Báo cáo nghiên cứu khoa học: " NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DARBEPOETINE ALPHA TRÊN ĐỘNG HỌC CỦA CYTOKINE VIÊM TRONG NHIỄM TRÙNG HUYẾT THỰC NGHIỆM" pot

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008
173
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DARBEPOETINE
ALPHA TRÊN ĐỘNG HỌC CỦA CYTOKINE VIÊM
TRONG NHIỄM TRÙNG HUYẾT THỰC NGHIỆM
A STUDY ON THE EFFECTS OF DARBEPOETIN ALPHA ON INETICS
OF PROINFLAMMATORY CYTOKINES IN EXPERIMENTAL SEPSIS

LÊ MINH KHÔI
Khoa Y Dược, Đại Học Đà Nẵng

TÓM TẮT
Đáp ứng viêm toàn thể trong nhiễm trùng huyết (NTH) đóng vai trò quan trọng trong
bệnh sinh của hội chứng rối loạn chức năng đa cơ quan (MODS) và tỉ lệ tử vong cao.
TNFα và IL -6 là những cytokine viêm quan trọng nhất của đáp ứng viêm toàn thể .
Nghiên cứu thực nghiệm của chúng tôi cho thấy darbepoetine alpha (DPO), một chất
đồng đẳng của erythropoietin, có khả năng làm giảm đáng kể nồng độ của cả TNFα và
IL-6 từ thời điểm rất sớm sau khi được gây NTH bằng D -
galactosamin/lipopolysaccharide (Gal-LPS). Hoạt độ của các men gan cũng như các
chỉ điểm tổn thương tế bào cũng giảm rõ trong các nhóm chuột NTH được điều trị bằng
DPO. Như vậy, DPO có tác động làm giảm phản ứng viêm toàn thể và làm giảm tổn
thương cơ quan trong NTH thực nghiệm.
ABSTRACT

The systemic inflammatory response syndrome (SIRS) which occurs during sepsis
plays a critical role in pathogenesis of the Multiple Organ Dysfunction Syndrome
(MODS) and high mortality. TNFα and IL-6 are the most important proinflammatory
cytokines causing SIRS. The present study showed for the first time that intravenous
DPO, an analogue of erythropoietin, was capable to significantly reduce concentrations
of both TNFα and IL-6 at very early time points after induction of sepsis by Gal-LPS.
Activities of liver transaminases and other enzymes, which are markers of cellular

injury, were also clearly lower in the septic mice treated with DPO. Thus, DPO was
effective in attenuating the SIRS and minimizing organ injury during experimental
sepsis.

1. Đặt vấn đề
Nhiễm trùng huyết nặng là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu
ở bệnh nhân điều trị tại các đơn vị chăm sóc tích cực. Ở Hoa Kỳ, hằng năm có đến 750
000 bệnh nhân nhập viện vì NTH nặng có tỷ lệ tử vong lên đến 28,6% với chi phí điều
trị khoảng 16,7 tỷ đô la Mỹ [1]. Nhiều nước châu Âu khác cũng công bố những con số
rất đáng quan ngại về tỉ lệ mắc bệnh, tỉ lệ tử vong cao và gánh nặng chi phí do NTH [3],
[4], [15]. Nguyên nhân trực tiếp gây tử vong của NTH là MODS.
Bản chất sinh lý bệnh của NTH là một phản ứng viêm quá mức không thể kiểm
soát được [5]. Trong mạng lưới tương tác cực kỳ phức tạp của một loạt các cytokine thì
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008
174
yếu tố gây hoại tử khối u alpha (TNFα) đóng vai trò nhạc trưởng [ 2]. Bên cạnh đó,
interleukine-6 (IL-6) cũng là một cytokine đóng vai trò quan trọng trong bệnh sinh của
NTH [14]. Vì vậy, hạn chế sự phóng thích của TNFα và IL-6 được xem là có khả năng
làm giảm mức độ nặng của NTH, ngăn ngừa diễn tiến đến MODS và nhờ đó hạ thấp tỉ
lệ tử vong.
Gần đây, người ta phát hiện rằng darbepoetin alpha (DPO), một chất đồng đẳng
của erythropoietin, bên cạnh chức năng tạo máu còn có những tác động sinh lý khác như
ức chế chết tế bào lập trình, ức chế hoại tử và làm dịu phản ứng viêm.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác động của DPO
lên động học của TNFα và IL-6 trong NTH thực nghiệm.
2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, thực hiện tại Vi ện Phẫu Thuật Thực
Nghiệm, Đại học Rostock, CHLB Đức. Chuột C57BL/6 từ 8-12 tuần tuổi có trọng
lượng cơ thể xấp xỉ 20g được chia đều thành 4 nhóm, mỗi nhóm 7 con. Nhóm thứ nhất
gọi là nhóm chứng chỉ nhận một mũi tiêm 0,4ml dung dịch NaCl 9‰ 6 giờ trước khi

