“Đa dạng hóa các môi trƣờng sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum

1
Phần 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Thạch dừa (Nata de Coco) là một loại thức ăn tráng miệng phổ biến, có nguồn
gốc từ Philippin, được tạo ra từ sự lên men nước dừa bởi vi khuẩn Acetobacter
xylinum, và là một trong số các loại thực phẩm thương mại đầu tiên ứng dụng từ
bacterial cellulose (BC).
Thuận lợi của việc sản xuất BC theo phương pháp lên men truyền thống chính
là ưu điểm của công nghệ sản xuất vi sinh: tốc độ sinh sản nhanh, trang thiết bị đơn
giản, ít tốn mặt bằng và nhân công, tương ứng giá thành rẻ… Tuy nhiên, điểm hạn chế
của nó lại là phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu (nước dừa già), dẫn đến khó ứng dụng
sản xuất ở quy mô công nghiệp.
Xuất phát từ yêu cầu trên, tôi thực hiện đề tài “Đa dạng hóa các môi trƣờng
sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum” nhằm nghiên cứu khả
năng tạo BC trên nhiều loại môi trường khác nhau, tận dụng phế phụ liệu từ các quá
trình sản xuất thực phẩm khác.

 Mục đích của đề tài
- Tìm môi trường thay thế môi trường nước dừa già truyền thống để nuôi cấy vi
khuẩn Acetobacter xylinum
- Tìm công thức tối ưu nhất để sản xuất bacterial cellulose trên các môi trường
thay thế.

 Yêu cầu
- Thuần khiết giống và giữ giống Acetobacter xylinum
- Khảo sát và đánh giá sinh khối cellulose thô trên các môi trường:
Nước dừa già (đối chứng)
Nước dứa
Nước cốt dừa
- Khảo sát và đánh giá khả năng phát triển của Acetobacter xylinum khi thay đổi
các thành phần bổ sung.

2
Phần 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
THÍ NGHIỆM
2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian: đề tài được tiến hành từ 03/2005 đến 08/2005.
Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Công nghệ thực phẩm, trường ĐH Nông
Lâm TP. HCM
2.2 Vật liệu – hoá chất – trang thiết bị
2.2.1 Nguồn giống: giống vi khuẩn Acetobacter xylinum do phòng thí nghiệm vi sinh
khoa Công nghệ thực phẩm cung cấp
2.2.2 Nguyên liệu: nước dừa già, nước cốt dừa, nước dứa
2.2.3 Hoá chất
- Nhóm hoá chất bổ sung vào môi trường: DAP, SA, saccharose, agar, acid acetic, cao
nấm men.
- Hoá chất nhuộm Gram: Crystal violet, Fuschin, Lugol
2.2.4 Trang thiết bị: nồi hấp autoclave, tủ cấy vô trùng, kính hiển vi, tủ sấy, cân điện
tử, các dụng cụ thủy tinh, hộp nhựa…
2.2.5 Môi trƣờng dinh dƣỡng
Môi trƣờng I: môi trường hoạt hóa
Nước dừa già 1lít
Saccharose 50g
SA 8g
DAP 2g
Cao nấm men 10g
Acid acetic 5ml
Môi trƣờng II: môi trường nhân giống và giữ giống
Nước dừa già 1lít
Saccharose 20g
SA 8g

DAP 2g
Acid acetic 12ml

3
Chế độ khử trùng của môi trường hoạt hóa và môi trường nhân giống là 121
0
C,
1atm, 15 phút. Acid acetic được bổ sung sau khi nấu sôi môi trường.
Môi trƣờng thí nghiệm
- Môi trường III: môi trường nước cốt dừa, công thức môi trường được bố trí
theo 81 nghiệm thức khác nhau
- Môi trường IV: môi trường nước dứa, công thức môi trường được bố trí theo 81
nghiệm thức khác nhau
Thanh trùng bằng phương pháp nấu sôi ở 100
0
C.
2.3 Nội dung và phƣơng pháp thí nghiệm
2.3.1 Thuần khiết giống và nhân giống đã thuần khiết
Mục đích thí nghiệm: tạo ra đủ giống thuần khiết cung cấp cho quá trình lên men.
Sơ đồ thí nghiệm:

