Nghiên cứu sự đột biến gene k RAS và mối liên quan đột biến gene k RAS với một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh ung thư đại trực tràng

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư (UT) là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu
trên thế giới, bệnh có xu hướng ngày càng gia tăng. Dựa trên ước tính tình
hình UT tồn cầu năm 2008 (GLOBOCAN 2008), trên thế giới có khoảng
12.700.000 trường hợp UT và 7.600.000 trường hợp tử vong do UT trong
năm 2008 [75].
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là nguyên nhân gây tử vong cao hàng
thứ 3 trong các tử vong do UT nói chung. Theo Hiệp hội phòng chống UT
quốc tế (Union for International Cancer Control - UICC), ước tính trên thế
giới mỗi năm có khoảng 1.000.000 trường hợp UTĐTT mới được phát hiện
và khoảng hơn 500.000 người chết vì căn bệnh này [36]. Tỉ lệ mắc bệnh giữa
các vùng miền, các châu lục có sự khác nhau. Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ
5 sau các UT của dạ dày, phổi, vú và vòm họng. Trong UT đường tiêu hóa thì
UTĐTT đứng thứ 2, sau UT dạ dày. Theo thống kê của Bệnh viện K Hà Nội,
tỉ lệ mắc UTĐTT là 9% tổng số bệnh nhân (BN) UT nói chung. Tuy nhiên, so
với các UT của đường tiêu hóa thì UTĐTT là loại có tiên lượng tốt nhất [1],
[8], [18], [19].
Cơ chế hình thành và phát triển của UTĐTT là do biến đổi và tích lũy
các gen trong tế bào của niêm mạc đại trực tràng (ĐTT). Sự tích lũy dần các
biến dị di truyền thường phải trải qua nhiều năm (từ 10 - 20 năm), và điều này
phù hợp với các nghiên cứu dịch tễ học di truyền về diễn biến của UTĐTT
trải qua nhiều bước [32], [76].
Sự phát triển vượt bậc của ngành Công nghệ y sinh, hiện nay đã cho
phép xác định tương đối chính xác, đầy đủ và nhanh hầu như tất cả các dạng
đột biến quan trọng trong những dòng tế bào UT phổ biến như UT phổi, u
lympho ác tính, UTĐTT…. Điều đáng ngạc nhiên là mặc dù mang nhiều đột


2

biến nhưng khả năng phát triển của tế bào UT dường như lại lệ thuộc chủ yếu
vào nguồn tín hiệu sinh trưởng của một hoặc một nhóm gen sinh UT
(oncogene) nhất định. Những oncogene này mã hóa các protein đóng vai trị
mắt xích trong các con đường tín hiệu nội bào. Những đột biến này làm cho
các tế bào UT có khả năng tăng sinh vơ hạn, liên tục phân chia và thực hiện
quá trình xâm lấn, di căn… Tuy nhiên, chính đặc điểm này cũng làm phơi bày
“gót chân Achilles” của tế bào UT. Bằng việc “đánh sập” các oncogene chủ
chốt như HER2, K-RAS, β-catenin, cyclin E, B-Raf… bằng công nghệ iRNA,
các nhà khoa học đã thành công trong việc ức chế sự phát triển của nhiều loại
tế bào UT in vitro [49]. Những nghiên cứu trên mơ hình chuột biến đổi gen
tiếp tục khẳng định tầm quan trọng của các gen đích trong nhiều bệnh UT,
trong đó có oncogene K-ras trong UTĐTT [74]... Từ những bằng chứng trên,
một thế hệ mới các thuốc điều trị UT có khả năng tác động chính xác tới các
đích tiềm năng trong tế bào UT đã ra đời - đó là liệu pháp điều trị đích.
Ở Việt Nam, cũng đã có nhiều nghiên cứu về UTĐTT, nhưng chủ yếu
là về đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi và mơ bệnh học (MBH), cịn ít thấy
có những nghiên cứu về đột biến gen trong UT nói chung và trong UTĐTT
nói riêng. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu đột biến gen K-RAS và mối liên quan
với một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ung thư đại trực tràng” được
tiến hành nhằm 2 mục tiêu chính sau:
1. Nghiên cứu tình trạng đột biến gen K-RAS ở bệnh nhân ung thư
biểu mô đại trực tràng.
2. Tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS với một số đặc
điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh và nồng độ CEA ở bệnh
nhân ung thư biểu mô đại trực tràng.


