Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn và khai thác các trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ dữ liệu metagenome hệ vi khuẩn ruột mối bậc thấp coptotermes gestroi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
***




Nguyễn Thanh Ngọc




NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN VÀ KHAI THÁC CÁC
TRÌNH TỰ DNA MÃ HÓA ENZYM THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE
TỪ DỮ LIỆU METAGENOME HỆ VI KHUẨN RUỘT MỐI BẬC THẤP
COPTOTERMES GESTROI





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2013


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
***



Nguyễn Thanh Ngọc



NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN VÀ KHAI THÁC CÁC
TRÌNH TỰ DNA MÃ HÓA ENZYM THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE
TỪ DỮ LIỆU METAGENOME HỆ VI KHUẨN RUỘT MỐI BẬC THẤP
COPTOTERMES GESTROI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS. TS. Trương Nam Hải




HÀ NỘI – 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Trương Nam Hải -
Trưởng phòng Kỹ thuật Di truyền,Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, đã tận tình
hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt thời gian qua.
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự chỉ bảo chuyên môn nhiệt
tình của TS. Đỗ Thị Huyền, sự hỗ trợ chuyên môn quý giá của NCS. Nguyễn Thị Thảo,
ThS. Lê Quỳnh Giang và TS. Nguyễn Cường cũng như sự động viên tinh thần của tập
thể cán bộ nghiên cứu tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nhân dịp hoàn thành luận văn này, tôi xin
bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới sự giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình và bạn
bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc vừa qua.
Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2013

Nguyễn Thanh Ngọc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực
và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ
trong việc thực hiện đề tài đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã
được ghi rõ nguồn gốc.

Ký tên


Nguyễn Thanh Ngọc


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


MỤC LỤC
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii
DANH MỤC CÁC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC HÌNH v
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1. Tổng quan về mối – “cỗ máy” sản xuất enzym thủy phân lignocellulose hiệu
quả 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại mối 3
1.1.2. Cấu tạo ruột mối và hệ vi sinh vật trong ruột mối 4
1.2. Lignocellulose – sinh khối phế phụ phẩm nông lâm nghiệp và hệ enzym
thủy phân lignocellulose 12
1.2.1. Cấu trúc lignocellulose 12
1.2.2. Enzym thủy phân lignocellulose 15
1.3. Metagenomics – công cụ hữu hiệu để nghiên cứu đa dạng sinh vật khu hệ
mini sinh thái và khai thác gen 20
1.3.1. Khái quát về phương pháp metagenomics 20
1.3.2. Các cách tiếp cận trong nghiên cứu metagenomics 21
1.3.3. Ứng dụng metagenomics trong nghiên cứu đa dạng sinh học và khai thác
gen 23
Chƣơng 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Vật liệu và hóa chất nghiên cứu 25
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 25
2.1.2. Hóa chất 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu 26
2.2.1. Phương pháp thu nhận ruột mối 26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


2.2.3. Phương pháp tách DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối 26
2.2.3. Tinh sạch DNA metagenome bằng kỹ thuật troughing 28
2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 28
2.2.5. Phân tích và khai thác dữ liệu DNA metagenome bằng các công cụ tin
sinh 29
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1. Tách chiết DNA metagenome hệ vi khuẩn cộng sinh trong ruột C. gestroi . 31
3.1.1. Thu nhận mẫu ruột mối C. gestroi 31
3.1.2. Tách chiết và tinh sạch DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối 32
3.2. Phân tích dữ liệu DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối C. gestroi 36
3.3. Đa dạng hệ vi khuẩn cộng sinh trong ruột mối C. gestroi 41
3.4. Khai thác các trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ dữ
liệu metagenome của hệ vi khuẩn ruột mối C. gestroi 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
64
PHỤ LỤC 65




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bp Cặp bazơ
DNA Axít deoxyribonucleic
GHF Họ Glycosyl hydrolase
ORF Khung đọc mở
PBS Đệm phosphate buffered saline
rRNA Axít ribonucleic ribosome

