Nghiên cứu sự đột biến gene k RAS và mối liên quan đột biến gene k RAS với một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh ung thư đại trực tràng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y







LÊ VĂN THIỆU




NGHIÊN CỨU SỰ ĐỘT BIẾN GENE K-RAS VÀ
MỐI LIÊN QUAN ĐỘT BIẾN GENE K-RAS VỚI MỘT
SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG
BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG




LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2013



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y





LÊ VĂN THIỆU




NGHIÊN CỨU SỰ ĐỘT BIẾN GENE K-RAS VÀ
MỐI LIÊN QUAN ĐỘT BIẾN GENE K-RAS VỚI MỘT

SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG
BỆNH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG



Chuyên ngành: NỘI TIÊU HÓA
Mã số: 62.72.01.43



LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN LUẬN ÁN:
1. PGS.TS Phạm Văn Nhiên
2. PGS.TS Trịnh Tuấn Dũng




HÀ NỘI – 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất
kỳ một công trình nào khác.

Tác giả

Lê Văn Thiệu




















Lêi c¶m ¬n

Để hoàn thành bản luận án này, tôi xin trân trọng cảm ơn:
- Đảng ủy, Ban giám đốc, Phòng Sau đại học Học viện Quân Y.
- Đảng ủy, Ban giám đốc, tập thể cán bộ, nhân viên Khoa Khám bệnh
theo yêu cầu Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp Hải Phòng đã tạo mọi điều

kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành quyển
luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:
PGS.TS Phạm Văn Nhiên Trƣởng bộ môn Nội Trƣờng Đại học Y Hải
Phòng, PGS.TS Trịnh Tuấn Dũng Trƣởng khoa Giải phẫu bệnh Bệnh viện
Trung Ƣơng Quân đội 108, Chủ tịch Hội Giải phẫu bệnh – Tế bào học Việt
Nam, hai ngƣời thầy đã dành nhiều thời gian và công sức tận tình chỉ bảo,
hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành
quyển luận án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
- Các GS, PGS, TS trong hội đồng chấm luận án đã cho tôi nhiều ý
kiến quý báu để hoàn thành luận án này.
- Các thầy bộ môn Nội tiêu hóa và các thầy cô các bộ môn Học viện
Quân Y đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng tôi xin đƣợc dành tất cả những tình cảm kính trọng và vô
cùng biết ơn tới cha mẹ, những ngƣời thân trong gia đình, bạn bè thân thiết
và đặc biệt là vợ và hai con yêu quí đã hết lòng vì tôi trong cuộc sống và
học tập.
Hà Nội, ngày 15 tháng 4 năm 2013
Lê Văn Thiệu




MỤC LỤC


Trang
Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ, ký hiệu viết tắt trong luận án

Danh mục các bảng

Danh mục các biểu đồ

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ
1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
3
1.1. Gene và ung thƣ đại trực tràng
3
1.2. Gene K-RAS và ung thƣ đại trực tràng
8
1.3. Yếu tố nguy cơ và quá trình phát sinh ung thƣ đại trực tràng
16
1.4. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ung thƣ đại trực tràng
22
1.5. Tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài luận án
34
1.5.1. Nghiên cứu trên thế giới
34
1.5.2. Nghiên cứu ở Việt Nam
36

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
37
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
37
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
37
2.3. Các bƣớc tiến hành
43
2.4. Chỉ tiêu nghiên cứu và tiêu chuẩn đánh giá
48
2.5. Đạo đức nghiên cứu
52
2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu
53
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
54
3.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu
54
3.2. Đột biến gene K-RAS ở bệnh nhân bị ung thƣ biểu mô đại trực tràng
65



3.3. Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với một số đặc điểm
lâm sàng, hình ảnh nội soi, mô bệnh học và nồng độ CEA ở
bệnh nhân ung thƣ biểu mô đại trực tràng
71
Chƣơng 4. BÀN LUẬN
83
4.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu

83
4.2. Đột biến gene K-RAS ở bệnh nhân ung thƣ biểu mô đại trực tràng
88
4.3. Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với đặc điểm lâm
sàng, hình ảnh nội soi, mô bệnh học và nồng độ CEA ở bệnh
nhân ung thƣ biểu mô đại trực tràng
94
KẾT LUẬN
108
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC













DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

TT
Phần viết tắt Phần viết đầy đủ
1
APC
:
Adenomatous Polyposis Coli (Đa polype tuyến
đại tràng)
2
AJCC
:
American Joint Committee on cancer (Ủy ban liên
ngành của Hoa Kỳ về ung thƣ)
4
BN
:
Bệnh nhân
5
CAP
:
College of American Pathologists (Hội Giải phẫu
bệnh Hoa Kỳ)
6
CEA
:
Carcinoma Embrionic Antigen (Kháng nguyên ung
thƣ biểu mô phôi)
7
CS
:
Cộng sự