3

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN
1.1. Gen và ung thư đại trực tràng
Từ những nghiên cứu về cơ chế phát sinh và phát triển UTĐTT có sự
liên quan đến sự biến đổi các gen tham gia vào sự chuyển dạng từ tế bào lành
sang tế bào UT. Các gen này được chia thành 3 nhóm: gen UT, gen ức chế
UT và các gen sửa chữa DNA [49]. Để hình thành UT phải có sự đột biến ở
cả 2 nhóm gen UT và gen ức chế UT. Khi gen tiền UT bị đột biến thành gen
UT và gen ức chế UT bị bất hoạt hoặc bị tổn thương, lúc đó các tín hiệu cho
tế bào phát triển vượt q các tín hiệu điều hịa thì sự phát triển của tế
bào sẽ nhanh chóng vượt khỏi tầm kiểm sốt và UT hình thành [2],
[29], [93].
1.1.1. Các gen ung thư
Gen UT (oncogene) được định nghĩa là các gen đột biến mà các biến đổi
của chúng gây ra nguy cơ UT hoặc thúc đẩy quá trình UT. Bình thường các
gen UT ở trạng thái gen tiền UT có vai trị trong sự điều hịa chu trình tế bào,
phát triển và biệt hóa tế bào [49]. Khi bị đột biến các gen tiền UT sẽ biểu hiện
quá mức các tín hiệu phân chia tế bào làm các tế bào tăng sinh thừa thãi, trở
thành những gen UT (oncogene) [140]. Một số gen UT được cho là có vai trị
quan trọng trong q trình phát triển UTĐTT đó là:
1.1.1.1. Gen RAS
Các gen UT được khẳng định có liên quan đến UTĐTT là họ gen RAS
bao gồm H-RAS, K-RAS, N-RAS, mã hóa cho một protein 21-kDa. Protein
RAS có vai trị trong việc truyền tín hiệu từ bề mặt tế bào vào trong nhân,
điều hòa khung xương tế bào và phân chia tế bào. Dạng đột biến gen RAS,


4

gây hoạt hóa một loạt các protein kinase thành làn sóng, gây ra phosphoryl
các phân tử protein truyền tín hiệu nhân. Chức năng gen RAS bị hoạt hóa cũng
liên quan đến yếu tố sinh mạch và chết tế bào theo chương trình (apoptosis)
[38], [144].
Đột biến K-RAS2 được phát hiện từ 37 - 41% tất cả các UTĐTT. Đột
biến gen K-RAS và N-RAS cũng được tìm thấy trong 50% các khối u ĐTT
[50]. Tần số đột biến tăng theo kích thước và độ loạn sản của polype, tuy
nhiên tần số này không tăng khi chuyển từ polype sang UT. Các u tuyến với
đường kính > 1cm có tần số đột biến gen K-RAS là 50% [48], tương tự như
đột biến gặp trong UT. Ngược lại, u tuyến có đường kính nhỏ (< 1cm) chỉ có
< 10% gen RAS bị đột biến, chứng tỏ đột biến gen RAS là đột biến mắc phải
trong quá trình u tuyến phát sinh, đột biến gen RAS dường như có vai trị tiên
phong trong u tuyến [50].
1.1.1.2. Giảm methyl hóa DNA
Methyl hóa DNA có vai trị phức tạp trong phát triển UT. Giảm methyl
hóa do Bodmer, Bishop và Karran đưa ra năm 1994, liên quan đến tăng biểu
hiện gen và có thể đóng vai trị hoạt hóa các gen UT như K-RAS. Tương tự
như sự tăng hoạt hóa DNA có thể xảy ra đồng thời với giảm methyl hóa tại
vùng khác của bộ gen trong nhiều loại UT [49], [50].
1.1.1.3. Gen C-MYC
Gen MYC (Myelocytomatosis) mã hóa cho các yếu tố phiên mã trực tiếp
liên quan đến sự phát triển khối u. Sản phẩm protein mã hóa bởi gen MYC có
cấu trúc bình thường, nhưng gia tăng về số lượng, hậu quả sự hoạt hóa gen
MYC là tăng biểu hiện gen. Các gen MYC đôi khi cũng được coi là gen
tiền UT, các tế bào mang gen tiền ung thư MYC được gọi là C-MYC
[49], [50], [132].