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu



DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Chất lượng trình tự DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối 36
Bảng 3.2: Kết quả lắp ráp tạo contig theo các thông số k-mer khác nhau 37
Bảng 3.3: Số liệu các trình tự đọc được dùng để lắp ráp contig khi sử dụng các tham số
k-mer khác nhau 38
Bảng 3.4: Kết quả so sánh trình tự DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối C. gestroi
với các ngân hàng dữ liệu genome 39
Bảng 3.5: Bảng chú giải gen từ dữ liệu metagenome hệ vi khuẩn ruột mối C. gestroi . 40
Bảng 3.6: Đa dạng loài các vi sinh vật (đã được định tên) cộng sinh trong C. gestroi . 41
Bảng 3.7: Đa dạng loài một số ngành vi khuẩn sống cộng sinh trong ruột mối C.
gestroi 45
Bảng 3.8: Số liệu về các ORF mã hóa enzym thủy phân lignocellulose có nguồn gốc từ
vi khuẩn cộng sinh trong ruột mối C. gestroi 49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ phân loại mối. 3
Hình 1.2: Cấu tạo ruột mối 4
Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc bậc hai của thành tế bào thực vật 12
Hình 1.4: Cấu trúc vi sợi và sợi cellulose và vị trí của chúng trong thành tế bào thực vật
13
Hình 1.5: Các đơn vị cấu trúc của chuỗi carbohydrate (cellulose, hemicellulose) và
lignin 14
Hình 1.6: Quy trình sản xuất cồn sinh học từ nguyên vật liệu lignocellulose. 15
Hình 1.7: Một số enzym hemicellulase tham gia vào quá trình phân hủy hemicellulose
17
Hình 1.8: Các họ enzym cellulose tham gia vào quá trình thủy phân sợi cellulose 20
Hình 3.1: Mối thợ C. gestroi trong dịch PBS lạnh và thao tác mổ mối….……………31
Hình 3.2: Ruột mối C. gestroi sau tách được giữ trong dịch PBS 31
Hình 3.3: Ảnh điện di DNA metagenome hệ vi sinh vật ruột mối 33
Hình 3.4: Ảnh điện di DNA metagenome hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối sau
tinh sạch bằng phương pháp troughing 34
Hình 3.5: Ảnh điện di lượng DNA metagenome thu được sau tinh sạch bằng phương
pháp troughing và bằng kít 35
Hình 3.6: Ảnh điện di kiểm tra độ ổn định của DNA metagenome được tinh sạch bằng
kít và phương pháp troughing 35
Hình 3.7: Ảnh điện di mẫu DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối gửi đi giải trình tự
35
Hình 3.8: Quy trình xử lý dữ liệu giải trình tự metagenome hệ vi khuẩn ruột mối 36
Hình 3.9: Cách sắp xếp lại các đoạn trình tự ngắn để tạo thành các contig 37
Hình 3.10: Đồ thị phân bố kích thước và số lượng các contig thu được 38
Hình 3.11: Đa dạng vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối C. gestroi 41
Hình 3.12: Đa dạng các ngành vi khuẩn sống cộng sinh trong ruột mối C. gestroi 43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu


Hình 3.13: Các ORF mã hóa enzym lignocellulase của hệ vi khuẩn cộng sinh trong ruột
mối C. gestroi 46
Hình 3.14: Kết quả tìm kiếm các trình tự tương đồng với các cellulase được mã hóa bởi
các ORF hoàn thiện 51
Hình 3.15: Kết quả tìm kiếm các trình tự tương đồng với các hemicellulase được mã
hóa bởi các ORF hoàn thiện 51


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nông nghiệp với khối lượng phế phụ phẩm nông nghiệp
như rơm, rạ, bã mía ước tính mỗi năm lên đến 80 - 100 triệu tấn. Lignocellulose từ các
phế phụ phẩm này là nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sản xuất năng lượng
tái sinh. Tuy nhiên, hiện nay nguồn sinh khối rất lớn này đang được nông dân xử lý
bằng cách đốt, gây lãng phí rất lớn nguồn sinh khối có sẵn và còn ảnh hưởng tiêu cực
đến môi trường sống [15]. Vì vậy, việc chuyển hóa chúng thành cồn hoặc các chất có
giá trị khác không những có ý nghĩa lớn trong việc bảo vệ môi trường sống mà còn góp
phần giải quyết nhu cầu năng lượng quốc gia, tạo nguồn thu nhập tại chỗ cho nông dân.
Ưu điểm cồn sinh học thế hệ thứ hai hay thế hệ mới (được sản xuất từ nguồn
lignocellulose phế phụ phẩm nông lâm nghiệp) là bền vững, không gây ảnh hưởng tới
an ninh lương thực như cồn sinh học thế hệ thứ nhất (được sản xuất từ việc lên men
dịch đường và tinh bột).
Cellulase và hemicellulase là các nhóm enzym chính tham gia vào quá trình
phân giải lignocellulose và thường được phân lập từ các chủng vi khuẩn nuôi cấy

được. Tuy nhiên, theo ước đoán có đến 99% vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên không
thể nuôi cấy được [7] và chúng có thể là những nguồn tổng hợp các enzym phân hủy
lignocellulose đầy tiềm năng. Do đó, các nhà khoa học hiện đang quan tâm vào việc
phân lập các enzym tham gia vào quá trình thủy phân lignocellulose từ nhóm vi khuẩn
không nuôi cấy được này nhằm tìm ra các enzym mới có thể ứng dụng vào trong quá
trình sản xuất công nghiệp. Việc khai thác gen có nguồn gốc từ vi sinh vật không nuôi
cấy được phải cần đến công cụ nghiên cứu metagenomics. Metagenomics
cho phép nghiên cứu về vi sinh vật không qua nuôi cấy trong phòng thí nghiệm
cũng như nghiên cứu sự đa dạng và các đặc tính sinh lý và di truyền của các vi sinh vật
trong môi trường tự nhiên. Ngày nay với sự ra đời và phát triển của các máy giải trình
tự thế hệ mới, việc giải trình tự toàn bộ metagenome hệ vi sinh vật có trong mẫu thu
thập đang dần trở nên chiếm ưu thế trong nghiên cứu phân tích metagenomics. Phươn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ể phân tích quần xã vi sinh vậ
.
Hiện nay, ở nước ta chưa có một nghiên cứu nào theo hướng sử dụng kỹ thuật
metagenomics để nghiên cứu và sàng lọc các enzym tham gia thủy phân lignocellulose
từ các mẫu môi trường tiềm năng (mẫu ủ rơm rạ, ruột mối hay dạ cỏ động vật nhai lại).
Trong khi đó, ở Việt Nam mối phân bố khắp mọi nơi với hơn 140 loài [81]. Mối đóng
vai trò sinh thái quan trọng trong quá trình phân giải lignocellulose từ thực vật nhờ sự
hỗ trợ tích cực của nhóm vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối. Nhóm vi sinh vật này có
khả năng tiết ra các enzym thủy phân lignocellulose hiệu quả. Do đó, hệ vi sinh vật
ruột mối được coi là nguồn dự trữ phong phú và đa dạng các enzym tham gia vào phân
hủy lignocellulose. Ứng dụng phương pháp metagenomics theo hướng phân tích dữ
liệu thu được từ việc giải toàn bộ trình tự metagenome hệ vi khuẩn ruột mối, chúng tôi
hi vọng có thể khai thác được các enzym thủy phân lignocellulose của hệ vi khuẩn
sống trong ruột mối. Việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn và
khai thác các trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ dữ liệu