8
DNA
:
Deoxyribonucleic acid (Axít deoxyribonucleic)
9
ĐT
:
Đại tràng
10
ĐTT
:
Đại trực tràng
11
EGFR
:
Epithelial Growth Factor Receptor (Thụ thể yếu tố
phát triển biểu mô)
12
FAP
:
Familial Adenomatous Polyposis (Bệnh đa polype
tuyến gia đình)
13
FOB
:
Test Faecal Occult Blood (Xét nghiệm tìm máu ẩn
trong phân)
14
GLOBOCAN
:

Global cancer (Ung thƣ toàn cầu)
15
HNPCC
:
Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (Ung
thƣ đại trực tràng di truyền không polype)
16
MBH
:
Mô bệnh học
17
MSI
:
Microsatellite instability (Tính không ổn định về
vi vệ tinh)
18
PCR
:
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi)

TT
Phần viết tắt Phần viết đầy đủ
19
PCR-SSCP
:
Polymerase Chain Reaction-based Single-Strand
Conformation Polymorphism (Phản ứng tổng hợp
chuỗi dựa trên cấu trúc đa hình sợi đơn)
20
TT

:
Trực tràng
21
TNM
:
Tumor-Node-Metastasis (Khối u - Hạch - Di căn)
22
UT
:
Ung thƣ
23
UTTT
:
Ung thƣ trực tràng
24
UTĐTT
:
Ung thƣ đại trực tràng
25
UTBM
:
Ung thƣ biểu mô
26
UTBMĐTT
:
Ung thƣ biểu mô đại trực tràng
27
UTBMT
:
Ung thƣ biểu mô tuyến

28
UICC
:
Union International for Cancer Control (Hiệp hội
phòng chống ung thƣ quốc tế)
29
WHO
:
World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
1.1.
Một số gene tham gia vào quá trình phát triển ung thƣ đại
trực tràng
8
1.2.
Phân loại giai đoạn Dukes cải tiến và Astler – Coller
29
1.3.
Phân chia giai đoạn ung thƣ đại trực tràng của AJCC - 2006
31
1.4.
Một số nghiên cứu đột biến gene K-RAS ở bệnh ung thƣ đại
tràng trên thế giới (1)
34

1.5.
Một số nghiên cứu đột biến gene K-RAS ở bệnh ung thƣ đại
tràng trên thế giới (2)
36
3.1.
Phân bố bệnh nhân theo tuổi
54
3.2.
Địa dƣ
55
3.3.
Lý do vào viện
56
3.4.
Tiền sử bệnh
56
3.5.
Triệu chứng đau bụng
57
3.6.
Triệu chứng rối loạn tiêu hóa
58
3.7.
Vị trí, hình thể, kích thƣớc khối u trên nội soi
59
3.8.
Mô bệnh học bệnh phẩm sau phẫu thuật
61
3.9.
Mức độ xâm lấn u vào thành đại trực tràng

64
3.10.
Tỉ lệ đột biến gene K-RAS
66
3.11.
Đột biến gene K-RAS theo giới tính
68
3.12.
Đột biến gene K-RAS theo nhóm tuổi
69
3.13.
Tỉ lệ kiểu đột biến gene K-RAS
70
3.14.
Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với thời gian từ khi
xuất hiện triệu chứng đến khi phát hiện bệnh
71
3.15.
Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với triệu chứng đại
tiện ra máu đại thể và triệu chứng thiếu máu
72
3.16.
Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với vị trí u
73
3.17.
Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với hình thể u
74

Bảng
Tên bảng

Trang
3.18.
Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với kích thƣớc u
75
3.19.
Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với mức độ xâm
lấn khối u so với chu vi lòng đại trực tràng
76
3.20.
Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với týp mô bệnh học
77
3.21.
Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với độ ác tính khối u
78
3.22.
Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với ung thƣ biểu
mô tuyến nhày và không phải ung thƣ biểu mô tuyến nhày
79
3.23.
Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với mức độ xâm
lấn khối u vào thành đại trực tràng
80
3.24.
Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với ung thƣ biểu
mô đại trực tràng có và chƣa có di căn hạch
81
3.25.
Nồng độ CEA ở bệnh nhân ung thƣ biểu mô đại trực tràng
82
3.26.

Mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với nồng độ CEA
82
4.1.
So sánh tỉ lệ đột biến gene K-RAS ở bệnh nhân bị ung thƣ
biểu mô đại trực tràng của một số tác giả
92
4.2.
So sánh tỉ lệ đột biến gene K-RAS theo vị trí khối u trên
khung đại tràng của một số tác giả
101

















DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ

Tên biểu đồ
Trang
3.1.
Phân bố tỉ lệ bệnh nhân theo giới tính
55
3.2.
Tỉ lệ đột biến gene K-RAS theo nhóm tuổi
69
3.3.
Tỉ lệ kiểu đột biến gene K-RAS
70
3.4.
Tỉ lệ đột biến gene K-RAS theo vị trí u trên khung đại tràng
74
3.5.
Tỉ lệ đột biến gene K-RAS theo kích thƣớc khối u
75
3.6.
Tỉ lệ đột biến gene K-RAS theo mức độ xâm lấn khối u so
với chu vi lòng đại trực tràng
76
3.7.
Tỉ lệ đột biến gene K-RAS theo mức độ ác tính khối u
78
3.8.
Tỉ lệ đột biến gene K-RAS ở bệnh nhân ung thƣ biểu mô
tuyến nhày và không phải ung thƣ biểu mô tuyến nhày
79
3.9.
Tỉ lệ đột biến gene K-RAS theo mức độ xâm lấn khối u vào

thành đại trực tràng
80
3.10.
Tỉ lệ bệnh nhân có và chƣa có di căn hạch
81

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình
Tên hình
Trang
1.1.
Sơ đồ vị trí gene K-RAS nằm trên vai ngắn của nhiễm sắc thể 12
9
1.2.
Con đƣờng truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR
14
1.3.
Vai trò của đột biến gene K-RAS trong việc hoạt hóa gây ung
thƣ các con đƣờng truyền tín hiệu nội bào
16
1.4.
Quá trình phát sinh ung ung thƣ đại trực tràng qua nhiều bƣớc
21
2.1.
Máy đọc trình tự gene 3100-Avant Genetic Analyzer (hãng
ABI-PRISM, USA)
39
2.2.
Sơ đồ qui trình nghiên cứu
42
3.1.
Ung thƣ đại trực tràng thể sùi
60
3.2.
Ung thƣ đại trực tràng thể “sùi + loét”

60
3.3.
Ung thƣ đại trực tràng thể nhẫn
60
3.4.
Ung thƣ đại trực tràng thể thâm nhiễm
60
3.5.
Ung thƣ biểu mô tuyến biệt hóa cao
61
3.6.
Ung thƣ biểu mô tuyến biệt hóa vừa
62
3.7.
Ung thƣ biểu mô tuyến biệt hóa thấp
62
3.8.
Ung thƣ biểu mô tuyến nhày
63
3.9.
Ung thƣ biểu mô tế bào nhẫn
63
3.10.
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gene K-RAS
65
3.11.
Hình ảnh gene K-RAS bình thƣờng tại vị trí codon 12, 13
66
3.12.
Hình ảnh gene K-RAS đột biến tại vị trí codon 12, GGT  GAT

67
3.13.
Hình ảnh gene K-RAS đột biến tại codon 12, GGT  GTT
68


1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư (UT) là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu
trên thế giới, bệnh có xu hướng ngày càng gia tăng. Dựa trên ước tính tình
hình ung thư toàn cầu năm 2008 (GLOBOCAN 2008), trên thế giới có
khoảng 12.700.000 trường hợp UT và 7.600.000 trường hợp tử vong do UT
trong năm 2008 [75].
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là nguyên nhân gây tử vong cao hàng
thứ 3 trong các tử vong do UT nói chung. Theo Hiệp hội phòng chống UT
quốc tế (Union for International Cancer Control - UICC), ước tính trên thế
giới mỗi năm có khoảng 1.000.000 trường hợp UTĐTT mới được phát hiện
và khoảng hơn 500.000 người chết vì căn bệnh này [36]. Tỉ lệ mắc bệnh giữa
các vùng miền, các châu lục có sự khác nhau. Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ
5 sau các UT của dạ dày, phổi, vú và vòm họng. Trong UT đường tiêu hóa thì
UTĐTT đứng thứ 2, sau UT dạ dày. Theo thống kê của Bệnh viện K Hà Nội,
tỉ lệ mắc UTĐTT là 9% tổng số bệnh nhân (BN) UT nói chung. Tuy nhiên, so
với các UT của đường tiêu hóa thì UTĐTT là loại có tiên lượng tốt nhất [1],
[8], [18], [19].
Cơ chế hình thành và phát triển của UTĐTT là do biến đổi và tích lũy
các gene trong tế bào của niêm mạc đại trực tràng (ĐTT). Sự tích lũy dần các
biến dị di truyền thường phải trải qua nhiều năm (từ 10 - 20 năm), và điều này
phù hợp với các nghiên cứu dịch tễ học di truyền về diễn biến của UTĐTT
trải qua nhiều bước [32], [76].

Sự phát triển vượt bậc của ngành Công nghệ y sinh, hiện nay đã cho
phép xác định tương đối chính xác, đầy đủ và nhanh hầu như tất cả các dạng
đột biến quan trọng trong những dòng tế bào UT phổ biến như UT phổi, u
lympho ác tính, UTĐTT…. Điều đáng ngạc nhiên là mặc dù mang nhiều đột