5

1.1.2. Các gen áp chế ung thư
Gen áp chế UT (tumor suppressor gene) là một loại gen UT được tạo ra
do sự đột biến làm mất chức năng. Bình thường các gen này liên quan đến
kiểm soát hoặc ức chế phân chia tế bào, biệt hóa tế bào hoặc mã hóa tế bào
chết theo chương trình. Sự mất hoạt tính của các gen này gây ra mất khả năng
kiểm soát sự phát triển bình thường của tế bào, làm biến đổi tế bào lành thành
tế bào ác tính [52].
1.1.2.1. Gen APC
Sự phát hiện ra sự biến đổi di truyền trong bệnh đa polype tuyến gia đình
(Familial adenomatous polyposis - FAP) là cơ sở cho sự phát minh gen đa
polype tuyến ĐT (Adenomatous polyposis Coli - APC). Gen APC nằm trên
5q21, mã hóa cho một protein gồm 2843 axit amin, gen APC có chức năng ức
chế UT [50]. APC là một gen đích quan trọng nhất trong sự phát triển UTĐTT
và được coi là gen giữ cổng (gatekeeper) [50], giúp kiểm soát sự phát triển
của tế bào theo một số cơ chế khác nhau, bao gồm điều hịa kết dính tế bào,
xử lý con đường truyền tín hiệu, duy trì khung xương tế bào, phân chia tế bào
và chết tế bào theo chương trình. Mất hoặc bất hoạt gen APC dẫn đến mất cân
bằng phân chia tế bào, sự chết của tế bào và rối loạn phát triển của tế bào. Đột
biến gen APC gặp trong 70% tất cả các UTĐTT, các nghiên cứu đều thống
nhất là sự bất hoạt chức năng gen APC tạo ra một làn sóng ban đầu cho sự lan
tràn dòng tế bào tiền UT. Gen APC dường như có liên quan đến khởi phát của
polype tuyến [71].
1.1.2.2. Gen P53
Protein p53 được Lane D. và Levine A. phát hiện vào năm 1979. Gen
P53 mã hóa cho protein p53 chứa 393 axít amin, là một gen ức chế UT [50].
Gen P53 có chức năng chủ yếu đáp ứng lại các tổn thương DNA, trong pha


6

(G1), kích thích sửa chữa DNA và thúc đẩy chết tế bào theo chương trình, gen
P53 đóng vai trị chủ đạo trong việc duy trì tính ổn định của DNA nên nó
được coi là “người trơng giữ bộ gen” [56], [118]. Khi gen P53 bị đột biến, cơ
chế này bị mất đi và các dịng tế bào có thể có thêm các đột biến khác để tiến
triển UT. Trong quá trình phát triển UTĐTT, đột biến gen P53 có thể xảy ra
do sự mất đi của nhiễm sắc thể hoặc do mất tính dị hợp tử. Đột biến gen P53
gặp ở 50% trong các UT ở người và hơn 50% trong các ung thư biểu mô
tuyến (UTBMT) ĐTT. Nhưng đột biến gen P53 rất hiếm gặp trong polyp
tuyến [50], [73]. Như vậy, bất hoạt gen P53 có liên quan đến q trình chuyển
từ polyp tuyến lành tính sang UT.
1.1.2.3. Gen MCC
Gen MCC (mutated in colon cancer), nằm trên 5q2, gần gen FAP. Gen
MCC mã hóa cho một protein gồm 829 axít amin, gần giống với cấu trúc
protein APC. Dường như có liên quan về vai trị của gen này với gen APC
nhưng chưa được rõ [49].
1.1.2.4. Gen DCC
Gen DCC (deleted in colon cancer) nằm trên vai dài nhiễm sắc thể 18
(18q21), là gen ức chế UT. Vai trò của gen DCC trong ức chế UT là làm mất
tương tác bình thường giữa các tế bào. Đột biến gen DCC gặp 13% trong
UTĐTT, tuy nhiên vai trị chính xác của gen DCC cịn chưa được rõ. Đột biến
gen DCC ít gặp trong u tuyến nhỏ, nhưng khi u tuyến phát triển thành ung thư
biểu mơ (UTBM) tại chỗ thì tần số đột biến lại tăng lên, tăng cùng với sự phát
triển xâm lấn của khối u [50].
1.1.2.5. Gen R11
Gen R11 mã hóa cho thụ thể truyền tín hiệu yếu tố phát triển n-2 (TGF2). Gen R11 ức chế tế bào phát triển trong ĐTT và liên quan đến chết tế bào