metagenome hệ vi khuẩn ruột mối” tại phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ
sinh học sẽ mở ra một hướng phân lập gen mới tại Việt Nam và có thể sẽ cho phép
phân lập được các dòng enzym mới có khả năng thủy phân lignocellulose hiệu quả.
Nghiên cứu được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Sàng lọc các enzym tham gia vào các quá trình
phân giải cellulose, hemicellulose bằng kỹ thuật Metagenomics” và đề tài hợp tác quốc
tế về Khoa học và Công nghệ theo Nghị định thư với Nhật Bản “Phân lập hệ gen mã
hóa enzyme thủy phân lignocellulose từ khu hệ vi sinh vật ruột mối Việt Nam bằng kỹ
thuật metagenomics”.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về mối – “cỗ máy” sản xuất enzym thủy phân lignocellulose hiệu
quả
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại mối
Mối được phân loại là bộ Cánh đều (danh pháp khoa học: Isoptera), thuộc lớp
Côn trùng (Insecta). Dựa trên chứng cứ DNA, một số nhà khoa học cho rằng mối có
quan hệ họ hàng gần gũi nhất với các loài gián ăn gỗ (chi Cryptocercus) [87]. Đến nay,
trên thế giới đã biết hơn 2700 loài mối và xếp vào 7 họ của bộ cánh đều [2], trong đó
có một họ duy nhất Termitidae là mối bậc cao; còn lại là mối bậc thấp (Hình 1.1).

Hình 1.1: Sơ đồ phân loại mối. Các con số chỉ số lượng giống/loài trong từng họ mối
khác nhau [5].
Ở Việt Nam mối phân bố khắp mọi nơi. Trong các loài mối Việt Nam,
Coptotermes là giống mối đáng chú ý nhất vì chúng là loài mối ăn gỗ rất phổ biến,
thường phá hoại các công trình ở Việt Nam. Do có tính phổ biến và phân bố trên diện
rộng, nên việc thu mẫu loài mối này có nhiều thuận lợi hơn so với các loài mối khác.
Mối thợ có kích thước nhỏ và chiếm số đông (70 – 80% trong đàn mối), gánh
vác mọi công việc trong vương quốc mối như kiếm và chế biến thức ăn, xây tổ, làm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

đường, chuyển trứng, nuôi mối con và hút nước. Vì vậy, ruột mối thợ có khả năng
chứa các enzym và các vi sinh vật sản xuất các enzym thủy phân lignocellulose.
1.1.2. Cấu tạo ruột mối và hệ vi sinh vật trong ruột mối
1.1.2.1. Cấu tạo ruột mối
, gồm
a (Hình 1.2 – l gh
và tuyến nước bọt – là nơi tiết ra một số enzym endoglucanase của mối.
hình ống với môi trường hiếu khí, là nơi sản xuất endoglucanase có nguồn
gốc từ mối ở các loài mối bậc cao và diễn ra một vài sự thủy phân lignocellulose
sau có dạ cỏ, thường là một bể lên men kỵ khí
vật. Ở đây diễn ra phần lớn sự thủy phân cellulose và các quá trình lên men các sản
phẩm từ sự thủy phân đó [71].






