Thí nghiệm Sinh học phân tử - Thí nghiệm Sinh học thực phẩm doc

Thí nghiệm Sinh học thực phẩm Biên soạn : PGS.TS. Lê Thị Liên Thanh

54
BÀI 1
TÁCH ĐƯỜNG KHỬ TRONG LÒNG TRẮNG TRỨNG
BẰNG NẤM MEN

1.1. Mục đích:
Đường khử hiện diện trong lòng trắng trứng là một trong hai tác nhân
của phản ứng melanoidin - nguyên nhân làm biến màu lòng trắng trứng vốn
màu trắng sẽ dần chuyển sang màu vàng nâu với cường độ màu biến động lớn
tuỳ thuộc vào kỹ nghệ và điều kiện bảo quản. đường trong lòng trắng trứng là
đường glucoza. Tách đường glucoza trước khi sấy bột trứng là quan trọng để
bột trứ
ng thành phẩm - phụ gia thực phẩm quan trọng với nhiều đặc tính ứng
dụng quý báu (khả năng đông tụ, nhủ hoá, chống kết tinh, tăng khả năng kết
dính, tăng độ nở, độ đàn hồi, khả năng giữ khí, ) lạ càng hoàn thiện hơn khi
ứng dụng.
1.2. Nguyên tắc:
Tác nhân sử dụng tách đường khử có trong lòng trắng trứng là nấm
men Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) được sử dụ
ng phổ biến trong
công nghiệp thực phẩm. Cơ chế chuyển hoá theo phản ứng:
C
6
H
12
O
6
⎯⎯⎯⎯→ C
2

H
5
OH + CO
2
+ 33 Kcal
Các sản phẩm tạo thành là các hợp chất dễ bay hơi khi sấy sản phẩm
bột trứng.
1.3. Phương pháp tiến hành:
Tách đường khử có lòng trắng trứng bằng nấm men S.cerevisiae là
phương pháp sinh học được thực hiện theo các bước sau:
* Bước 1
: Chuẩn bị men giống
Nấm men giống được chuẩn bị từ các nguồn (hoặc từ ngân hàng giống
vi sinh vật trong và ngoài nước hoặc từ các phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc
có thể phân lập từ các sản phẩm thực phẩm lên men có sử dụng S.cerevisiae
trên các môi trường thích hợp). Nấm men giống được bảo quản trong các môi
trường giữ giống ở nhiệt độ <
4
0
C. Trước khi sử dụng, nấm men được hoạt
hoá và tăng sinh khối trên môi trường thích hợp.
nấm men
S.cerevisiae
Thí nghiệm Sinh học thực phẩm Biên soạn : PGS.TS. Lê Thị Liên Thanh

55
* Bước 2: Chuẩn bị lòng trắng trứng
Dùng trứng tươi (trứng gà, vịt, ngan, ngỗng, đà điểu) có thời gian bảo
quản thích hợp để 2 phần lòng đỏ, lòng trắng trứng chưa bị trộn lẫn với nhau
đảm bảo tách riêng được lòng trắng để tiến hành lên men tách đường khử. Số

lượng trứng từ 3 - 5 quả cho mỗi nhóm (riêng trứng đà điểu chỉ cần 1 quả).
Trứng
được rửa sạch, sát trùng bằng dung dịch muối loãng (3 – 5 %) hoặc
clorin 5mg/lít, lau khô bằng giấy thấm sạch. Dùng bát sứ hoặc chén thuỷ tinh
đã rửa sạch, lau khô, sấy thanh trùng. Đập bể đôi trứng, tách riêng lòng đỏ,
lòng trắng vào các dụng cụ riêng. Bảo quản ở nhiệt độ <
4
0
C (nếu chưa tiến
hành lên men ngay). Điều chỉnh pH của lòng trắng trứng đến giá trị bằng axit
xitric dung dịch 30%.
* Bước 3
: Lên men lòng trắng trứng
- Dùng sinh khối nấm men theo tỉ lệ
1000
25,1
trungtranglong
mennam
=
(kg) hoặc
1000
3,1
(kg) trộn đều vào khối lòng trắng. Thời gian kết thúc lên men tách đường
khử kéo dài khoảng từ 8 - 12 giờ ở nhiệt độ phòng xác định sự biến thiên hàm
lượng đường theo thời gian lên men (trước khi cấy sinh khối nấm men và
cách 2 giờ xác định đường một lần) trong khoảng thời gian lên men dự kiến
bằng phương pháp Nelson. Kết quả được biểu diễn trên hệ trục toạ độ hoặc
profil biểu đồ. Nhậ
n xét sự chuyển hoá đường theo từng giai đoạn xác định.
- Nguyên tắc phương pháp Nelson: Cho dung dịch Cu