7

theo chương trình. Ung thư có thể phát triển khi đột biến ảnh hưởng đến cơ

chế kiểm soát chết tế bào theo chương trình. Trong các khối u có tính không
ổn định về vi vệ tinh (Microsatellite instability - MSI), 80 - 90% có đột biến
gen R11 [49], [85], [103]. Tuy nhiên, cần phải có đột biến gen khác cùng với
MSI thì khối u mới phát sinh.
1.1.2.6. Gen SMAD4
Là thành viên của họ gen SMAD tạo nên mạng lưới liên kết nội bào, vai
trị của gen SMAD4 là mã hóa cho protein vừa nhận tín hiệu từ bề mặt màng
vào trong nhân tế bào, đột biến gen SMAD4 gặp từ 10 - 30% trong UTĐTT
[50]. Hệ thống SMAD có cơ chế bảo đảm cho tế bào có sự nhạy cảm khác
nhau đối với môi trường ngoại bào, gen SMAD4 dường như là một đích bất
hoạt trong UTĐTT và đóng vai trị quan trọng trong giai đoạn giữa của q
trình phát sinh UTĐTT [51], [102], [117].
1.1.3. Các gen sửa chữa lỗi ghép cặp sai (DNA-mismatch repair)
Gen hMSH2 ở vị trí nhiễm sắc thể số 2 (2p16) và gen hMLH1 ở nhiễm
sắc thể số 3 (3p21), các gen này đóng vai trị phát triển UTĐTT di truyền
không polype - Hội chứng Lynch (Hereditary non-polyposis colorectal cancer
- HNPCC). Chúng có nhiệm vụ sửa chữa DNA tổn thương trong quá trình sao
chép DNA. Đột biến những gen này làm sao chép DNA sai lệch dẫn đến đột
biến tăng lên, ngoài gặp trong hội chứng Lynch còn gặp 15% trong UTĐTT
tản phát [48], [116].
Như vậy, trong q trình phát sinh UTĐTT có nhiều gen tham gia.
Dưới đây là một số gen tham gia vào quá trình phát triển UTĐTT [49],
[84], [125].


8

Bảng 1.1. Một số gen tham gia vào quá trình
phát triển ung thư đại trực tràng
Gen

Vị trí
trên NST

Hội chứng

Protein

APC
[50]

5q21

Kết dính tế bào, kiểm soát CĐa polyp tuyến gia
MYC, chết tế bào theo
đình
chương trình

hMSH2
[48]

2p16

UTĐTT di truyền
khơng polyp

Sửa chữa lỗi ghép cặp DNA

hMLH1
[116]

3p21

UTĐTT di truyền
không polyp

Sửa chữa lỗi ghép cặp DNA

P53
[50]

17p13

Ức chế khối u, sửa
chữa DNA tổn
thương, chết tế bào
theo chương trình

Kiểm soát chu kỳ tế bào

DCC
[50]

18q21

Gen ức chế khối u

Liên kết tế bào

MCC

[49]

5q21

Gen ức chế khối u

Chưa rõ

K-RAS
[45]

12p

Gen gây UT

Gắn GTP

C-MYC
[50]

8q24

Gen gây UT

Tổng hợp DNA

R11
[85]

6q26

Gen ức chế khối u

Gen tiếp nhận TGF-2

Gen ức chế khối u

Hoạt hóa TGF-

IGF-IIR
[103]

1.2. Gen K-RAS và ung thư đại trực tràng
1.2.1. Gen K-RAS
Kể từ khi được phát hiện ra từ những thập niên 70 của thế kỉ 20, cấu
trúc, chức năng và vai trò của gen K-RAS ngày càng được sáng tỏ.


9

1.2.1.1. Cấu trúc gen K-RAS
Gen K-RAS nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 12, ở vị trí 12.1:
(12p12.1). Cụ thể là các gen K-RAS nằm từ nucleotid 25358179 đến nucleotid
25403853 trên nhiễm sắc thể 12 [45], [97].
K-RAS