Hình 1.2: Cấu tạo ruột mối, gồm có ruột trước (foregut), ruột giữa (midgut) và ruột
sau (hindgut) [71].
1.1.2.2. Đa dạng hệ vi sinh vật ruột mối
Năm 1856, Lespes là người đầu tiên miêu tả sự tồn tại của vi sinh vật trong ruột
mối. Tuy nhiên, việc nghiên cứu mối quan hệ cộng sinh giữa mối và vi sinh vật chỉ
được bắt đầu từ đầu thế kỷ 20 [36]. Năm 1923, một thí nghiệm nổi tiếng của Cleveland
đã chứng minh được mối không thể tồn tại trên gỗ nếu không có sự hỗ trợ của vi
sinh vật [13]. Chất kháng sinh làm thay đổi khu hệ mini sinh thái của vi khuẩn trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ruột mối, phá vỡ sự tương tác cộng sinh giữa vi khuẩn và vật chủ, qua đó dẫn tới chu
kỳ sống và khả năng sinh sản của mối bị giảm [67].
Trong mỗi tổ mối, mối thợ chịu trách nhiệm tìm kiếm thức ăn, tiêu hóa và nuôi
dưỡng cả đàn mối. Mối thợ ăn tất cả các loại thức ăn là gỗ mà thành phần chủ yếu là
lignocellulose. Trong đường tiêu hóa của mối thợ, cellulose được chuyển hóa thành các
chất dinh dưỡng nhờ hệ enzym của ruột mối và hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối,
động vật nguyên sinh, nấm, vi khuẩn và cổ khuẩn. Dựa trên sự có mặt hay
vắng mặt của động vật nguyên sinh trong ruột mối mà mối được chia làm hai nhóm
mối bậc thấp và mối bậc cao [89]. Khoảng 10
6
đến 10
8
tế bào nhân sơ tồn tại trong mỗi
ruột mối. Vi khuẩn và cổ khuẩn được tìm thấy trong cả mối bậc thấp và mối bậc cao,
trong đó phần lớn là vi khuẩn (trên 90%). Hầu hết vi khuẩn ruột mối đặc trưng cho
từng loài mối. Thành phần quần xã vi khuẩn rất giống nhau giữa các loài mối trong
cùng một chi, nhưng lại thay đổi mạnh giữa hai chi mối [42]. Động vật nguyên sinh chỉ
có ở ruột mối bậc thấp, từ 10
3
đến 10
5
cá thể, 90% hoặc hơn trong số đó chủ yếu tập
trung ở ruột sau của mối. Đồng thời, động vật nguyên sinh còn là nơi sinh sống của rất
nhiều loài vi sinh vật nhân sơ, bao gồm cả cộng sinh nội bào và cộng sinh ngoại bào
[11].
loài vi khuẩn
[42]. Khoảng 440 loài động vật nguyên
sinh không có ty thể, thuộc các bộ Trichomonadida, Hypermastigida và Oxymonadida

đã được tìm thấy trong ruột mối bậc thấp ăn gỗ [17].Có vẻ như hệ vi sinh ruột mối, bao
gồm vi khuẩn và động vật nguyên sinh, là những loài cộng sinh đặc trưng cùng tiến
hóa với loài mối chủ [42].
Quần xã vi sinh vật trong ruột mối có sự đa dạng rất cao. Nhiều nghiên cứu về
hệ vi khuẩn trong ruột mối được thực hiện thông qua các phương pháp truyền thống
dựa trên việc nuôi cấy và phân lập vi sinh vật ở trong phòng thí nghiệm. Các vi khuẩn
kỵ khí, đặc biệt là Staphylococcus và Bacillus, là những vi khuẩn có mặt nhiều nhất
trong cả ruột mối bậc thấp và bậc cao [41]. Serratia marcescenes, Enterobacter

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

aerogenes, Enterobacter cloacae và Citrobacter farmeri đã được phân lập từ
Coptotermes formosanus [6]; trong khi đó E. aerogenes, E. cloacae và Clavibacter
agropyri đã được chứng minh là tồn tại trong ruột mối C. curvignathus [65]. Tương tự,
Husseneder và cộng sự cũng đã phân lập từ C. formosanus 25 chủng vi khuẩn, thuộc
các họ Enterobacteriaceae, bộ Bacteroidales và Lactobacillales [35]. Trùng roi là sinh
vật đơn bào đặc trưng chỉ có ở ruột mối bậc thấp. Trong khi Hodotermopsis japonica
có chứa tới 19 loài trùng roi khác nhau ở trong đường ruột thì chỉ có 3 loài động vật
nguyên sinh tồn tại trong ruột mối C. formosanus [37]. Tuy nhiên, hầu hết các vi sinh
vật trong ruột mối là không nuôi cấy được, do đó số loài vi sinh vật trong ruột mối xác
định được theo phương pháp truyền thống này là không nhiều, cho nên sự đa dạng về
hệ vi sinh vật trong ruột mối chưa được đánh giá chính xác.
Gần đây, các nghiên cứu không thông qua nuôi cấy đã tiết lộ nhiều hơn về sự đa
dạng vi sinh vật ruột mối, đặc biệt là đa dạng vi khuẩn. Bằng phân tích trình tự 16S
rRNA của vi khuẩn được khuếch đại từ metagenome hệ vi sinh ruột mối, tổng số hơn
1500 phylotype (tương đương với loài, tuy nhiên không nuôi cấy và định tên được, chỉ
có thể xác định được thông qua trình tự 16S rRNA) của vi khuẩn đã được phân tích và
được phân loại vào 24 nhóm ngành khác nhau. Phần lớn chúng chưa bao giờ được tìm
thấy ở trong các môi trường sống khác và cho thấy độ tương đồng thấp với các chủng
vi khuẩn nuôi cấy được [32]. Hongoh và cộng sự (2006) đã xác định được vi khuẩn

ngành Fibrobacteres (chiếm khoảng 10%) cùng với vi khuẩn thuộc bộ Bacteroidales và
Clostridiales chỉ đứng sau chi Treponema về độ đông đúc trong đường ruột của mối
Microcerotermes [34]. Spirochaetes, đặc biệt là chi Treponema và Fibrobacteres cũng
là hai nhóm vi khuẩn đông đảo nhất trong ruột mối bậc cao ăn gỗ Nasutitermes
corniger [28] và N. ephratae [88], chiếm gần 90% quần xã vi khuẩn trong ruột mối.
Như vậy, nhóm vi khuẩn Fibrobacteres chiếm ưu thế thứ hai trong ruột của mối bậc
cao chỉ ăn gỗ [32]. Trong khi đó, ruột mối Amitermes wheeleri, thường ăn không chỉ
gỗ, mà còn cỏ chết, cây bụi và phân động vật ăn cỏ, lại chứa tới 47% vi khuẩn từ ngành
Firmicutes (đặc biệt là Clostridia) và 25% vi khuẩn nhóm Spirochaetes. Synergistetes