+2
vào dung dịch
chứa đường khử cần phân tích. Đun sôi trong khoảng thời gian nhất định thì
Cu
+2
sẽ tác dụng với nhóm CHO của đường khử tạo thành kết tủa Cu
2
O màu
đỏ gạch. Hoà tan kết tủa này bằng dung dịch arseno - molypden được dung
dịch màu xanh. Tuỳ theo hàm lượng đường khử sẽ tương ứng với lượng kết
tủa Cu
2
O tạo thành và dung dịch có cường độ màu thích hợp. Tiến hành so
màu ở bước sóng λ = 660 nm, dùng đường chuẩn glucoza để xác định đường
khử có trong mẫu phân tích.
1.4. Nguyên liệu, dụng cụ, hoá chất:
- Nguyên liệu: + Trứng gia cầm tươi
+ Nấm men giống (nấm men bia và nấm men rượu
vang)
+ Lọ đứng hoá chất màu
Thí nghiệm Sinh học thực phẩm Biên soạn : PGS.TS. Lê Thị Liên Thanh

56
- Dụng cụ:
+ Chén sứ hoặc thuỷ tinh
+ Đũa thuỷ tinh hoặc đũa gỗ
+ Dao, thìa Inox
+ Tủ lạnh
+ Tủ sấy có nhiệt độ tối đa 150 - 160
0

C
+ Máy so màu và dụng cụ chứa mẫu để đo (máy UV-
VIS ở bước sóng λ = 660mm)
+ pH meter
+ Cốc thuỷ tinh (50, 100, 150cc)
+ Bình tam giác (50, 100, 150cc) có nắp đậy
- Hoá chất:
+ Na
2
SO
4
khan, NaHCO
3
và Na
2
CO
3

+ CuSO
4
.5H
2
O, H
2
SO
4
đậm đặc
+ Dung dịch arseno - molypden (Molipdat amonium,
Na
2

HA
5
O
4
.7H
2
O)
+ Dung dịch axit xitric 30%
+ Glucoza tinh khiết










Thí nghiệm Sinh học thực phẩm Biên soạn : PGS.TS. Lê Thị Liên Thanh

57
BÀI 2
ỨNG DỤNG PECTINASE ĐỂ LÀM TRONG
RƯỢU VANG VÀ NƯỚC QUẢ

* Rượu vang là sản phẩm lên men không chưng cất từ nho. Ngày nay
khái niệm về rượu vang được mở rộng ra cho các loại quả như mơ, mận, dứa,
táo, dâu, Rượu vang là loại nước uống có giá trị bổ dưỡng chứa lượng
etanol vừa phải (10 - 14

0
GL)
Rượu vang, về mặt lý thuyết được chia làm 2 giai đoạn lên men chính:
- Giai đoạn 1 : Nhờ vào tác dụng của nấm men Saccharomyces
cerevisiae (S.cerevisiae) chuyển hoá đường trong quả tạo thành etanol và CO
2

là chủ yếu. Ngoài ra, giai đoạn lên men nầy còn tạo ra một số sản phẩm phụ
khác (axit hữu cơ, rượu cao phân tử, este, )
- Giai đoạn 2: (Còn gọi là giai đoạn lên men phụ hay là giai đoạn lên
men malolactic). Nhờ vào tác dụng của vi khuẩn lactic trong đó Leuconostoc
oenos (L.oenos) được coi là tác nhân chính yếu của giai đoạn này. Sản phẩm
chuyển hoá quan trọng trong giai đoạn này là:
Axit malic chuyển thành axit lactic làm cho vị của rượu vang trở nên
chua dịu và "
đầm".
Axit xitric và đường quả (glucoza, fructoza) sẽ tạo ra các hợp phần
diaxetyl, axetoin và 2,3 batylen - glycol là tổ hợp hương thơm cho rượu vang.
Nấm men không chuyển hoá axit hữu cơ theo hướng đã nêu trên.
* Nước quả (nước quả trong và nước quả đục) là 1 trong những sản
phẩm chế biến từ quả thông qua việc tách dịch quả bằng nhiều phương pháp
khác nhau. Việc làm trong dịch quả trong thời gian ngắn là rất khó khăn bằng
phương pháp l
ắng lọc. Mức độ trong của nước quả có vai trò đến giá trị cảm
giác của sản phẩm.
2.1. Mục đích:
Pactimase (hay còn gọi là pectinesterase) có tác dụng hữu hiệu trong
việc làm trong dịch quả hoặc để sản xuất nước quả trong hoặc để làm trong
dịch quả trước khi lên men sản xuất rượu vang. Sử dụng pectinase sẽ đưa hiệu
quả cao bởi: Lượng pectinase sử dụng ít nhưng hiệ

