Nghiên cứu sản xuất cellulose từ vi khuẩn acetobacter

Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012
1
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CELLULOSE TỪ VI KHUẨN ACETOBACTER
XYLINUM ĐỂ CỐ ĐỊNH VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG TRONG LÊN
MEN SỮA CHUA
RESEACH PRODUCED CELLULOSE BY BACTERIUM AXETOBACTER XYLINUM
TO FIXED BACTERIA LACTIC AND APPLICATION YOGURT FERMENTATION
SVTH: Lê Thị Bốn, Lê Thị Diệu
Lớp 09HTP, Khoa Công nghệ Hóa học, Trường Cao đẳng Công nghệ, Đại học Đà Nẵng
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
Khoa Công nghệ Hóa học, Trường Cao đẳng Công nghệ, Đại học Đà Nẵng

TÓM TẮT
Cellulose vi khuẩn (BC) có nhiều đặc tính tốt như: Độ tinh khiết cao, có khả năng hút, giữ
ẩm tốt, có khả năng đàn hồi tốt. Nghiên cứu này nhằm mục đích tìm ứng dụng mới của BC: Cố
định tế bào vi khuẩn Lactobaccillus bulgaricus (LB) và Streptococcus thermophillus (ST) và ứng
dụng vi khuẩn cố định được trong lên men sữa chua. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Mật độ tế bào
vi khuẩn cố định trên chất mang BC là 7,78*10^9/ml (ST) và 7,63*10^9/ml (LB), điều kiện cố định vi
khuẩn bằng phương pháp bẫy – hấp phụ là hấp phụ bằng cánh khuấy, thời gian ủ là 54 giờ, ở
nhiệt độ 37
0
C. Hiệu quả lên lên men sữa chua tốt nhất với một lượng giống cố định là 0,15 (%) ở
39
0
C. Đồng thời góp phần tạo nên một sản phẩm sữa chua mới có bổ sung cellulose giúp đa dạng
hóa sản phẩm trên thị trường và tốt cho hệ tiêu hóa.
Từ khóa: Cellulose vi khuẩn (BC), sữa chua, Streptococcus thermophillus (ST),
Lactobaccillus bulgaricus (LB).
ABSTRACT
Bacterial cellulose (BC) has many good characteristics such as high purity, can absorb,
hold moisture well, with good resilience. This study aims to find new applications of BC:

Fixed bacterial cells Lactobaccillus bulgaricus (LB) and Streptococcus thermophillus (ST) and
application fixing bacteria in fermented yogurt. Research results showed that: Bacterial cell
density fixed in BC 7,78*10^9/ml (ST) và 7,63*10^9/ml (LB), conditions fixed by the method
of trapping bacteria - adsorption is absorbed by paddle, the incubation time is 54 hours, at a
temperature of 37
0
C. The effect on the best yogurt fermented with a fixed amount like that 0,15
(%). At the same time contributing to a new yogurt products help diversify the market and good
for the digestive system.
Key words: Bacterial cellulose, yogurt, Streptococcus thermophillus (ST), Lactobaccillus
bulgaricus (LB).
1. Đặt vấn đề
Hiện nay kĩ thuật cố định tế bào đang được đề cập và quan tâm rất nhiều, đặc biệt
trong quá trình bảo quản và lưu thông cung cấp giống cho lĩnh vực lên men tạo ra sản
phẩm thực phẩm. Tế bào cố định có nhiều ưu điểm so với tế bào tự do: Tiện lợi trong việc
bảo quản, lưu thông và giúp giảm chi phí ở giai đoạn chuẩn bị giống. Những chất mang
truyền thống trong cố định tế bào: Alginat, xơ dừa, gelatin…vẫn tồn tại những nhược điểm
nhất định. Cellulose vi khuẩn hội đủ những điều kiện của một chất mang trong cố định tế
bào: Giá thành rẻ, có khả năng hút nước và giữ ẩm tốt, có thể bổ sung trực tiếp vào sản
phẩm thực phẩm mà không xảy ra bất kỳ phản ứng phụ nào, ngoài ra còn tốt cho hệ tiêu
hóa…nên được chọn làm chất mang trong đề tài này. Hiện nay trong các nhà máy sản xuất
Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012
2
sữa chua, người ta bảo quản giống bằng phương pháp bảo quản lạnh và cấy chuyền để giữ
giống ST và LB là chủ yếu, công việc này tốn nhiều thời gian và chi phí. Vì thế cố định tế
bào hai vi khuẩn trên trên một chất mang để tiện bảo quản, lưu thông cung cấp giống và
chủ động được nguồn giống cho cho các nhà máy sản xuất sữa chua và các lĩnh vực khác
cần đến hai chủng này là điều cần thiết.
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu

Chất mang BC tự sản xuất từ vi khuẩn Axetobacter xylinum, môi trường tuyển
chọn để hoạt hóa hai chủng vi khuẩn ST và LB được phân lập từ sữa chua vinamilk.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu được thể hiện cụ thể trong hình 2.

