, Rh), 66,035 (t, C-6, Gl),
55,717 (C-11, 4’-O-CH
3
), 42,05 (t, C-3), 17,820 (CH
3
,Rh).

Các dữ kiện phổ
13
C-NMR còn chứng minh sự tồn tại của đồng phân epime 2R
củahesperidin (epime 2S). Các epime này trong thực tế không khác biệt nhiều về các
dữ kiện phổ
1
H-NMR [9], tuy nhiên sự phân tích kỹ lưỡng các tín hiệu phổ cacbon 13
cho thấy một số tín hiệu xuất hiện ở dạng kép (doublet) cho phép nhận dạng sự tồn tại
của epime 2R đặc biệt là các tín hiệu cộng hưởng ở vòng B [δC 112,1 (d, C-5’), 114,1
(d, C-2’), 117,8 (d, C-6’), 130,96 (s, C-1’), 146,48 (C-3’) v 147,98 (s, C-4’)], các tín
hiệu ở vòng A [δ
C
162,5 (s, C-9), 163,0 (s, C-5) và 165,1 (s, C-7)] và một số tín hiệu
của các nhóm đường [δC 66,07 (t, C-6”), 69,7 (d, C-2”), 73,0 (d, C-4”), 99,5 (d, C-1”)].
Sự xuất hiện của các chất chuyển hóa thứ cấp trong thiên nhiên thường được cho là
theo các con đường đặc thù về lập thể và sự tham gia của các enzym trong các bước
của con đường sinh tổng hợp. Tuy nhiên các đồng phân lập thể vẫn có thể cũng xuất
hiện như ví dụ về các đồng phân epimeric 2R và 2S của các flavanon do l sản phẩm
phụ của các qua trình gây bởi các enzym nhất định và cần có các phương pháp để nhận
biết các chất này. Trong trường hợp của Hesperidin (dạng 2S) và epime 2R F. Maltese
sử dụng phổ
1
H-NMR để nhận biết giữa 2 đồng phân epime này [9. Phổ
13
C-NMR đã
được xác định trong trường hợp của Hesperidin (epime 2S) l phương pháp nhanh để
nhận biết chất này và epime 2R của nó. [13]
Với các dữ liệu phân tích IR, UV, MS,
1
H-NMR và

13
C-NMR cho phép kết luận chất
chiết được là hesperidin.
10
4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết [3]
• Ảnh hưởng của pH dung môi chiết
Quá trình chiết flavonit toàn phần tốt nhất nên tiến hành ở pH trong khoảng 11 –
12. Ở pH thấp hơn hiệu suất chiết flavonoid toàn phần cũng như hiệu suất hesperidin
thu được thấp. Điều này phù hợp với lý thuyết vì các ion phenolat và polyphenolat
được bền hóa tốt nhất ở pH > 10. Khi tiến hành chiết ở pH cao hơn mặc dù lượng
flavonoid toàn phần cao hơn, nhưng hiệu suất hesperidin thu được giảm. Kết quả này
có lẽ là do sự thoái biến của các phân tử flavonoid glycoside bởi phản ứng thủy phân
một phần hoặc hoàn toàn nửa đường tạo ra dạng aglycone flavonoid.
Tóm lại, quá trình tách chiết tốt nhất thực hiện ở pH = 11-12.
• Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết
Tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu cần được duy trì vừa đủ để có thể khấy trộn
được hỗn hợp chiết một cách hiệu quả. Lượng dung môi sử dụng càng nhiều thì hiệu
suất chiết sẽ càng giảm do sự hòa tan một lượng nhỏ hesperidin trong nước. Từ các
nghiên cứu thực nghiệm, người ta nhận thấy tỷ lệ dung môi chiết được khống chế
trong khoảng từ 4/1 (TT/KL) đến 6/1 là đủ để khuấy trộn được hỗn hợp. Ở tỷ lệ dung
môi / nguyên liệu nhỏ hơn 3/1 thì chưa đủ dung môi để có thể khấy trộn hỗn hợp chiết
vì vậy mà làm giảm khả năng phân tán, tương tác giữa các phân tử flavonoid với các
ion kim loại kiềm để chuyển hóa chúng thành dạng tan nên hiệu suất chiết giảm.
• Ảnh hưởng của nhiệt độ
Quá trình chiết nên được tiến hành ở nhiệt độ từ 30 – 40
o
C. Khi tăng nhiệt độ cao
hơn không chỉ hiệu suất chiết hesperidin giảm mà còn rất khó lọc flavonoid toàn phần
ra khỏi dung dịch sau khi kết tinh có lẽ do nhiệt độ cao thúc đẩy quá trình hòa tan các
hợp chất pectin vào nước. Hơn nữa, ở nhiệt độ cao trong môi trường kiềm (pH = 11-