2
biến nhưng khả năng phát triển của tế bào UT dường như lại lệ thuộc chủ yếu
vào nguồn tín hiệu sinh trưởng của một hoặc một nhóm gene sinh UT
(oncogene) nhất định. Những oncogene này mã hóa các protein đóng vai trò
mắt xích trong các con đường tín hiệu nội bào. Những đột biến này làm cho
các tế bào UT có khả năng tăng sinh vô hạn, liên tục phân chia và thực hiện
quá trình xâm lấn, di căn… Tuy nhiên, chính đặc điểm này cũng làm phơi bày
“gót chân Achilles” của tế bào UT. Bằng việc “đánh sập” các oncogene chủ
chốt như HER2, K-RAS, β-catenin, cyclin E, B-Raf… bằng công nghệ iRNA,
các nhà khoa học đã thành công trong việc ức chế sự phát triển của nhiều loại
tế bào UT in vitro [49]. Những nghiên cứu trên mô hình chuột biến đổi gene
tiếp tục khẳng định tầm quan trọng của các gene đích trong nhiều bệnh UT,
trong đó có oncogene K-ras trong UTĐTT [74] Từ những bằng chứng trên,
một thế hệ mới các thuốc điều trị UT có khả năng tác động chính xác tới các
đích tiềm năng trong tế bào UT đã ra đời - đó là liệu pháp điều trị đích.
Ở Việt Nam, cũng đã có nhiều nghiên cứu về UTĐTT, nhưng chủ yếu
là về đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi và mô bệnh học (MBH), còn ít thấy
có những nghiên cứu về đột biến gene trong UT nói chung và trong UTĐTT
nói riêng. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu sự đột biến gene K-RAS và mối liên
quan đột biến gene K-RAS với một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng
bệnh ung thư đại trực tràng” được tiến hành nhằm 2 mục tiêu chính sau:
1. Nghiên cứu tình trạng đột biến gene K-RAS ở bệnh nhân ung thư
biểu mô đại trực tràng.
2. Tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến gene K-RAS với một số đặc
điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, mô bệnh học và nồng độ CEA ở bệnh

nhân ung thư biểu mô đại trực tràng.




3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1. Gene và ung thƣ đại trực tràng
Từ những nghiên cứu về cơ chế phát sinh và phát triển UTĐTT có sự
liên quan đến sự biến đổi các gene tham gia vào sự chuyển dạng từ tế bào
lành sang tế bào UT. Các gene này được chia thành 3 nhóm: gene UT, gene
ức chế UT và các gene sửa chữa DNA [49]. Để hình thành UT phải có sự đột
biến ở cả 2 nhóm gene UT và gene ức chế UT. Khi gene tiền UT bị đột biến
thành gene UT và gene ức chế UT bị bất hoạt hoặc bị tổn thương, lúc đó các
tín hiệu cho tế bào phát triển vượt quá các tín hiệu điều hòa thì sự phát
triển của tế bào sẽ nhanh chóng vượt khỏi tầm kiểm soát và ung thư
hình thành [2], [29], [93].
1.1.1. Các gene ung thư
Gene UT (oncogene) được định nghĩa là các gene đột biến mà các biến
đổi của chúng gây ra nguy cơ UT hoặc thúc đẩy quá trình UT. Bình thường
các gene UT ở trạng thái gene tiền ung thư có vai trò trong sự điều hòa chu
trình tế bào, phát triển và biệt hóa tế bào [49]. Khi bị đột biến các gene tiền
UT sẽ biểu hiện quá mức các tín hiệu phân chia tế bào làm các tế bào tăng
sinh thừa thãi, trở thành những gene UT (oncogene) [140]. Một số gene UT
được cho là có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển UTĐTT đó là:
1.1.1.1. Gene RAS
Các gene ung thư được khẳng định có liên quan đến UTĐTT là họ gene
RAS bao gồm H-RAS, K-RAS, N-RAS, mã hóa cho một protein 21-kDa.

Protein RAS có vai trò trong việc truyền tín hiệu từ bề mặt tế bào vào trong
nhân, điều hòa khung xương tế bào và phân chia tế bào. Dạng đột biến gene

4
RAS, gây hoạt hóa một loạt các protein kinase thành làn sóng, gây ra
phosphoryl các phân tử protein truyền tín hiệu nhân. Chức năng gene RAS bị
hoạt hóa cũng liên quan đến yếu tố sinh mạch và chết tế bào theo chương
trình (apoptosis) [38], [144].
Đột biến K-RAS2 được phát hiện từ 37 - 41% tất cả các UTĐTT. Đột
biến gene K-RAS và N-RAS cũng được tìm thấy trong 50% các khối u ĐTT
[50]. Tần số đột biến tăng theo kích thước và độ loạn sản của polype, tuy
nhiên tần số này không tăng khi chuyển từ polype sang UT. Các u tuyến với
đường kính > 1cm có tần số đột biến gene K-RAS là 50% [48], tương tự như
đột biến gặp trong UT. Ngược lại, u tuyến có đường kính nhỏ (< 1cm) chỉ có
< 10% gene RAS bị đột biến, chứng tỏ đột biến gene RAS là đột biến mắc phải
trong quá trình u tuyến phát sinh, đột biến gene RAS dường như có vai trò tiên
phong trong u tuyến [50].
1.1.1.2. Giảm methyl hóa DNA
Methyl hóa DNA có vai trò phức tạp trong phát triển UT. Giảm methyl
hóa do Bodmer, Bishop và Karran đưa ra năm 1994, liên quan đến tăng biểu
hiện gene và có thể đóng vai trò hoạt hóa các gene UT như K-RAS. Tương tự
như sự tăng hoạt hóa DNA có thể xảy ra đồng thời với giảm methyl hóa tại
vùng khác của bộ gene trong nhiều loại UT [49], [50].
1.1.1.3. Gene C-MYC
Gene MYC (Myelocytomatosis) mã hóa cho các yếu tố phiên mã trực
tiếp liên quan đến sự phát triển khối u. Sản phẩm protein mã hóa bởi gene
MYC có cấu trúc bình thường, nhưng gia tăng về số lượng, hậu quả sự hoạt
hóa gene MYC là tăng biểu hiện gene. Các gene MYC đôi khi cũng được
coi là gene tiền UT, các tế bào mang gene tiền ung thư MYC được gọi
là C-MYC [49], [50], [132].