Hình 1.1. Vị trí gen K-RAS trên nhiễm sắc thể 12
Nguồn: theo McGrath J.P. (1983) [97]
1.2.1.2. Chức năng của gen K-RAS
Gen K-RAS là các gen sinh UT, mỗi gen K-RAS mã hóa cho một protein

tham gia chủ yếu trong việc điều hành phân chia tế bào. Thơng qua một q
trình truyền tín hiệu (transduction), protein truyền tín hiệu từ ngồi tế bào vào
đến nhân tế bào. Các tín hiệu này kích hoạt tế bào để phát triển và phân chia
hoặc trưởng thành với những chức năng chuyên biệt. Các protein K-RAS là một
GTPase. GTPase là một enzyme có chức năng chuyển đổi một phân tử gọi là
GTP (Guanosine-5,-Triphosphate) đến một phân tử gọi là GDP (Guanosine-5,Diphosphate). Các protein K-RAS hoạt động như một chuyển đổi, nó có thể hoạt
động (kích hoạt) hay n nghỉ (bất hoạt). Để truyền tín hiệu, các protein K-RAS
phải được kích hoạt bằng cách gắn vào một phân tử của GTP. Các protein K-RAS


10

được bất hoạt khi nó chuyển đổi các GTP tới GDP, khi protein kết hợp với GDP,
nó khơng truyền tín hiệu tới nhân tế bào [91], [106], [110].
Những sản phẩm protein của gen K-RAS đóng vai trị quan trọng trong
phân bào, sự khác biệt tế bào và sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis)
[45], [58] [88], [89], [97].
1.2.1.3. Cơ chế sinh ung thư của gen K-RAS
Dưới tác dụng của các yếu tố mơi trường (bức xạ, hóa chất...), sự đột
biến gen K-RAS có thể xảy ra. Khi đột biến, các gen K-RAS có tiềm năng gây
chuyển biến tế bào bình thường thành tế bào UT. Đột biến gen K-RAS làm
thay đổi một protein (amino acid) trong một khu vực quan trọng của protein
K-RAS, gây ra các protein để được tiếp tục hoạt động. Thay vì kích hoạt sự
tăng trưởng tế bào để phản ứng lại các tín hiệu đặc biệt từ bên ngoài tế bào,
protein hoạt động quá mức (overactive protein) chỉ đạo các tế bào phát triển
và phân chia khơng ngừng. Trong q trình phát triển phơi, các protein KRAS hoạt động quá mức phá vỡ sự phát triển bình thường và trở thành các
mơ nhất định [74], [82], [90], [119].
Một số đột biến gen được hình thành trong thời gian của mỗi con người
và chỉ có mặt trong các tế bào nhất định. Những thay đổi này gọi là đột biến
thân (hay đột biến soma). Sự đột biến soma trong gen K-RAS có liên quan đến

sự phát triển của nhiều loại UT. Những đột biến này dẫn đến một protein KRAS đó là ln ln chủ động và có thể tác động trực tiếp đến tế bào để phát
triển và phân chia khơng có kiểm sốt [45], [70], [97].
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, đột biến gen K-RAS là phổ biến trong UTĐTT.
1.2.2. Các phương pháp xác định đột biến gen K-RAS
Nhiều phương phương pháp khác nhau có thể được áp dụng để xác định
đột biến gen K-RAS trên cơ sở tỉ lệ tế bào UT trong mơ phân tích.


11

1.2.2.1. Kỹ thuật giải trình tự gen
Đây là phương pháp thường được sử dụng khi mật độ tế bào UT trong
mơ phân tích  30%. Với tỉ lệ này, việc xác định đột biến gen bằng
phương pháp giải trình tự gen trực tiếp có độ nhạy và độ đặc hiệu lên đến
99%. DNA của bệnh nhân tách chiết từ mẫu mô được sử dụng để khuếch
đại gen K-RAS bằng phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain
Reaction - PCR) sau khi tinh sạch được đưa vào giải trình tự trực tiếp sử
dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems,
Foster city, USA). Trình tự gen được đối chiếu với trình tự gen K-RAS
hoang dại trên GenBank (National center for biotechnology information NCBI) và phân tích theo phương pháp ABI Prism 310 genetic analyzer
(Applied Biosystems) [47].
1.2.2.2. Kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction
Fragment Length Polymorphism)
Phương pháp phát hiện đột biến bằng kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên
nguyên lý: trình tự kiểu dại codon 12 thuộc exon 2 của gen K-RAS có vị trí
nhận biết của enzyme giới hạn BstNI, đột biến tại codon 12 làm mất vị trí
cắt của enzyme BstNI. Với kỹ thuật này thì sản phẩm PCR khuếch đại exon
2 gen K-RAS được phân cắt bởi enzym BstNI. Sản phẩm cắt bằng enzym
được điện di phân tích trên gel agarose NuSieve GTG nồng độ 3% sẽ xác
định được đột biến điển hình trên gen K-RAS. Đây là phương pháp truyền