mổ (control). Ba nhóm còn lại đều được tiêm 720 mg/kg D -galactosamin (Gal) và 10
μg/kg lipopolysaccharide (LPS) E coli type huyết thanh 0128:B12 (Sigma-Aldrich,
Taufkirchen, Đức) 6 giờ trước khi mổ để gây NTH thực nghiệm. Trong đó, nhóm thứ
hai là nhóm tổn thương gan không được điều trị gì (Gal-LPS). Nhóm thứ ba được tiêm
DPO 10 μg/kg (Aranesp

; Amgen Europe, Breda, Hà Lan) qua tĩnh mạch sau hốc mắt
24 giờ trước khi gây NTH (DPO
pre
/Gal-LPS). Nhóm còn lại cũng được tiêm DPO liều
tương tự nhưng vào thời điểm 30 phút sau khi chuột được gây NTH (DPO
post
Sau 6 giờ được tiêm NaCl 9‰ (đối với nhóm thứ nhất) và Gal -LPS (đối với 3
nhóm còn lại) chuột được gây mê bằng ketamine/xylazine để nghiên cứu vi tuần hoàn
gan bằng phương pháp Intravital Microscopy (kết quả không thuộc phạm vi bài báo
này) và cuối cùng máu được lấy bằng chọc tĩnh mạch chủ dưới để làm các xét nghiệm.
Định lượng TNFα và IL6 bằng phương pháp ELISA theo hướng dẫn chuẩn hóa của nhà
sản xuất (Pierce Biotechnology, Rockford, Mỹ). Các enzyme SGOT, SGPT, LDH,
GLDH được định lượng theo phương pháp trắc quang trên máy HITACHI 704
Automatic Analyzer (Boehringer, Mannheim, Đức).
/Gal-LPS).
Ngoài ra để nghiên cứu động học của cytokine viêm, chúng tôi cũng tiến hành
nghiên cứu ở các thời điểm khác nhau là 2 giờ, 4 giờ và 6 giờ sau khi gây NTH. Tại mỗi
thời điểm chúng tôi có hai nhóm chuột (mỗi nhóm 5 con) đều được gây NTH nhưng
một nhóm chỉ nhận NaCl 9‰ còn nhóm kia nhận 10 μg/kg DPO đường tĩnh mạch sau
nhãn cầu. Cả NaCl 9‰ lẫn DPO đều được tiêm 30 phút sau khi gây NTH. Các xét
nghiệm cũng được tiến hành tương tự như đã trình bày ở trên.
Xử lý số liệu bằng phần mềm SigmaStat phiên bản 3.0. Để so sánh sự khác biệt
giữa các nhóm, chúng tôi sử dụng one way ANOVA, test post hoc có hiệu chỉnh Bonferroni
cho sai s ố α. Kết quả được trình bày bằng mean ± SEM. p < 0,05 đư ợc xem là có ý nghĩa.