Giống của phòng thí nghiệm
Chọn khuẩn lạc thuần khiết
Cấy chuyền nhiều lần
Giống thuần khiết
Nhân giống cấp 1
(môi trường II trong ống nghiệm)
Cấy phân lập trên
môi trường thạch đĩa
Nhân giống cấp 2
(môi trường II trong chai nước biển)


Nhuộm Gram

4
Quy trình chung để tạo BC:

2.3.2 So sánh hiệu quả hoạt hóa giống bằng môi trƣờng I và môi trƣờng I có bổ
sung dung dịch Skeggs & Wright
Mục đích thí nghiệm: đánh giá xem môi trường nào giúp hoạt hóa giống tốt hơn
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại.
Nghiệm thức
NT1 NT2
Trọng lƣợng BC thô (g)


NT1: theo thành phần môi trường I
NT2: môi trường I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright
Dung dịch Skeggs & Wright: MgSO
4
.7H
2
O 40g
MnSO
4
.4H
2
O 2g
FeCl

3
0,4g
HClđ 1ml
H
2
O đến 1lít
Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) sau 8 ngày lên men ở nhiệt độ phòng.
2.3.3 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trƣờng nƣớc cốt dừa
Mục đích thí nghiệm: tìm công thức tối ưu nhất cho việc sản xuất BC trên môi trường
nước cốt dừa.
Chuẩn bị môi trường
Thanh trùng / khử trùng
Để nguội
Lên men 8 ngày ở nhiệt độ phòng
Thu lớp váng BC nổi trên bề mặt
Acid acetic Giống: 10%
Cân

5
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên 4 yếu tố với 2 lần lặp lại

Yếu tố
Tỉ lệ cơm
dừa/nƣớc (g/ml)
DAP
(%)
SA
(%)
Sacccharose
(%)

Nồng độ
1/10
1/20
1/30
0,2
0,4
0,6
0,6
0,8
1,0
2
4
6

MT

TLPL
(lần)

DAP
(%)

SA
(%)

Sac
(%)

MT

TLPL
(lần)

DAP
(%)

SA
(%)

Sac
(%)


MT

TLPL
(lần)

DAP
(%)

SA
(%)

Sac
(%)

1 10 0,2 0,6 2 28 20 0,2 0,6 2 55 30 0,2 0,6 2
2 10 0,2 0,6 4 29 20 0,2 0,6 4 56 30 0,2 0,6 4
3 10 0,2 0,6 6 30 20 0,2 0,6 6 57 30 0,2 0,6 6

4 10 0,2 0,8 2 31 20 0,2 0,8 2 58 30 0,2 0,8 2
5 10 0,2 0,8 4 32 20 0,2 0,8 4 59 30 0,2 0,8 4
6 10 0,2 0,8 6 33 20 0,2 0,8 6 60 30 0,2 0,8 6
7 10 0,2 1 2 34 20 0,2 1 2 61 30 0,2 1 2
8 10 0,2 1 4 35 20 0,2 1 4 62 30 0,2 1 4
9 10 0,2 1 6 36 20 0,2 1 6 63 30 0,2 1 6
10 10 0,4 0,6 2 37 20 0,4 0,6 2 64 30 0,4 0,6 2
11 10 0,4 0,6 4 38 20 0,4 0,6 4 65 30 0,4 0,6 4
12 10 0,4 0,6 6 39 20 0,4 0,6 6 66 30 0,4 0,6 6
13 10 0,4 0,8 2 40 20 0,4 0,8 2 67 30 0,4 0,8 2
14 10 0,4 0,8 4 41 20 0,4 0,8 4 68 30 0,4 0,8 4
15 10 0,4 0,8 6 42 20 0,4 0,8 6 69 30 0,4 0,8 6
16 10 0,4 1 2 43 20 0,4 1 2 70 30 0,4 1 2
17 10 0,4 1 4 44 20 0,4 1 4 71 30 0,4 1 4
18 10 0,4 1 6 45 20 0,4 1 6 72 30 0,4 1 6
19 10 0,6 0,6 2 46 20 0,6 0,6 2 73 30 0,6 0,6 2
20 10 0,6 0,6 4 47 20 0,6 0,6 4 74 30 0,6 0,6 4
21 10 0,6 0,6 6 48 20 0,6 0,6 6 75 30 0,6 0,6 6
22 10 0,6 0,8 2 49 20 0,6 0,8 2 76 30 0,6 0,8 2
23 10 0,6 0,8 4 50 20 0,6 0,8 4 77 30 0,6 0,8 4
24 10 0,6 0,8 6 51 20 0,6 0,8 6 78 30 0,6 0,8 6
25 10 0,6 1 2 52 20 0,6 1 2 79 30 0,6 1 2
26 10 0,6 1 4 53 20 0,6 1 4 80 30 0,6 1 4
27 10 0,6 1 6 54 20 0,6 1 6 81 30 0,6 1 6
Ghi chú: MT: môi trường
TLPL: tỷ lệ pha loãng
Sac : saccharose
Đối chứng là môi trường II. Tỷ lệ giống cấp 2 cấy vào môi trường là 10 %. Hàm lượng
acid acetic là 1,2 %. Thời gian lên men là 8 ngày ở nhiệt độ phòng.