Hình 2. Các bước trong phương pháp nghiên cứu.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Phân lập vi khuẩn ST và LB từ sữa chua vinamilk
Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và
đưa về dạng thuần khiết.
Khuẩn lạc vi khuẩn ST và LB được thể hiện trong hình 3.1 và hình 3.2.
Sữa chua
Phân lập
Vi khuẩn ST
Sữa chua
Phân lập
Vi khuẩn LB
Kiểm tra sự thuần khiết của giống
Cố định trên chất mang BC
Hoạt hóa sau cố định
BC tự sản xuất
Phương pháp - bẫy hấp
phụ
Kiểm tra khả năng sống sót
Xác định hoạt lực lên men
Đánh giá phương pháp
Ứng dụng trong lên men sữa chua
Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012
3

Hình 3.1. Khuẩn lạc của ST. Hình 3.2. Khuẩn lạc của LB.
Kết quả phân lập được thể hiện cụ thể qua bảng 3.1.
Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của 2 chủng vi khuẩn LB và ST.
STT Chủng
vi khuẩn
Đặc điểm khuẩn lạc (Hình dạng,
màu sắc, bề mặt, độ đặc)
Hình thái tế bào
1 ST Hình tròn, màu trắng đục,mép nhẵn,
bóng, không nhớt, mặt hơi lồi và bám
chặt trên môi trường phân lập.
Hình cầu, xếp chuỗi liên tiếp nhau.
2 LB
Hình que.
Nhận xét: Từ kết quả nghiên cứu và các tài liệu tham khảo chúng em khẳng định
đây là 2 chủng ST và LB cần phân lập.
Sau khi phân lập được hai chủng thuần khiết tôi tiến hành cấy chuyền sang ống
nghiệm để tiến hành bảo quản và giữ giống.

Hình 3.3. Hình ảnh ống giống của ST. Hình 3.4. Hình ảnh ống giống của LB.
3.2. Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn ST và LB bằng phương pháp đo
mật độ quang (OD) trên máy quang phổ UV – Vis
Cách tiến hành: Cho vi khuẩn vào bình tam giác chứa 100ml môi trường dinh
dưỡng thích hợp không agar. Mẫu chuẩn là mẫu chứa môi trường mà không có vi sinh vật.
Cài đặt bước sóng cần đo là 600nm. Tiến hành đo mật độ quang lần thứ nhất của dung
dịch. Phần còn lại tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ 37
0
C và cứ sau 3 giờ thì lại lấy mẫu và đo
một lần. Kết quả khảo sát được biểu diễn trong hình 3.5.
0

0,2
0,4
0,6
0,8
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
66
72
Thời gian t (h)
Mật độ chỉ số OD
LB
ST

Hình 3.5. Đường cong sinh trưởng của 2 chủng LB và ST trong 72 giờ.
Nhận xét: - ST sinh trưởng và phát triển mạnh hơn LB trong cùng điều kiện.
- ST và LB đạt mật độ cực đại ở 54 giờ, từ đây ta lựa chọn được thời
gian lấy mẫu và ủ 2 vi khuẩn LB và ST là 54 giờ.
Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012
4
3.3. Kết quả lên men và thu nhận màng BC
Thu nhận BC ướt từ môi trường nuôi cấy được thể hiện trong hình 3.6.

Hình 3.6. Thu nhận BC ướt từ môi trường nuôi cấy.
Nhận xét: Màng BC thu được có cấu trúc sợi, rất dai và có độ chịu lực cao, đàn hồi,
rất thích hợp để cố định vi khuẩn trên giá thể của BC.
Kết quả lên men thu nhận sinh khối BC được thể hiện cụ thể trong hình 3.7.
Nhận xét: Từ kết quả trên ta chọn được thời gian thu
nhận BC từ môi trường lên men nổi là 15 ngày, nhiệt độ
là 30
0
C, nồng độ Bx là 11,5 – 12, điều chỉnh pH = 5.
Sau khi lên men thu nhận BC, tiến hành xử lý BC bằng
cách rửa sạch bằng nước sôi để nguội và sấy ở 105
0
C.