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008
175
3. Kết quả
Tất cả chuột được tiêm Gal-LPS đều xuất hiện các triệu chứng của NTH nặng
như xù lông, run rẩy, kém hoạt động, bỏ ăn, hạ thân nhiệt và bắt đầu chết sau 6 giờ.
Ngoài ra, chúng đều có biểu hiện rối loạn vi tuần hoàn gan với mức độ khác nhau tùy
theo nhóm.
Nồng độ TNFα trong máu tĩnh mạch chủ dưới sau 6 giờ tiêm Gal-LPS hầu như
không khác nhau mặc dù nhóm NTH không được điều trị có cao hơn chút ít. Không có
sự khác biệt đáng kể giữa nhóm chứng và hai nhóm Gal-LPS được điều trị với DPO
(Hình 1A).
TNF-alpha (pg/ml)
0
20
40
60
control Gal-LPS
DPO
pre
DPO
post
Gal-LPS
IL-6 (pg/ml)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000

*
*
control Gal-LPS
DPO
pre
DPO
post
Gal-LPS
B
A

Hình 1. Nồng độ TNF
α
và IL-6 ở bốn nhóm chuột nghiên cứu. Control: nhóm chứng không được tiêm
Gal-LPS. Gal-LPS: nhóm nhiễm trùng huyết không được điều trị DPO. DPO
pre
/Gal-LPS và
DPO
post
Khác với TNFα, nồng độ IL-6 ở ba nhóm được tiêm Gal-LPS có cao hơn. Trong
đó, cao nhất là nhóm Gal-LPS không được điều trị. Điều trị DPO ở chuột gây NTH làm
giảm rõ rệt nồng độ của IL-6. (Hình 1B)
/Gal-LPS lần lượt là các nhóm NTH được điều trị bằng DPO 24 giờ trước và 30 phút sau khi
tiêm Gal-LPS.
Test ANOVA và post hoc; * p < 0.05 so với control.
2h 4h 6h
TNF-alpha (pg/ml)
0
50
100

150
200
#
†
2h 4h 6h
IL-6 (pg/ml)
0
2000
4000
6000
8000
10000
#
†
†
A B
● Gal-LPS
● DPO
post
/ Gal-LPS
● Gal-LPS
● DPO
post
/ Gal-LPS
● Gal-LPS
● DPO
post
/ Gal-LPS
● Gal-LPS
● DPO

post
/ Gal-LPS

Hình 2. Nồng độ của TNFα và IL-6 ở nhóm chuột NTH không được điều trị DPO (Gal-LPS) và nhóm
chuột NTH được điều trị DPO (DPO
post
Những thay đổi của TNFα và IL-6 trong quá trình tiến triển của NTH có và
không có điều trị bằng DPO được lần lượt trình bày trong hình 2A và 2B. Khảo sát
/Gal-LPS ở các thời điểm khác nhau. Test ANOVA và post hoc;
# p < 0.05 so với Gal-LPS ở cùng thời điểm; † p < 0.05 so với thời điểm 2 giờ.
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008
176
TNFα vào các thời điểm khác nhau cho thấy cytokine viêm này được phóng thích từ rất
sớm sau khi tiêm Gal-LPS. Nồng độ TNFα cao nhất lúc 2 giờ và nhanh chóng hạ thấp
về gần mức bình thường 4 giờ sau tiêm Gal-LPS (Hình 2A). Tương tự, nồng độ IL-6
huyết tương cũng cao nhất vào thời điểm 2 giờ và dần dần hạ thấp, tuy nhiên không trở
về bình thường (Hình 2B). Hai hình này cũng cho thấy DPO có khả năng làm giảm đáng
kể cả TNFα và IL-6 ở tất cả thời điểm nghiên cứu.
Bảng 1 trình bày các thông số đánh giá chức năng gan cũng như chỉ điểm tổn
thương tế bào ở bốn nhóm chuột được nghiên cứu. Tiêm Gal-LPS gây nên tổn thương
gan mạnh mẽ ở thời điểm 6 giờ. Trong khi đó, DPO 24 giờ trước và 30 phút sau khi
tiêm Gal-LPS làm giảm rõ mức độ tổn thương gan cũng như các chỉ điểm tổn thương tế
bào chung.
Thông số Control Gal-LPS DPO
pre
DPO
/Gal-LPS
post
/Gal-
LPS