thống, đơn giản, rẻ tiền nhưng rất hiệu quả và cho độ tin cậy cao trong


12

trường hợp xác định đột biến điển hình. Phương pháp này hứa hẹn khả
năng áp dụng rộng rãi và hiệu quả trong việc sàng lọc nhanh các đột biến
tại codon 12 của gen K-RAS [137], [145].
1.2.2.3. Kỹ thuật Scorpions-Amplification Refractory Mutation System
(Scorpions ARMS)
Hiện nay, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng nhằm phát
hiện đột biến gen K-RAS. Tuy nhiên, chỉ một vài kỹ thuật được các cơ quan
quản lý Y Dược của Châu Âu và Hoa Kỳ cấp giấy phép công nhận đạt tiêu
chuẩn ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng. Kỹ thuật Scorpions ARMS là một
trong số ít những kỹ thuật đó (European Union in vitro Diagnostic Medical
Device Directive 98/79/EC). Scorpions ARMS là sự kết hợp của kỹ thuật
khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpions trong
phản ứng Real time PCR để phát hiện các đột biến. Nguyên lý của kỹ thuật
khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tính của Taq DNA
polymerase chỉ khuếch đại hồn chỉnh 1 phân tử DNA một khi đầu 3’ của mồi
và sợi khn bổ xung hồn tồn với nhau. Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung
với sợi khuôn phản ứng PCR sẽ bị ức chế hoàn toàn. Dựa trên nguyên lý này,
kỹ thuật cho phép khuếch đại đặc hiệu một trình tự đột biến ngay cả trong
trường hợp alen đột biến đó chiếm 1 tỉ lệ rất nhỏ trong tổng số sợi khn
DNA. Scorpions là phân tử có cấu tạo một đầu mang trình tự của đoạn mồi
đặc hiệu với alen đột biến cần khuếch đại, đầu trình tự này được nối với một
đầu dị. Fluorophore phát tín hiệu huỳnh quang của đầu dị được gắn với
quencher có nhiệm vụ dập tắt tín hiệu huỳnh quang của fluorophore. Trong
phản ứng PCR khi đầu dị bám với đoạn trình tự khuếch đại,
Fluorophore được giải phóng khỏi quencher, phát tín hiệu đến cảm biến

của máy Realtime - PCR [55].


13

1.2.2.4. Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp)
Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp) là một công nghệ
mới nhất được phát triển bởi các nhà khoa học tại Viện công nghệ RIKENNhật Bản nhằm phát hiện các đột biến trên gen K-RAS. Nguyên lý cơ bản của
kỹ thuật SmartAmp là: “Khuếch đại DNA = Phát hiện đột biến”. Để thực
hiện được nguyên lý này, kỹ thuật SmartAmp sử dụng các cặp mồi phát hiện
đột biến (I) được thiết kế bất đối xứng nhằm giảm thiểu các khả năng mồi
ghép cặp sai với sợi khuôn (II), một loại protein mới với khả năng nhận biết
và bám đặc hiệu tại vị trí có sự ghép cặp không tương đồng giữa mồi và
khuôn (TaqMutS) ngăn không cho phức hợp mồi - khuôn được khuếch đại
trong phản ứng kéo dài chuỗi. Chỉ những phức hợp mồi - khn DNA ghép
cặp hồn tồn mới được khuếch đại nhờ DNA polymerase, tín hiệu của sản
phẩm khuếch đại đặc hiệu đột biến được phát hiện trong hệ thống máy
Realtime - PCR. Thực tế cho thấy một trong những khó khăn của việc áp
dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như giải trình tự, Scorpions ARMS trong
thực tế lâm sàng thường đòi hỏi qua nhiều bước, đội ngũ kỹ thuật viên có kiến
thức chuyên sâu về sinh học phân tử, giá thành cao, thời gian phân tích kết quả
lâu. Các cơng trình nghiên cứu áp dụng kỹ thuật SmartAmp cho thấy kỹ thuật
vận hành qua 1 bước duy nhất “khuếch đại DNA = phát hiện đột biến”, có độ
chính xác cao, thời gian từ khâu tách mẫu đến cho kết quả phân tích đột biến
gen rất ngắn, chỉ khoảng 30 phút. Đây là một ưu thế nổi bật của kỹ thuật
SmartAmp so với các kỹ thuật khác như giải trình tự gen (1 - 2 ngày), PCR RFLP (1 - 2 ngày), Scorpions ARMS (3 - 4 giờ) [55], [79], [87]. Một khi kỹ
thuật SmartAmp được áp dụng thành công, kỹ thuật mới này sẽ là một công cụ
đắc lực giúp các nhà Y Sinh học và các bác sĩ lâm sàng Việt Nam hiện thực
hóa mục tiêu y học: Điều trị bệnh theo thực trạng bộ gen của cá thể.