u quả làm trong cao và
nhanh thay thế cho phương pháp hoá - lý (lắng lọc tự nhiên) kém hiệu quả, dễ
nhiễm khuẩn và thời gian dài.
Thí nghiệm Sinh học thực phẩm Biên soạn : PGS.TS. Lê Thị Liên Thanh

58
2.2. Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của pectinase, pectin - một polysacharid được tạo thành
từ sự liên kết giữa các mạch của phân tử axit galacturonic (C
6
H
10
O
7
) mà một
phần (ở mức độ khác nhau) đã được este hoá với rượu metylic (CH
3
OH) bị
phân huỷ hoặc bị phân cắt liên kết glucozit.
Pectin là 1 chất điện ly cao phân tử (polime) mang điện tích âm (-) dọc
theo chiều dài của mạch phân tử có sự sắp xếp các nhóm diện tích cùng dấu (-
COO
-
) nên mạch có xu hướng duỗi thẳng tạo nên bề mặt hấp phụ lớn trong
toàn bộ dung dịch có chứa pectin.
Nước quả đục là hệ huyền phù trong đó phần tử sắn (thịt quả) có kích
thước nhỏ, bề mặt riêng lớn và có năng lượng rất lớn nên không bền vững về
mặt nhiệt động học. Mặt khác, chúng ta là những phân tử tích điện nên dưới
tác dụng củ
a lực hút phân tử chúng liên kết lại tạo thành những phân tử lớn dễ

dàng sa lắng. Trong nước quả, sự có mặt của hợp chất polyphenol (đặc biệt là
tanin) tạo nên với pectin những kết tủa không tan v.v Sự có mặt của
pectinase sẽ thúc đẩy nhanh quá trình cơ bản nêu trên.
Xác định giá trị mật độ quang OD (Optical Density) ở λ = 600 nm theo
thời gian để so sánh tốc độ sa lắng bột thịt quả giữa các mẫu.
2.3. Ph
ương pháp tiến hành:
Từ nguyên liệu quả tươi (ổi, táo, cam, quýt, ) tạo ra nước quả dạng
đục theo sơ đồ tổng quát sau:
Nguyên liệu Nước nóng
↓ ↓
Xử lý (ngâm, rữa) Trích ly
↓ bã ↓
Ép
↓ ↓
Dịch quả Bã
↓
Nâng nhiệt
↓
Pha chế
↓
Thí nghiệm Sinh học thực phẩm Biên soạn : PGS.TS. Lê Thị Liên Thanh

59
lọc tinh
↓
Phân phối hình tam giác
đậy nắp
↓
Đun sôi, làm nguội

↓ Kiểm tra độ axit và Bx của nước quả
Bổ sung pectinase ←⎯⎯ pectinase 1% tinh khiết
↓
Xác định OD
- Các thông số công nghệ khi thao tác làm nước quả:
+ Ngâm sát trùng bằng dung dịch clorin (CaOCl
2
) 5 mg/l trong 5-
10 phút tuỳ thuộc vào mức độ nhiễm bẩn.
+ Dùng máy xay hoặc máy ép trái cây để làm nhỏ nguyên liệu.
+ Lọc sơ bộ bằng 4 lớp vải màng hoặc rây.
+ Nâng nhiệt: nhiệt độ < 70
0
C (từ 65-68
0
C) trong 2 - 3 phút nhằm
kết tủa protein, chất chát của quả.
+ Pha chế: Dùng hỗn hợp đường (hoặc sirô đường 70%), axit
xitric, nước sôi để nguội.
Với hỗn hợp trên pha chế nước quả có Bx : 16-17 %; độ axit
0,25 - 0,3 % (tính theo axit xitric).
+ Lọc tinh: qua 24 lớp vải màng.
+ Phân phối hình tam giác: dùng phễu sạch phân phối mỗi bình
100 – 150 ml, đậy kín bằng nút nhóm hoặc bông không thắm
nước (6 bình/1 nhóm).
+ Đun sôi; làm nguội: Dùng nồi cách thuỷ đun sôi dung dịch và
giữ ở nhiệt độ
này trong thời gian 25-30 phút, làm nguội nhanh
đến nhiệt độ môi trường trong nước đá đã tan.
+ Bổ sung pectinase 1 % với liều lượng 3 % vào 2 bình; 5 % vào 2