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

và Deltaproteobacteria cũng được tìm thấy với số lượng tương đối, nhưng
Fibrobacteres thì lại có mặt rất ít ở trong loài mối bậc cao này [28].
Trong một ruột mối bậc thấp R. speratus, gần 700 phylotype khác nhau thuộc
các ngành Spirochaetes, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Proteobacteria,
Endomicrobia, Planctomycetes, Verrucomicrobia, Cyanobacteria, Acidobacteria và các
phylum hiếm khác đã được tìm thấy. Spirochaetes chiếm ưu thế ở ruột sau của mối,
tiếp đến là vi khuẩn bộ Bacteroidales, Clostridiales và TG 1 (Termite Group 1) chỉ
chiếm khoảng 10%. Gần 90% các phylotype là các loài chưa biết [33]. Ruột mối bậc
thấp R. flavipes có chứa vi khuẩn của cả 6 ngành lớn, đó là Proteobacteria,
Spirochaetes, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria và Endomicrobia [19]. Dựa
trên thư viện thiết lập từ sản phẩm PCR khuếch đại gen ribosome 16S, Shinzato và
cộng sự đã xác định được phần lớn (94%) các vi khuẩn trong ruột mối C. formosanus
thuộc về các nhóm Bacteroidales, Spirochaetes, Clostridiales, Mycoplasmatales,
Bacillales và Lactobacillales. Một số ít thì thuộc nhóm Actinobacteria, Proteobacteria,
Planctomycetes, Verrucomicrobia và Synergistes. Vi khuẩn thuộc bộ Bacteroideales
chiếm ưu thế nhất, tới 70% trong hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối [74]. Cũng
bằng phương pháp tiếp cận này, kết quả tương tự cũng đã được công bố trong nghiên
cứu của Husseneder và cộng sự, tuy nhiên kết quả này khác hẳn so với các vi khuẩn

được phân lập bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống từ cùng một loài mối [35].
Phương pháp metatranscriptomics đã cho thấy, động vật nguyên sinh chiếm tới
78% hệ vi sinh đường ruột C. formosanus. Trong khi đó, vi khuẩn chỉ chiếm 12,6% số
lượng vi sinh vật sống trong ruột mối C. formosanus [90]. Số phylotype CfPt 1-2
(Candidatus Azobacteroides Pseudotrichonymphae), thuộc bộ Bacteroidales được xác
định là chiếm tới 2/3 số tế bào nhân sơ trong ruột mối C. formosanus [53].
Mỗi một ruột mối đơn có thể chứa tới hàng trăm loài vi khuẩn khác nhau. Tuy
nhiên, phần lớn các loài vi khuẩn này lại không thể nuôi cấy được [58]. Ruột mối chứa
các loài vi khuẩn từ 15 ngành khác nhau. Spirochaetes là nhóm vi khuẩn lớn nhất, cả
về mật độ lẫn số lượng loài, tồn tại trong ruột của phần lớn mối bậc thấp ăn gỗ, với

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

phần lớn vi khuẩn thuộc chi Treponema [11]. Trong một số loài mối, xoắn khuẩn có
thể chiếm tới 50% số lượng vi sinh vật trong ruột sau của mối [60]. Ngành vi khuẩn
phong phú thứ hai trong ruột mối bậc thấp là Bacteroidetes và Firmicutes, chủ yếu tập
trung trong hai bộ Bacteroidales và Clostridiales. Proteobacteria và Actinobacteria đôi
khi cũng xuất hiện trong ruột mối với số lượng đáng kể [11, 32]. Ngược lại, nhóm vi
khuẩn TG 3 và vi khuẩn thuộc ngành Fibrobacteres lại là những nhóm ưu thế thứ hai
trong ruột của mối ăn gỗ bậc cao [32].
Trong khi một số loài vi khuẩn ưu thích sống trên thành ruột mối, nhiều loài
khác, đặc biệt thuộc ngành Bacteroidetes, lại là sinh vật cộng sinh đặc trưng cho trùng
roi sống trong ruột mối. Nhóm vi khuẩn cộng sinh nội bào động vật nguyên sinh trong
ruột mối được lần đầu phát hiện vào năm 1996 bởi Ohkuma và Kudo, và được xếp vào
nhóm TG 1 [59] hay Endomicrobia, ngành Elusimicrobia. Vi khuẩn Endomicrobia xuất
hiện trong rất nhiều trùng roi và chiếm ưu thế trong ruột mối bậc thấp. Trong ruột mối
C. formosanus, số lượng vi khuẩn cộng sinh nội bào với trùng roi Pseudotrichonympha
grassii, thuộc nhóm Bacteroidales, chiếm tới 70% tế bào vi khuẩn và nhiều hơn cả
xoắn khuẩn có mặt trong ruột mối [53]. Vi khuẩn cộng sinh trong cơ thể trùng roi
Trychonympha có thể chiếm một số lượng đáng kể trong hệ vi khuẩn cộng sinh trong