SGPT (U/L) 33 ± 4 267 ± 51* 92 ± 24 145 ± 76
SGOT (U/L) 140 ± 13 453 ± 13* 249 ± 51 267 ± 91
LDH (U/L) 1249 ± 266 3468 ± 295* 1627 ± 329 1439 ± 667
GLDH (U/L) 15 ± 2 59 ± 11* 33 ± 6 33 ± 12
Bảng 1. Hoạt độ của các men SGOT, SGPT, LDH và GLDH vào thời điểm 6 giờ sau tiêm Gal-LPS phản
ảnh mức độ tổn thương gan ở chuột gây NTH và tác dụng bảo vệ gan của DPO. Test ANOVA và post
hoc; * p < 0.05 so với control
.
4. Bàn luận
Mô hình thực nghiệm gây nhiễm trùng huyết và tổn thương gan sử dụng trong
nghiên cứu này là mô hình đã được chuẩn hóa và sử dụng trong nhiều nghiên cứu trước
đây [9], [11].
Viêm là kết quả của sự hoạt hóa của một hệ thống bao gồm bạch cầu, tế bào nội
mô và hệ thống các chất trung gian trong đó cytokine đóng vai trò quan trọng đặc biệt
[13]. Trong số các cytokine này, TNFα được xem như nhạc trưởng. Trong NTH do Gal-
LPS, TNFα gây nên quá trình sao mã các cytokine viêm khác, thúc đẩy quá trình thoát
quản bạch cầu đa nhân vào trong tổ chức như gan gây nên tổn thương cơ quan [2].
Trong nghiên cứu này , DPO làm giảm một cách đáng kể TNFα vào thời điểm rất sớm
sau khởi phát NTH do vậy có khả năng làm giảm đáp ứng viêm về sau. Nhờ đó, tổn
thương gan và cơ quan khác cũng giảm xuống.
Sử dụng mô hình nghiên cứu thực nghiệm tương tự, Lamping và cộng sự chứng
minh rằng nồng độ IL-6 tăng cao trong nhóm Gal-LPS và hạ thấp trong nhóm chuột
được tiêm protein gắn LPS trước khi tiêm Gal-LPS và nhờ đó bảo vệ được chuột khỏi
sốc NTH [8]. Hơn nữa, TNFα là chất cảm ứng chính gây phóng thích IL-6 trong các
bệnh lý do viêm [5]. Nồng độ IL-6 thấp ở các nhóm chuột NTH được điều trị DPO có
thể được giải thích một phần do TNFα thấp ở các nhóm này. Trong các nghiên cứu
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008
177
trước đây, erythropoietin làm giảm IL-6 ở bệnh nhân ung thư [7], giảm viêm trong thiếu
máu cục bộ/tái tưới máu não [16] và làm giảm TNFα cũng như IL-6 trong bệnh tim mạn

tính [10]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lần đầu tiên chứng minh rằng DPO làm giảm
viêm trong NTH do Gal-LPS.
TNFα đóng vai trò quan trọng trong việc cảm ứng gây tương tác giữa tế bào nội
mô và bạch cầu [12]. IL-6 tham gia vào phản ứng viêm thông qua khuyếch đại hiện
tượng tụ tập bạch cầu tại các cơ quan [14]. Bạch cầu đóng vai trò quan trọng trong cơ
chế bệnh sinh của tổn thương cơ quan do NTH, ví dụ như trong tổn thương gan [6].
Thông qua việc làm giảm nồng độ TNFα và IL-6, DPO làm giảm tập trung bạch cầu tại
gan, giảm phản ứng viêm tại đây và nhờ vậy làm giảm tổn thương gan và tổ chức khác.
5. Kết luận
DPO liều 10 μg/kg tĩnh mạch 24 giờ trước hoặc 30 phút sau khi gây NTH bằng
D-galactosamin/lipopolysaccharide E coli làm giảm đáng kể nồng độ TNF α và IL-6
ngay từ những thời điểm rất sớm. Nhờ đó, DPO làm giảm tổn thương cơ quan, đặc biệt
là tổn thương gan do NTH. Như vậy DPO có tác dụng chống viêm và bảo vệ cơ quan
trong NTH thực nghiệm. Cần thêm nhiều nghiên cứu thực nghiệm cũng như lâm sàng
khác để có thể kết luận DPO có tác dụng tương tự ở người hay không.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Angus DC, Linde-Zwirble WT, Lidicker J, Clermont J, Carcillo G, Pinsky MR.
Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome,
and associated costs of care. Crit Care Med. 2001; 29:1303-10.
[2] Bradham CA, Plumpe J, Manns MP, Brenner DA, Trautwein C. Mechanisms of
hepatic toxicity. I. TNF-induced liver injury. Am J Physiol. 1998; 275:G387-92. (a)
[3] Brun-Buisson C. The epidemiology of the systemic inflammatory response.
Intensive Care Med. 2000; 26:64-74.
[4] Brunkhorst FM, Rheinhart K; Kompetenznetzwerk Sepsis (SEPNET). Häufigkeit
der Sepsis in deutschen Intensivstationen und Leitlinien der DSG. Notfall- und
Intensivmedizin. 2006; 1:34-35.
[5] Cohen J. The immunopathogenesis of sepsis. Nature. 2002;420:885-91.
[6] Jaeschke H, Hasegawa T. Role of neutrophils in acute inflammatory liver injury.