bình, còn lại 2 bình không bổ sung pectinase (các bình tam giác
đã chứa nước quả).
Thí nghiệm Sinh học thực phẩm Biên soạn : PGS.TS. Lê Thị Liên Thanh

60
* Chuẩn bị mẫu thực nghiệm:
6 Mẫu nước quả đã được chuẩn bị sẵn trong bình tam giác có dung tích
100 - 150ml sản phẩm. Dùng pectinase của hãng Novo (Đan Mạch) 1%, được
cho vào:
+ 3% enzim pectinase (theo thể tích nước quả) : 2 bình
+ 5% enzim pectinase (theo thể tích nước quả : 2 bình
+ 0% enzim pectinase (mẫu đối chứng) : 2 bình
Các bình được lắc đều trong cùng 1 thời gian, chia đều làm 2 loại mẫu:
1 loại để yên theo dõi trong suốt quá trình thực nghiệm; 1 loại lấy mẫu đo OD
theo thờ
i gian (giờ): 0, 1, 3, 5, 7 ở bước sóng λ = 600 nm.
* Tính kết quả và biểu diễn kết quả:
Ở bước sóng λ = 600 nm, tiến hành đo giá trị OD ở các mẫu đối chứng
và thực nghiệm. Lấy giá trị OD đo được ở giờ sau so với giá trị OD đo được ở
thời gian kế trước đó, chúng ta có giá trị ∆OD. ∆OD là giá trị biểu đạt biên độ
dao động của trị số
OD giữa các lần đo theo thời gian. ∆OD càng nhỏ chứng
tỏ sự bền vững của hệ huyền phù nước quả đục càng cao. Ngược lại, giá trị
∆OD tính được càng lớn, tốc độ sa lắng bột thịt quả càng nhanh chứng tỏ sự
tách pha rắn càng nhanh trong hệ nước quả đục. Điều này đồng nghĩa với vai
trò làm trong của pectinase.
Kết quả ∆OD được biểu di
ễn trên hệ trục toạ độ hoặc bằng profil biên
độ theo thời gian giữa các mẫu thực nghiệm (kể cả mẫu đối chứng). So sánh
và nhận xét.

2.4. Nguyên liệu, dụng cụ và hoá chất:
- Nguyên liệu: + Quả tươi (ổi, táo, cam, quýt, )
+ Axit xitric tinh thể thực phẩm
+ Đường kính trắng (RS hoặc RE)
+ Axit ascocbic (vitamin C) trắng (nếu dùng táo, lê,
ổi)
+ Pectinase của hãng Novo (Đan Mạch)
- Dụng cụ:
+ Máy ép trái cây hiệu philippe hoặc National
+ Rây lọc
Thí nghiệm Sinh học thực phẩm Biên soạn : PGS.TS. Lê Thị Liên Thanh

61
+ Khăn lọc loại 4 lớp và 24 lớp (mỗi nhóm 1 khăn
mỗi loại).
+ Phẫu nhỏ
+ Bình tam giác loại 200ml (6 cái/1 nhóm) có nút đậy
chiết quang kế cầm tay.
+ Máy so màu có bước sóng λ = 600 nm và các cuvet.
+ Chai lọ sạch có nút nhám chứa enzim pectinase.
+ Bông sạch (thấm nước và khoáng thấm nước)
+ Nồi cách thuỷ (mỗi nhóm 1 nồi)
+ Nhiệt kế 100
0
C (mỗi nhóm 1 chiếc)
+ Buret, pipet, bình tam giác 50ml.
- Hoá chất:
+ Clorin (CaOCl
2
)

+ NaOH 0,1 N
+ Phenolphtalein