ruột sau của mối [58].
Trong số các loài cổ khuẩn, cổ khuẩn sản sinh methane (methanogen) là loài
hay được tìm thấy nhất ở trong ruột mối [32]. Chúng sống trong ruột sau của hầu hết
các loài mối, tuy nhiên chỉ chiếm 1 – 2% tổng số hệ vi sinh vật nhân sơ của ruột mối.
Thành phần loài cổ khuẩn trong ruột mối bậc cao rất đa dạng, gồm nhiều đại diện của
ba bộ Methanobacteriales, Methanomicrobiales, Methanosarcinales và một số nhóm cổ
khuẩn không nuôi cấy được. Ngược lại, ở ruột mối bậc thấp, cổ khuẩn kém phong phú
hơn, chủ yếu thuộc chi Methanobrevibacter, bộ Methanobacteriales [10]. Ba chủng
thuộc chi Methanobrevibacter đã được phân lập từ mối R. flavipes và chúng là những
chủng duy nhất có thể phân lập được. Các chủng cổ khuẩn này được tìm thấy trên biểu
mô ruột mối cũng như trong cơ thể một số động vật nguyên sinh sống cộng sinh trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ruột mối như Dinenympha parva và Spirotrichonympha leidyi [32]. Trong nhiều loài
mối, nhiều cổ khuẩn thuộc chi Methanobrevibacter không thể nuôi cấy được và chúng
thường có mối quan hệ cộng sinh chặt chẽ với trùng roi trong ruột mối [11].
Những loài mối khác nhau có thể chứa các loài vi khuẩn khác nhau với cấu trúc
quần xã đặc trưng cho từng loài mối đó. Những quần xã vi khuẩn này thường rất bền
vững trong cơ thể vật chủ, và đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa
lignocellulose và dinh dưỡng của cơ thể chủ [11]. Mặc dù một số nghiên cứu về hệ vi
sinh vật ruột mối C. formosanus đã được tiến hành, hiện vẫn chưa có bất kỳ một
nghiên cứu nào đánh giá về tính đa dạng quần xã vi sinh vật, trong đó có vi khuẩn,
sống trong ruột mối C. gestroi, một loài mối ăn gỗ rất phổ biến ở châu Á cũng như ở
Việt Nam, có quan hệ họ hàng gần gũi với C. formosanus.
1.1.2.3. Enzym thủy phân lignocellulose từ hệ vi sinh vật ruột mối
Phần lớn mối bậc thấp chỉ ăn gỗ, trong khi đó mối bậc cao ngoài ăn gỗ, chúng
có thể ăn cỏ, rơm, địa y và chất mùn có trong đất [32]. Hệ vi sinh vật cộng sinh trong
ruột mối đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa lignocellulose trong nguồn thức ăn
của mối [11]. Ở mối bậc cao, phần lớn enzym thủy phân cellulose đều được tiết ra bởi

tế bào biểu mô ruột giữa và tuyến nước bọt của mối [9]. Tuy nhiên, ở một số loài,
enzym thủy phân cellulose (như exoglucanase, endoglucanase và β-glucosidase) và
hemicellulose (như xylanase) có thể được tiết ra bởi các loài nấm thuộc chi
Termitomyces sống trong ruột mối [64]. Còn ở mối bậc cao N. takasagoensis, phần lớn
enzym lignocellulase ở ruột trước và ruột giữa được tiết từ tế bào ruột mối, còn ở ruột
sau các enzym thủy phân cellulose, hemicellulose lại được tiết từ các vi khuẩn cộng
sinh trong ruột [71, 80].
Bằng phương pháp metagenomics, 4 nhóm gen glycosyl hydrolase (GHF 5, 8,
10 và 11) đã được tìm thấy ở trong hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối bậc cao
Microcerotermes [52] và N. cornige [28]. Không có gen phân hủy lignin nào được tìm
thấy trong N. corniger. GHF 5 (cellulase) và GHF 11 (hemicellulase) được biểu hiện
nhiều nhất trong quần xã vi sinh vật của hai loài mối N. corniger và A. wheeleri khi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

nghiên cứu metatranscriptomics của chúng [28]. Từ dữ liệu metagenome hệ vi sinh
ruột mối bậc cao N. epharatae, nhiều gen của vi khuẩn sống trong ruột mối đã được
chứng minh là sản xuất ra enzym có hoạt tính cellulase và xylanase từ 45 nhóm GHF
khác nhau. Hơn 100 đoạn gen liên quan tới sự thủy phân cellulose đã được xác định,
tương ứng với các domain xúc tác (catalytic domain) của cellulase,
cellobiose/cellodextrin phosphorylase, endoglucanase/ arabinofuranosidase và
endoglucanase. Tuy nhiên, các đoạn gen tương ứng với domain xúc tác của
endoglucanase và cellobiohydrolase, hai enzym cellulase quan trọng của hệ vi khuẩn,
thì lại không có trong dữ liệu metagenome này. Gần 100 đoạn gen liên quan tới các
domain xúc tác của enzym hemicellulase như endoxylanase, xylanase, mannanase và
xylosidase/arabinanase cũng đã được xác định [88].
Trong ruột mối bậc thấp, động vật nguyên sinh lại là nguồn sản xuất enzym
phân hủy cellulose chủ yếu [64]. Trùng roi Parabasalia sống trong ruột mối đã được
chứng minh là có khả năng sản xuất exocellulobiohydrolase và endoglucanase, cần
thiết để phân hủy hiệu quả cellulose tinh thể [11]. Gen cellulase được phân lập từ trùng