6
Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g)
2.3.4 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trƣờng nƣớc dứa
Mục đích thí nghiệm: tìm công thức tối ưu nhất cho việc sản xuất BC trên môi trường
nước dứa.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên 4 yếu tố với 2 lần lặp lại
Yếu tố
Tỉ lệ nƣớc dứa/nƣớc
(g/ml)
DAP
(%)
SA
(%)
Saccharose
(%)
Nồng độ
1/10
1/20
1/30
0,2
0,4
0,6
0,6
0,8
1,0
2
4
6

MT

TLPL
(lần)

DAP
(%)

SA
(%)

Sac
(%)

MT

TLPL
(lần)

DAP
(%)

SA
(%)

Sac
(%)


MT

TLPL
(lần)

DAP
(%)

SA
(%)

Sac
(%)

1 10 0,2 0,6 2 28 20 0,2 0,6 2 55 30 0,2 0,6 2
2 10 0,2 0,6 4 29 20 0,2 0,6 4 56 30 0,2 0,6 4
3 10 0,2 0,6 6 30 20 0,2 0,6 6 57 30 0,2 0,6 6
4 10 0,2 0,8 2 31 20 0,2 0,8 2 58 30 0,2 0,8 2
5 10 0,2 0,8 4 32 20 0,2 0,8 4 59 30 0,2 0,8 4
6 10 0,2 0,8 6 33 20 0,2 0,8 6 60 30 0,2 0,8 6
7 10 0,2 1 2 34 20 0,2 1 2 61 30 0,2 1 2
8 10 0,2 1 4 35 20 0,2 1 4 62 30 0,2 1 4
9 10 0,2 1 6 36 20 0,2 1 6 63 30 0,2 1 6
10 10 0,4 0,6 2 37 20 0,4 0,6 2 64 30 0,4 0,6 2
11 10 0,4 0,6 4 38 20 0,4 0,6 4 65 30 0,4 0,6 4
12 10 0,4 0,6 6 39 20 0,4 0,6 6 66 30 0,4 0,6 6
13 10 0,4 0,8 2 40 20 0,4 0,8 2 67 30 0,4 0,8 2
14 10 0,4 0,8 4 41 20 0,4 0,8 4 68 30 0,4 0,8 4
15 10 0,4 0,8 6 42 20 0,4 0,8 6 69 30 0,4 0,8 6
16 10 0,4 1 2 43 20 0,4 1 2 70 30 0,4 1 2
17 10 0,4 1 4 44 20 0,4 1 4 71 30 0,4 1 4
18 10 0,4 1 6 45 20 0,4 1 6 72 30 0,4 1 6

19 10 0,6 0,6 2 46 20 0,6 0,6 2 73 30 0,6 0,6 2
20 10 0,6 0,6 4 47 20 0,6 0,6 4 74 30 0,6 0,6 4
21 10 0,6 0,6 6 48 20 0,6 0,6 6 75 30 0,6 0,6 6
22 10 0,6 0,8 2 49 20 0,6 0,8 2 76 30 0,6 0,8 2
23 10 0,6 0,8 4 50 20 0,6 0,8 4 77 30 0,6 0,8 4
24 10 0,6 0,8 6 51 20 0,6 0,8 6 78 30 0,6 0,8 6
25 10 0,6 1 2 52 20 0,6 1 2 79 30 0,6 1 2
26 10 0,6 1 4 53 20 0,6 1 4 80 30 0,6 1 4
27 10 0,6 1 6 54 20 0,6 1 6 81 30 0,6 1 6