Công nghệ ADN tái tổ hợp part 2 pot

Kh¸i niÖm chung
ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo?
T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic
T¹o
vÐct¬
t¸i
tæ
hîp
Néi dung
7
T¹o
vÐct¬
t¸i
tæ
hîp
C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp
Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen
Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen
ADN tái tổ hợp thực hiện nh thế nào?
Các bớc cơ bản thực hiện ADn tái tổ hợp
1. Chọn nguồn gen cần tách dòng chứa trình tự quan tâm.
2. Chuẩn bị ADN ngoại lai có các đầu 3, 5 phù hợp.
3. Chọn lọc véctơ (thể truyền) phù hợp.
4. Cải biến đầu 3 và 5của véctơ và phân tử ADN ngoại lai.
8
5. Nối phân tử ADN véctơ và ADN ngoại lai.
6. Đa véctơ tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân lên.
7. Sàng lọc để chọn các dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp.
8. Xác định đặc tính các dòng, và sử dụng các dòng cho các
mục đích nghiên cứu khác nhau.
Kh¸i niÖm chung

ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo?
T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic
T¹o
vÐct¬
t¸i
tæ
hîp
Néi dung
9
T¹o
vÐct¬
t¸i
tæ
hîp
C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp
Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen
Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen
Tách chiết và tinh sạch axit nucleic
Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết ADN
Các dung môi hữu cơ làm mất nớc, thay đổi môi trờng điện môi


kết tủa protein & ADN.
Độ pH thờng trung tính hoặc hơi kiềm (7,0 8,5).
Phenol, chloroform, isoamylalcohol thờng đợc dùng để kết tủa
protein (vd. Chloroform/isoamylalcohol 24/1).

Một
số
hợp

chất
chống
oxy
hóa
nh
2
-
mercapthoethanol,
DTT
10

Một
số
hợp
chất
chống
oxy
hóa
nh
2
-
mercapthoethanol,
DTT
(dithiothreito), 8-hydroxyquinoline làm giảm nguy cơ gây biến tính
axit nucleic. SDS làm vỡ màng tế bào. EDTA loại các ion kim loại.
Các dung môi alcohol (vd. EtOH, MeOH, 2-propanol) đợc dùng để
kết tủa axit nucleic. Các muối (vd. acetate) trung hòa điện tích và
làm giảm khả năng tan của axit nucleic. T
o
-20

o
C / 0
o
C (1/2h 24h).
CTAB loại bỏ các hợp chất polysaccharide / polyphenol ở thực vật.
Lysozyme đợc dùng để phân giải lớp peptidoglycan ở vi khuẩn.
T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch axit nucleic
BỔ SUNG
PHENOL
ADN vµ ARN
trong n−íc
LẮC
MẠNH
LY TÂM
11
DÙNG PHENOL LOẠI PROTEIN KHỎI DỊCH CHIẾT ADN VÀ ARN
ADN, ARN vµ
protein trong
pha n−íc
Phenol
Protein
trong phenol
Tách chiết và tinh sạch axit nucleic
Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết aRN
Để tách chiết mARN, ngời ta thờng dùng cột Oligo dT
celluloza, hoặc cột hấp thụ từ tính với biotin-oligo(dT).
Định tính và định lợng ADN dựa trên phơng pháp điện
di và đo quang phổ ở các bớc sóng 260 và 280 nm.

1

,
0
A
260
nm



50
à
à à
à
g
/
ml
dsADN
12

1
,
0
A
260
nm



50
à
à à

à
g
/
ml
dsADN
1,0 A
260nm


40 à
à à
àg / ml ssADN / ARN
1,0 A
260nm


33 à
à à
àg / ml dNTP / oligonucleotide