roi Pseudotrichonympha grassii sống trong ruột C. formosanus [50]. Hệ động vật
nguyên sinh của C. lacteus lại có khả năng sản xuất β-1,4-glucosidase, endo-β-1,4-
glucanase và exo-β-1,4-glucosidase [30]. Ở ruột một số loài mối như Mastotermes
darwiniensis, Hodotermopsis sjoestedti, Neotermes koshunensis và R. speratus, động
vật nguyên sinh có khả năng tiết các enzym GHF 5 và 7, trong khi GHF 10 và 45 thì
được sản xuất bởi vi khuẩn. Những enzym này gồm có cellulase (endoglucanase và
cellobiohydrolase) và hemicellulase. Enzym GHF 5 và 7 cũng đã được tìm thấy ở hệ vi
sinh vật cộng sinh của C. formosanus [79]. Trichomitopsis termopsidis sống trong ruột
mối Zootermopsis có thể tiêu hóa được cả cellulose tinh thể lẫn xylan [57].
Ở mối bậc thấp như R. flavipes, enzym thủy phân lignocellulose chủ yếu được
tiết ra từ động vật nguyên sinh, tuy nhiên vẫn có 18% cellulase, 31% hemicellulase,
57% chitinase và 13% alpha-carboxylhydrolase là có nguồn gốc từ vi khuẩn sống trong
ruột sau của mối [76]. Trong khi đó, khi nghiên cứu metagenome của hệ vi sinh vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

cộng sinh trong R. speratus, rất nhiều gen cellulase thuộc GHF 3, 5, 7, 8, 10, 11, 26, 43
và 45 đã được xác định; nhưng không gen nào mã hóa cho lignase được tìm thấy [78].
Một số nghiên cứu đã phân lập được một vài gen đơn lẻ mã hóa enzym thủy
phân lignocellulose từ vi khuẩn ruột mối nhưng chưa có nghiên cứu tổng thể, hệ thống
về các vi khuẩn sinh enzym thủy phân lignocellulose có trong ruột mối. Gen mã hóa
cellulase kích thước 2,25 kb đã được phân lập từ Enterobaterloacase trong mối
Heterotermes indicola [84], còn enzym carboxymethyl cellulase được sinh ra từ
Bacillus cereus và Serratia marcescens trong mối R. hesperus [77]. Các vi khuẩn như
Dyella sp, Chryseobacterium sp và Bacillus được phân lập từ ruột mối R. speratus có
khả năng sản xuất enzym endo-beta-1,4-glucanase [12].
Năm 2011, hai loài vi khuẩn thuộc họ Bacillus sống cộng sinh trong ruột mối C.
formosanus được xác định là có khả năng sinh ra các enzym endocellulase [45]. Năm
2012, nghiên cứu metatranscriptome trên đối tượng mRNA của quần thể vi sinh vật
sống trong ruột mối C. formosanus đã cho bức tranh tổng thể hơn về các loại enzym

thủy phân lignocellulose sinh ra từ mối, vi khuẩn và động vật nguyên sinh. Từ 223.477
trình tự nhận được, nhóm nghiên cứu đã khai thác được 118 trình tự mRNA mã hóa
cho các enzym thuộc 18 GHF khác nhau. Trong đó, 39 trình tự được cho là có nguồn
gốc từ vi khuẩn, 3 trình tự từ mối, 72 trình tự từ động vật đơn bào và 4 trình tự từ nấm.
Như vậy, gen mã hóa enzym này có nguồn gốc từ vi khuẩn chiếm khoảng 33% [90].
Tóm lại, hiện nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá một cách đầy đủ về hệ vi
sinh vật có trong ruột mối và các enzym thủy phân lignocellulose được sản xuất bởi
chúng. Metagenomics là phương pháp hữu hiệu để khảo sát sự đa dạng hệ vi sinh vật
cũng như các enzym lignocellulase trong ruột mối [32]. Tuy nhiên, cho tới nay chưa có
nghiên cứu nào về sự đa dạng vi sinh vật cũng như các enzym được sản xuất bởi hệ vi
sinh vật sống trong ruột mối C. gestroi được thực hiện. Vì vậy, những hiểu biết về
quần xã vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột loài mối này còn rất hạn chế.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.2. Lignocellulose – sinh khối phế phụ phẩm nông lâm nghiệp và hệ enzym
thủy phân lignocellulose
1.2.1. Cấu trúc lignocellulose
Lignocellulose là thành phần chính có trong gỗ và phế phụ phẩm nông nghiệp
như rơm rạ, vỏ trấu, lõi ngô, cỏ kê Lignocellulose cấu tạo chủ yếu từ cellulose (38 –
50%), hemicellulose (23 – 32%), lignin (15 – 25%) và một phần nhỏ là tro và chất
khoáng [22]. Ba thành phần này của lignocellulose cấu thành nên cấu trúc bậc hai của
thành tế bào thực vật (Hình 1.3).
Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc bậc hai của thành tế bào thực vật [66].
1.2.1.1. Cellulose
Cellulose ột polymer mạch thẳ (C
6
H
10
O