5
1.1.2. Các gene áp chế ung thư
Gene áp chế UT (tumor suppressor gene) là một loại gene UT được tạo
ra do sự đột biến làm mất chức năng. Bình thường các gene này liên quan đến
kiểm soát hoặc ức chế phân chia tế bào, biệt hóa tế bào hoặc mã hóa tế bào
chết theo chương trình. Sự mất hoạt tính của các gene này gây ra mất khả
năng kiểm soát sự phát triển bình thường của tế bào, làm biến đổi tế bào lành
thành tế bào ác tính [52].
1.1.2.1. Gene APC
Sự phát hiện ra sự biến đổi di truyền trong bệnh đa polype tuyến gia đình
(Familial adenomatous polyposis - FAP) là cơ sở cho sự phát minh gene đa
polype tuyến ĐT (Adenomatous polyposis Coli - APC). Gene APC nằm trên
5q21, mã hóa cho một protein gồm 2843 axit amin, gen APC có chức năng ức
chế UT [50]. APC là một gene đích quan trọng nhất trong sự phát triển
UTĐTT và được coi là gene giữ cổng (gatekeeper) [50], giúp kiểm soát sự
phát triển của tế bào theo một số cơ chế khác nhau, bao gồm điều hòa kết dính
tế bào, xử lý con đường truyền tín hiệu, duy trì khung xương tế bào, phân chia
tế bào và chết tế bào theo chương trình. Mất hoặc bất hoạt gene APC dẫn đến
mất cân bằng phân chia tế bào, sự chết của tế bào và rối loạn phát triển của tế
bào. Đột biến gene APC gặp trong 70% tất cả các UTĐTT, các nghiên cứu
đều thống nhất là sự bất hoạt chức năng gene APC tạo ra một làn sóng ban
đầu cho sự lan tràn dòng tế bào tiền UT. Gene APC dường như có liên quan
đến khởi phát của polype tuyến [71].
1.1.2.2. Gene P53
Protein p53 được Lane D. và Levine A. phát hiện vào năm 1979. Gene
P53 mã hóa cho protein p53 chứa 393 axít amin, là một gene ức chế UT [50].
Gene P53 có chức năng chủ yếu đáp ứng lại các tổn thương DNA, trong pha

6

(G1), kích thích sửa chữa DNA và thúc đẩy chết tế bào theo chương trình,
gene P53 đóng vai trò chủ đạo trong việc duy trì tính ổn định của DNA nên
nó được coi là “người trông giữ bộ gene” [56], [118]. Khi gene P53 bị đột
biến, cơ chế này bị mất đi và các dòng tế bào có thể có thêm các đột biến khác
để tiến triển UT. Trong quá trình phát triển UTĐTT, đột biến gene P53 có thể
xảy ra do sự mất đi của nhiễm sắc thể hoặc do mất tính dị hợp tử. Đột biến
gene P53 gặp ở 50% trong các UT ở người và hơn 50% trong các ung thư
biểu mô tuyến (UTBMT) ĐTT. Nhưng đột biến gene P53 rất hiếm gặp trong
polype tuyến [50], [73]. Như vậy, bất hoạt gene P53 có liên quan đến quá
trình chuyển từ polype tuyến lành tính sang UT.
1.1.2.3. Gene MCC
Gene MCC (mutated in colon cancer), nằm trên 5q2, gần gene FAP.
Gene MCC mã hóa cho một protein gồm 829 axít amin, gần giống với cấu
trúc protein APC. Dường như có liên quan về vai trò của gene này với gene
APC nhưng chưa được rõ [49].
1.1.2.4. Gen DCC
Gene DCC (deleted in colon cancer) nằm trên vai dài nhiễm sắc thể 18
(18q21), là gene ức chế UT. Vai trò của gene DCC trong ức chế UT là làm
mất tương tác bình thường giữa các tế bào. Đột biến gene DCC gặp 13%
trong UTĐTT, tuy nhiên vai trò chính xác của gene DCC còn chưa được rõ.
Đột biến gene DCC ít gặp trong u tuyến nhỏ, nhưng khi u tuyến phát triển
thành ung thư biểu mô (UTBM) tại chỗ thì tần số đột biến lại tăng lên, tăng
cùng với sự phát triển xâm lấn của khối u [50].
1.1.2.5. Gene R11
Gene R11 mã hóa cho thụ thể truyền tín hiệu yếu tố phát triển n-2
(TGF-2). Gene R11 ức chế tế bào phát triển trong ĐTT và liên quan đến chết