3.4. Cố định vi khuẩn ST và LB trên chất mang BC bằng phương pháp bẫy – hấp phụ
3.4.1. Khảo sát nhiệt độ ủ và thời gian ủ
Tiến hành khảo sát ở các khoảng nhiệt độ ủ ở các mốc nhiệt độ sau 26
0
C, 32
0
C,
34
0
C, 36
0
C, 38
0
C, 39
0

C, 40
0
C tương ứng với thời gian ủ cố định là 54 giờ (dựa vào kết
quả đo trong mục 3.2).
Dựa vào một số kết quả nghiên cứu khi tiến hành sấy vi sinh vật và tài liệu tham khảo
về hai chủng vi khuẩn ST và LB, nên chọn nhiệt độ sấy là
38
0
C. Kết quả thu được là chế phẩm vi khuẩn lactic cố định
trên BC được thể hiện trong hình 3.8.
Nhận xét: Từ hình 3.8 ta thấy rằng chế phẩm vi khuẩn lactic
trên BC sau khi sấy là một màng mỏng và rất tiện trong bảo
quản cũng như lấy mẫu lên men sau này.
Hình 3.8. Chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên BC.
Sau khi thu nhận được chế phẩm tương ứng với các nhiệt độ ủ thì chúng em tiến hành kiểm
tra khả năng sống sót của vi khuẩn lactic cố định trên
BC tương ứng với các nhiệt độ ủ, kết quả được thể
hiện cụ thể trong hình 3.9.
Nhận xét: - Ở 37
0
C lượng tế bào vi khuẩn trên chất
mang đạt giá trị cực đại.
- ST: 7,78*10^9 tế bào/ml, LB: 7,63*10^9 tế bào/ml.

6,4
6,6
6,8
7
7,2
7,4

7,6
7,8
8
26 32 34 36 37 38 39 40
Nhiệt độ (0C)
Mật độ tế bào (10^9 tế bào/ml)
ST
LB
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn lượng tế bào vi khuẩn
ST và LB được cố định trên chất mang BC ở các
khoảng nhiệt độ (
0
C).

0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Thời gian lê n men (ngày)
Khối lượng BC tạo thành (g)
khối lượng BC
Hình 3.7. Khối BC tạo thành ở các mốc thời gian.

Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 8 Đại học Đà Nẵng năm 2012
5
- Chọn được nhiệt độ ủ thích hợp để lượng tế bào vi khuẩn ST và LB đạt mật độ cao
nhất là 37
0
C, tương ứng với thời gian ủ là 54 giờ.
3.4.2. Kiểm tra hiệu quả của quá trình cố định trên giá thể BC
a. Kiểm tra khả năng sống sót của vi khuẩn sau quá trình cố định
Kiểm tra khả năng sống sót của chế phẩm vi khuẩn lactic trên chất mang BC, bằng
cách gieo mẫu trên môi trường dinh dưỡng thích hợp và quan sát sự sinh trưởng và phát
triển của khuẩn lạc trên đĩa petri.




Hình 3.10. Khuẩn lạc chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên chất mang BC sau khi hoạt hóa.
Kiểm tra hoạt lực của chế phẩm vi khuẩn lactic so với giống trên ống thạch nghiêng
ở thế hệ thứ nhất. Tiến hành lên men với hai mẫu:
- Mẫu 1: Chế phẩm vi khuẩn lactic cố định trên BC.
- Mẫu 2 (Mẫu đối chứng): Hai chủng vi khuẩn lactic đã phân lập trong ống
nghiệm ở thế hệ thứ nhất.
Kết quả so sánh với mẫu đối chứng được thể hiện cụ thể trong hình 3.11.
Nhận xét:
- M1 và M2: khả năng sinh acid lactic xấp xỉ bằng
nhau, sau 6 giờ bắt đầu đông tụ.
- Hoạt lực của chế phẩm vi khuẩn lactic cố định
trên BC hầu như không thay đổi gì so với trên ống
thạch nghiêng ở thế hệ thứ nhất.
Hình 3.11. Khả năng sinh acid lactic của hai mẫu.
3.5. Ứng dụng vi khuẩn cố định trên chất mang BC trong lên men sản phẩm sữa chua

3.5.1. Khảo sát khả năng sinh acid lactic phụ thuộc vào nhiệt độ và lượng chế phẩm sử
dụng
Tiến hành lên men theo quy trình công nghệ ở các khoảng nhiệt độ 26
0
C, 39
0
C và
42
0
C cùng với lượng men giống khảo sát là: 0,05 %, 0,15 %, 0,30 %. Khả năng sinh acid
lactic phụ thuộc vào lượng men giống tương ứng với các khoảng nhiệt độ trên được biểu
diễn bằng hình 3.11.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
2 4 6 7 8 9
Thời gian (h)
Hàm lượng acid lactic (%)
0,05%
0,15%
0,30%
0

0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
2 4 6 7 8
Thời gian (h)
Hàm lượng acid lactic (%)
0,05%
0,15%
0,30%
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
2 4 6 7
Thời gian (h)
Hàm lượng acid lactic (%)

0,05%
0,15%
0,30%

Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn hàm lượng acid lactic sinh ra theo thời gian ở các khoảng nhiệt độ.
1 2
ST LB
0
2
4
6
8
10
12
2 4 6 7
Thời gian (h)
Thể tích NaOH tiêu tốn (ml)
M2
M1
Nhận xét: Chế phẩm lactic cố định
trên chất mang BC sau khi hoạt hóa
lại cho khả năng sống sót rất cao.