5
)
n
β-D-glucose -
. Trong cấu trúc lignocellulose, các chuỗi
cellulose sắp xếp song song và liên kết với nhau thông qua liên kết hydro tạo nên cấu
trúc vi sợi. Các vi sợi liên kết lại với nhau tạo nên sợi cellulose, hay cấu trúc tinh thể

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

của cellulose (Hình 1.4) [25].
Hình 1.4: Cấu trúc vi sợi và sợi cellulose và vị trí của chúng trong thành tế bào
thực vật [25].
Hình 1.5: Các đơn vị cấu trúc của chuỗi carbohydrate (cellulose, hemicellulose)
(trái) và lignin (phải) [71].
Cellulose là hợp chất hữu cơ phong phú nhất trong hệ sinh quyển trái đất. Nó có
mặt ở khắp mọi nơi, từ thực vật bậc thấp (tảo, nấm, nấm mốc) tới thực vật bậc cao, và
cả trong động vật biển không xương sống và vi khuẩn [56]. Ở hệ thực vật, cellulose là
thành phần chính tạo nên thành tế bào, chiếm 30 – 50% sinh khối thành tế bào thực vật.
Dựa vào số lượng liên kết hydro giữa các đơn phân và giữa các phân tử cellulose, cấu
trúc cellulose ở thành tế bào thực vật được phân thành 2 dạng là cấu trúc vô định hình
và cấu trúc tinh thể. Cấu trúc tinh thể cellulose có thể chiếm tới 65% thành phần
cellulose trong gỗ [68].
1.2.1.2. Hemicellulose
Hemicellulose là polysaccharide dị hợp có độ phân nhánh cao, cấu tạo chủ yếu
bởi các phân tử đường 5 carbon (xylose, arabinose), đường 6 carbon (mannose,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

galactose, glucose) và một số axít đường (Hình 1.5). Hemicellulose cấu tạo từ

như xylan (đơn phân là xylose), xyloglucan (đơn phân là -
-glucose), glucomannan (đơn phân là - -mannose),
galactoglucomannan (đơn phân là D-glactose, - -
arabinogalactan (đơn phân là - ).
20 – ủ [38]. Xylan là thành phần
hemicellulose chủ yếu trong nguyên vật liệu gỗ rơm rạ; trong khi
glucomannan lại chiếm chủ đạo trong nguyên vật liệu gỗ [44]. Đặc biệt trong
rơm, xylan chiếm 30% khối lượng tổng.
1.2.1.3. Lignin
Lignin là một polymer gồm các mạch phenylpropanoid phức tạp được cấu
thành từ các đơn vị phenylpropene và có cấu trúc không đồng nhất. Các đơn vị cấu trúc
điển hình của lignin là: guaiacyl, trans-coniferyl alcohol; syringyl, trans-sinapyl
alcohol; p-hydroxylphenyl và trans-p-courmary alcohol (Hình 1.7). Do có cấu trúc
không đồng nhất gồm nhiều vòng thơm nên việc phân hủy sinh học lignin cần đòi hỏi
hệ enzym oxy hóa mạnh như ligninase và manganese peroxidase [4]. Các enzym phân
giải lignin có vai trò quan trọng trong chu trình vận chuyển cacbon trên trái đất.
Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực
vật, liên kết chặt chẽ với cellulose và hemicellulose. Lignin liên kết hóa trị với
hemicellulose và liên kết chéo với các polysaccharide khác, tạo nên độ bền cơ học ở
thành tế bào thực vật; đồng thời kết nối các tế bào thực vật với nhau tạo thành cấu trúc
định hình ở thực vật [21].
Trong dinh dưỡng động vật, lignin không bị tiêu hóa bởi enzym của cơ thể vật
chủ. Lignin còn liên kết với nhiều polysaccharide và protein màng tế bào cản trở quá
trình tiêu hóa các hợp chất trong gỗ. Gỗ, cỏ khô và rơm rất giàu lignin nên tỷ lệ tiêu
hóa thấp trừ khi được xử lý hóa học làm cho các liên kết giữa lignin với các
carbohydrate khác bị bẻ gãy [1].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.2.2. Enzym thủy phân lignocellulose

Trong nguyên vật liệu lignocellulose như rơm rạ, cellulose và hemicellulose
chiếm khoảng 70% và là nguồn cơ chất chủ yếu cho quá trình sản xuất cồn sinh học thế
hệ thứ hai. Do có cấu trúc phức tạp, quá trình sản xuất cồn sinh học từ lignocellulose
đòi hỏi ít nhất bốn công đoạn là 1) tiền xử lý để phá vỡ cấu trúc lignin, giải phóng
cellulose và hemicellulose; 2) thủy phân cellulose và hemicellulose bằng enzym
cellulase và hemicellulase để tạo đường đơn; 3) lên men tạo sản phẩm và 4) chưng cất
sản phẩm (Hình 1.6) [22].

Hình 1.6: Quy trình sản xuất cồn sinh học từ nguyên vật liệu lignocelluloses [91].
1.2.2.1. Các enzym tham gia tiền xử lý
Phân hủy lignin là bước đầu tiên trong quá trình thủy phân lignocellulose, tạo
điều kiện cho các enzym cellulase và hemicellulase tiếp cận và thủy phân các chuỗi
cellulose và hemicellulose thành đường đơn [71]. Để phá vỡ cấu trúc của lignin, thông
thường người ta sử dụng cả hai biện pháp cơ học (cắt và nghiền nhỏ, xử lý ở nhiệt độ