7
tế bào theo chương trình. Ung thư có thể phát triển khi đột biến ảnh hưởng
đến cơ chế kiểm soát chết tế bào theo chương trình. Trong các khối u có tính

không ổn định về vi vệ tinh (Microsatellite instability - MSI), 80 - 90% có đột
biến gene R11 [49], [85], [103]. Tuy nhiên, cần phải có đột biến gene khác
cùng với MSI thì khối u mới phát sinh.
1.1.2.6. Gene SMAD4
Là thành viên của họ gene SMAD tạo nên mạng lưới liên kết nội bào, vai
trò của gene SMAD4 là mã hóa cho protein vừa nhận tín hiệu từ bề mặt màng
vào trong nhân tế bào, đột biến gene SMAD4 gặp từ 10 - 30% trong UTĐTT
[50]. Hệ thống SMAD có cơ chế bảo đảm cho tế bào có sự nhạy cảm khác
nhau đối với môi trường ngoại bào, gene SMAD4 dường như là một đích bất
hoạt trong UTĐTT và đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn giữa của quá
trình phát sinh UTĐTT [51], [102], [117].
1.1.3. Các gene sửa chữa lỗi ghép cặp sai (DNA-mismatch repair)
Gene hMSH2 ở vị trí nhiễm sắc thể số 2 (2p16) và gene hMLH1 ở nhiễm
sắc thể số 3 (3p21), các gene này đóng vai trò phát triển UTĐTT di truyền
không polype - Hội chứng Lynch (Hereditary non-polyposis colorectal cancer
- HNPCC). Chúng có nhiệm vụ sửa chữa DNA tổn thương trong quá trình sao
chép DNA. Đột biến những gene này làm sao chép DNA sai lệch dẫn đến đột
biến tăng lên, ngoài gặp trong hội chứng Lynch còn gặp 15% trong UTĐTT
tản phát [48], [116].
Như vậy, trong quá trình phát sinh UTĐTT có nhiều gene tham
gia. Dưới đây là một số gene tham gia vào quá trình phát triển UTĐTT
[49], [84], [125].

8
Bảng 1.1. Một số gene tham gia vào quá trình
phát triển ung thƣ đại trực tràng
Gene
Vị trí
trên NST
Hội chứng

Protein
APC
[50]
5q21
Đa polype tuyến
gia đình
Kết dính tế bào, kiểm soát C-
MYC, chết tế bào theo
chương trình
hMSH2
[48]
2p16
UTĐTT di truyền
không polype
Sửa chữa lỗi ghép cặp DNA
hMLH1
[116]
3p21
UTĐTT di truyền
không polype
Sửa chữa lỗi ghép cặp DNA
P53
[50]
17p13
Ức chế khối u, sửa
chữa DNA tổn
thương, chết tế bào
theo chương trình
Kiểm soát chu kỳ tế bào
DCC

[50]
18q21
Gene ức chế khối u
Liên kết tế bào
MCC
[49]
5q21
Gene ức chế khối u
Chưa rõ
K-RAS
[45]
12p
Gene gây ung thư
Gắn GTP
C-MYC
[50]
8q24
Gene gây ung thư
Tổng hợp DNA
R11
[85]
6q26
Gene ức chế khối u
Gene tiếp nhận TGF-2
IGF-IIR
[103]

Gene ức chế khối u
Hoạt hóa TGF-

1.2. Gene K-RAS và ung thƣ đại trực tràng
1.2.1. Gene K-RAS
Kể từ khi được phát hiện ra từ những thập niên 70 của thế kỉ 20, cấu
trúc, chức năng và vai trò của gene K-RAS ngày càng được sáng tỏ.

9
1.2.1.1. Cấu trúc gene K-RAS
Gene K-RAS nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 12, ở vị trí 12.1:
(12p12.1). Cụ thể là các gene K-RAS nằm từ nucleotid 25358179 đến
nucleotid 25403853 trên nhiễm sắc thể 12 [45], [97].
K-RAS