12) sẽ thúc đẩy quá trình thủy phân, phân hủy các hợp chất flavonoid không những làm
giảm hiệu suất thu hồi hesperidin mà còn gây khó khăn cho quá trình tinh chế sản
phẩm. Do đó nhiệt độ của quá trình chiết nên được duy trì ở 30 – 40
o
C
11
C. KẾT LUẬN
Với việc áp dụng các kỹ thuật phân tích hiện đại và các phương pháp kiểm nghiệm
kết quả cao như: IR, LC-MS,
1
H-NMR,
13
C-NMR…, ta đã tách, chiết thành công
Hesperidin từ cây cỏ mực (hoặc các nguyên liệu có chứa Hesperidin), đã xác định được
cấu trúc của Hesperidin, cũng như các tính chất cơ bản của Hesperidin… Đặc biệt, sản
phẩm Hesperidin được sản xuất theo quy trình công nghệ đã được giới thiệu trên hoàn
toàn đạt tiêu chuẩn làm nguyên liệu sản xuất thuốc với các chỉ tiêu cơ bản sau: Hàm
lượng Hesperidin 94,5%; pH: 5,55; Mất khối lượng do sấy 1,67%; Kim loại nặng: < 20
ppm; Arsen< 1 ppm; Tro sunfat 0,04%; góp phần không nhỏ trong việc kết hợp làm
thuốc chữa bệnh và đặt nền móng cho sự phát triển của ngành dược liệu của quốc gia
nói riêng và thế giới nói chung.
12
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
[1 Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Thành phố Hồ
Chí Minh.
[2]. Nguyễn Văn Chính (2010) “Công nghệ sản xuất Hesperidin”, Tạp chí CN Hóa
chất .
[3]. Ths. Nguyễn Văn Chính; đề tài: “Nghiên cứu quy trình tách chiết Hesperidin từ
quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc”; 2008.

[4]. Nguyễn Thị Thơi “Nghiên cứu thành phần hóa học cây cỏ mực (Eclipta
Prostrata L., Asteraceae) ”, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Khoa Hóa học, Luận
văn Thạc sĩ ngành: Hóa hữu cơ, 2011.
Tiếng Anh
[5]. A Di Mauro, B Fallico, A Passerini, P Rapisarda, E Maccarone; JAgric
Recovery of hesperidin from orange peel by concentration of extracts on styrene-
divinylbenzene resin. Food Chem. 1999; 47(10):4391-7.
[6]. A. Garg, S. Garg, L. J. D. Zaneveld and A. K. Singla; Chemistry and
Pharmacology of The Citrus Bioflavonoid Hesperidin. Phytother. Res. 15, 655–669
(2001)
[7].Erich Grotewold; The Science of Flavonoids; Springer Science and Business
Media, Inc. 2006 1-123.
[8]. F. I. Kanaze , C. Gabrieli , E. Kokkalou , M. Georgarakis , I. Niopas;
Simultaneous reversed-phase high-performance chromatographic method for the
determination of diosmin,hesperidin and naringin in different citrus fruit juices and
pharmaceutical formulations. J Pharm Biomed Anal. 2003 Sep 19;33(2):243-249.
[9]. H. Scarborough. Observation on nature of vitamin P and the vitamin P potency
of certain Foodstuffs. The Nature, vol 39, London (1945), ps. 271-278.
13
[10]. R. H. Higby, The chemical nature of hesperidin and its experimental
medicinal use as a source of vitamin P. A review. Jour. Amer. Pharm. Assoc. Sci. Ed.
30:629-34, 1941.
[11]. Robert J Nijveldt, Els van Nood, et al. Flavonoids: a review of probable
mechanisms of action and potential applications. Am J Clin Nutr 2001;74:418–25.
[12]. The Meck Index CD-ROM v. 13.5 , 2004
[13]. Maltese F., Erkelans C., Vander Kooy F., Choi Y. H., Verpoorte R.
(2009), “Identification of natural epimeric flavanone glycosides by NMR
spectroscopy”, Food hemistry, 116, 575-579.
14