Liver Int. 2006; 26:912-9.
[7] Kanzaki M, Soda K, Gin PT, Kai T, Konishi F, Kawakami M. Erythropoietin
attenuates cachectic events and decreases production of interleukin-6, a cachexia-
inducing cytokine. Cytokine. 2005; 32:234-9.
[8] Lamping N, Dettmer R, Schroder NW, Pfeil D, Hallatschek W, Burger R,
Schumann RR. LPS-binding protein protects mice from septic shock caused by
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 5(28).2008
178
LPS or gram-negative bacteria. J Clin Invest. 1998; 101:2065-71.
[9] Leist M, Gantner F, Bohlinger L, Tiegs G, Germann PG, Wendel A. Tumor
necrosis factor-induced hepatocyte apoptosis precedes liver failure in experimental
murine shock models. Am J Pathol. 1995; 146:1220-34. (a)
[10] Li Y, Takemura G, Okada H, Miyata S, Maruyama R, Li L, Higuchi M,
Minatoguchi S, Fujiwara T, Fujiwara H. Reduction of inflammatory cytokine
expression and oxidative damage by erythropoietin in chronic heart failure.
Cardiovasc Res. 2006; 71:684-94.
[11] Morikawa A, Sugiyama T, Kato Y, Koide N, Jiang GZ, Takahashi K, Tamada Y,
Yokochi T. Apoptotic cell death in the response of D-galactosamine-sensitized
mice to lipopolysaccharide as an experimental endotoxic shock model. Infect
Immun. 1996; 64:734-8.
[12] Norman MU, Lister KJ, Yang YH, Issekutz A, Hickey MJ. TNF regulates
leukocyte-endothelial cell interactions and microvascular dysfunction during
immune complex-mediated inflammation. Br J Pharmacol. 2005; 144:265-74.
[13] Rolando N, Wade J, Davalos M, Wendon J, Philpott-Howard J, Williams R. The
systemic inflammatory response syndrome in acute liver failure. Hepatology. 2000;
32:734-9.
[14] Romano M, Sironi M, Toniatti C, Polentarutti N, Fruscella P, Ghezzi P, Faggioni
R, Luini W, van Hinsbergh V, Sozzani S, Bussolino F, Poli V, Ciliberto G,
Mantovani A. Role of IL-6 and its soluble receptor in induction of chemokines and
leukocyte recruitment. Immunity. 1997; 6:315-25.

[15] Van Gestel A, bekker J, Veraart C PWM, van Hout BE. Prevalence and incidence
of severe sepsis in Dutch intensive care units. Crit Care. 2004; 8:153-62.
[16] Villa P, Bigini P, Mennini T, Agnello D, Laragione T, Cagnotto A, Viviani B,
Marinovich M, Cerami A, Coleman TR, Brines M, Ghezzi P. Erythropoietin
selectively attenuates cytokine production and inflammation in cerebral ischemia
by targeting neuronal apoptosis. J Exp Med. 2003; 198:971-5.