Hình 1.1. Vị trí gene K-RAS trên nhiễm sắc thể 12
Nguồn: theo McGrath J.P. (1983) [97]
1.2.1.2. Chức năng của gene K-RAS
Gene K-RAS là các gene sinh UT, mỗi gene K-RAS mã hóa cho một protein
tham gia chủ yếu trong việc điều hành phân chia tế bào. Thông qua một quá
trình truyền tín hiệu (transduction), protein truyền tín hiệu từ ngoài tế bào vào
đến nhân tế bào. Các tín hiệu này kích hoạt tế bào để phát triển và phân chia
hoặc trưởng thành với những chức năng chuyên biệt. Các protein K-RAS là một
GTPase. GTPase là một enzyme có chức năng chuyển đổi một phân tử gọi là
GTP (Guanosine-5
,
-Triphosphate) đến một phân tử gọi là GDP (Guanosine-5
,
-
Diphosphate). Các protein K-RAS hoạt động như một chuyển đổi, nó có thể hoạt
động (kích hoạt) hay yên nghỉ (bất hoạt). Để truyền tín hiệu, các protein K-RAS
phải được kích hoạt bằng cách gắn vào một phân tử của GTP. Các protein K-RAS

10
được bất hoạt khi nó chuyển đổi các GTP tới GDP, khi protein kết hợp với GDP,
nó không truyền tín hiệu tới nhân tế bào [91], [106], [110].
Những sản phẩm protein của gene K-RAS đóng vai trò quan trọng trong
phân bào, sự khác biệt tế bào và sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis)
[45], [58] [88], [89], [97].
1.2.1.3. Cơ chế sinh ung thư của gene K-RAS
Dưới tác dụng của các yếu tố môi trường (bức xạ, hóa chất ), sự đột
biến gene K-RAS có thể xảy ra. Khi đột biến, các gene K-RAS có tiềm năng
gây chuyển biến tế bào bình thường thành tế bào UT. Đột biến gene K-RAS
làm thay đổi một protein (amino acid) trong một khu vực quan trọng của
protein K-RAS, gây ra các protein để được tiếp tục hoạt động. Thay vì kích
hoạt sự tăng trưởng tế bào để phản ứng lại các tín hiệu đặc biệt từ bên ngoài tế
bào, protein hoạt động quá mức (overactive protein) chỉ đạo các tế bào phát
triển và phân chia không ngừng. Trong quá trình phát triển phôi, các protein
K-RAS hoạt động quá mức phá vỡ sự phát triển bình thường và trở thành các
mô nhất định [74], [82], [90], [119].
Một số đột biến gene được hình thành trong thời gian của mỗi con người
và chỉ có mặt trong các tế bào nhất định. Những thay đổi này gọi là đột biến
thân (hay đột biến soma). Sự đột biến soma trong gene K-RAS có liên quan
đến sự phát triển của nhiều loại UT. Những đột biến này dẫn đến một protein
K-RAS đó là luôn luôn chủ động và có thể tác động trực tiếp đến tế bào để
phát triển và phân chia không có kiểm soát [45], [70], [97].
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, đột biến gene K-RAS là phổ biến trong UTĐTT.
1.2.2. Các phương pháp xác định đột biến gene K-RAS
Nhiều phương phương pháp khác nhau có thể được áp dụng để xác định
đột biến gene K-RAS trên cơ sở tỉ lệ tế bào UT trong mô phân tích.

11

1.2.2.1. Kỹ thuật giải trình tự gene
Đây là phương pháp thường được sử dụng khi mật độ tế bào UT trong
mô phân tích  30%. Với tỉ lệ này, việc xác định đột biến gene bằng
phương pháp giải trình tự gene trực tiếp có độ nhạy và độ đặc hiệu lên đến
99%. DNA của bệnh nhân tách chiết từ mẫu mô được sử dụng để khuếch
đại gene K-RAS bằng phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain
Reaction - PCR) sau khi tinh sạch được đưa vào giải trình tự trực tiếp sử
dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems,
Foster city, USA). Trình tự gene được đối chiếu với trình tự gene K-RAS
hoang dại trên GenBank (National center for biotechnology information -
NCBI) và phân tích theo phương pháp ABI Prism 310 genetic analyzer
(Applied Biosystems) [47].
1.2.2.2. Kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction
Fragment Length Polymorphism)
Phương pháp phát hiện đột biến bằng kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên
nguyên lý: trình tự kiểu dại codon 12 thuộc exon 2 của gene K-RAS có vị
trí nhận biết của enzyme giới hạn BstNI, đột biến tại codon 12 làm mất vị
trí cắt của enzyme BstNI. Với kỹ thuật này thì sản phẩm PCR khuếch đại
exon 2 gene K-RAS được phân cắt bởi enzyme BstNI. Sản phẩm cắt bằng
enzyme được điện di phân tích trên gel agarose NuSieve GTG nồng độ 3%
sẽ xác định được đột biến điển hình trên gene K-RAS. Đây là phương pháp
truyền thống, đơn giản, rẻ tiền nhưng rất hiệu quả và cho độ tin cậy cao
trong trường hợp xác định đột biến điển hình. Phương pháp này hứa hẹn
khả năng áp dụng rộng rãi và hiệu quả trong việc sàng lọc nhanh các đột
biến tại codon 12 của gene K-RAS [137], [145].

12
1.2.2.3. Kỹ thuật Scorpions-Amplification Refractory Mutation System
(Scorpions ARMS)
Hiện nay, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng nhằm phát

hiện đột biến gene K-RAS. Tuy nhiên, chỉ một vài kỹ thuật được các cơ quan
quản lý Y Dược của Châu Âu và Hoa Kỳ cấp giấy phép công nhận đạt tiêu
chuẩn ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng. Kỹ thuật Scorpions ARMS là một
trong số ít những kỹ thuật đó (European Union in vitro Diagnostic Medical
Device Directive 98/79/EC). Scorpions ARMS là sự kết hợp của kỹ thuật
khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpions trong
phản ứng Real time PCR để phát hiện các đột biến. Trong đó, nguyên lý của
kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tính của Taq DNA
polymerase chỉ khuếch đại hoàn chỉnh 1 phân tử DNA một khi đầu 3’ của mồi
và sợi khuôn bổ xung hoàn toàn với nhau. Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung
với sợi khuôn phản ứng PCR sẽ bị ức chế hoàn toàn. Dựa trên nguyên lý này,
kỹ thuật cho phép khuếch đại đặc hiệu một trình tự đột biến ngay cả trong
trường hợp alen đột biến đó chiếm 1 tỉ lệ rất nhỏ trong tổng số sợi khuôn
DNA. Scorpions là phân tử có cấu tạo một đầu mang trình tự của đoạn mồi
đặc hiệu với alen đột biến cần khuếch đại, đầu trình tự này được nối với một
đầu dò. Fluorophore phát tín hiệu huỳnh quang của đầu dò được gắn với
quencher có nhiệm vụ dập tắt tín hiệu huỳnh quang của fluorophore. Trong
phản ứng PCR khi đầu dò bám với đoạn trình tự khuếch đại,
Fluorophore được giải phóng khỏi quencher, phát tín hiệu đến cảm biến
của máy Realtime - PCR [55].
1.2.2.4. Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp)
Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp) là một công nghệ
mới nhất được phát triển bởi các nhà khoa học tại Viện công nghệ RIKEN-
Nhật Bản nhằm phát hiện các đột biến trên gene K-RAS. Nguyên lý cơ bản

13
của kỹ thuật SmartAmp là: “Khuếch đại DNA = Phát hiện đột biến”. Để
thực hiện được nguyên lý này, kỹ thuật SmartAmp sử dụng các cặp mồi phát
hiện đột biến (I) được thiết kế bất đối xứng nhằm giảm thiểu các khả năng
mồi ghép cặp sai với sợi khuôn (II), một loại protein mới với khả năng nhận

biết và bám đặc hiệu tại vị trí có sự ghép cặp không tương đồng giữa mồi và
khuôn (TaqMutS) ngăn không cho phức hợp mồi - khuôn được khuếch đại
trong phản ứng kéo dài chuỗi. Chỉ những phức hợp mồi - khuôn DNA ghép
cặp hoàn toàn mới được khuếch đại nhờ DNA polymerase, tín hiệu của sản
phẩm khuếch đại đặc hiệu đột biến được phát hiện trong hệ thống máy
Realtime - PCR. Thực tế cho thấy một trong những khó khăn của việc áp
dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như giải trình tự, Scorpions ARMS trong
thực tế lâm sàng thường đòi hỏi qua nhiều bước, đội ngũ kỹ thuật viên có kiến
thức chuyên sâu về sinh học phân tử, giá thành cao, thời gian phân tích kết quả
lâu. Các công trình nghiên cứu áp dụng kỹ thuật SmartAmp cho thấy kỹ thuật
vận hành qua 1 bước duy nhất “khuếch đại DNA = phát hiện đột biến”, có độ
chính xác cao, thời gian từ khâu tách mẫu đến cho kết quả phân tích đột biến
gene rất ngắn, chỉ khoảng 30 phút. Đây là một ưu thế nổi bật của kỹ thuật
SmartAmp so với các kỹ thuật khác như giải trình tự gene (1 - 2 ngày), PCR -
RFLP (1 - 2 ngày), Scorpions ARMS (3 - 4 giờ) [55], [79], [87]. Một khi kỹ
thuật SmartAmp được áp dụng thành công, kỹ thuật mới này sẽ là một công cụ
đắc lực giúp các nhà Y Sinh học và các bác sĩ lâm sàng Việt Nam hiện thực
hóa mục tiêu y học: Điều trị bệnh theo thực trạng bộ gene của cá thể.
Kể từ khi được khám phá từ những thập niên 70 của thế kỷ 20, gene
K-RAS tiếp tục được nghiên cứu nhằm sáng tỏ vai trò mới trong việc tiên
lượng hiệu quả đáp ứng thuốc trên các nhóm BN UT khác nhau. Những tiến
bộ trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe được thừa hưởng những thành tựu khoa
học trong lĩnh vực y sinh. Do vậy, trong tương lai, các nhà nghiên cứu cũng
như các bác sĩ lâm sàng cần phải giải đáp những câu hỏi như: Đột biến gene