14

Kể từ khi được khám phá từ những thập niên 70 của thế kỷ 20, gen
K-RAS tiếp tục được nghiên cứu nhằm sáng tỏ vai trò mới trong việc tiên
lượng hiệu quả đáp ứng thuốc trên các nhóm BN UT khác nhau. Những tiến
bộ trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe được thừa hưởng những thành tựu khoa
học trong lĩnh vực y sinh. Do vậy, trong tương lai, các nhà nghiên cứu cũng
như các bác sĩ lâm sàng cần phải giải đáp những câu hỏi như: Đột biến gen
K-RAS có gây kháng thuốc điều trị đích trên nhóm bệnh nhân UTĐTT; Có
hay khơng những dấu ấn sinh học tiềm năng khác ngồi K-RAS ?. Định
hướng nghiên cứu để tìm ra thế hệ thuốc điều trị đích mới cho những nhóm
BN bị đột biến kháng thuốc ?.
1.2.3. Đột biến gen K-RAS và hiệu quả điều trị đích trên bệnh nhân ung
thư đại trực tràng
Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu trên thế giới được thực hiện nhằm
phân tích tình trạng gen K-RAS (mã hóa cho protein RAS) ở các BN UTĐTT
được điều trị bằng cetuximab hoặc panitumumab. Theo thống kê, oncogene
K-RAS bị đột biến trong hơn 30% các ca UTĐTT. Cho đến nay, có hơn 3000
đột biến điểm trong gen K-RAS đã được báo cáo, trong đó đột biến hay gặp
nhất là đột biến thay thế nucleotit ở codon 12 (chiếm 82%) và codon 13
(chiếm 17%) ở exon 2 của gen K-RAS.


15

Hình 1.2. Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR
Nguồn: Theo Scartozzi M. và CS (2011) [122]
Đột biến tại codon 12 và 13 đóng một vai trị quan trọng trong q trình
tiến triển bệnh UTĐTT và nguy cơ kháng thuốc ức chế EGFR của khối u. Đột

biến tại những vị trí khác như codon 61 và 146 cũng đã được báo cáo nhưng
chiếm tỉ lệ nhỏ và ảnh hưởng của những dạng đột biến này trên lâm sàng chưa
được làm sáng tỏ. Gen K-RAS mã hóa cho một protein G đóng vai trị truyền
tín hiệu nội bào xi dịng từ EGFR. Protein G này thuộc họ protein RAS có
chức năng truyền tín hiệu từ các thụ thể bề mặt tế bào tới những đích nội bào
thơng qua các dịng thác tín hiệu (bao gồm con đường RAS-MAPK). Trong tế
bào, protein RAS được giữ cân bằng thông qua sự hình thành 2 phức hợp
tương ứng với các trạng thái của protein RAS: Phức hợp RAS-GTP (protein
RAS được hoạt hóa) và phức hợp RAS-GDP (protein RAS bị bất hoạt).
Protein RAS được hoạt hóa nhờ yếu tố chuyển nucleotide guanine (guanine
nucleotide exchange factors (GEFs). Việc truyền tín hiệu của protein RAS bị


16

ức chế khi phức hợp RAS-GTP bị thủy phân thành phức hợp RAS-GDP nhờ
một loại protein có chức năng hoạt hóa GTPase (GAPs) [122]. Ở điều kiện
sinh lý bình thường, nồng độ RAS-GTP trong cơ thể được kiểm soát chặt chẽ
nhờ sự hoạt động nhịp nhàng của 2 yếu tố GEFs và GAPs. Khi gen K-RAS bị
đột biến sẽ mã hóa cho những protein RAS mới có khả năng chống lại hoạt
tính GTPase của GAPs. Do đó, những protein RAS đột biến này luôn luôn tồn
tại ở trạng thái hoạt hóa RAS-GTP (Hình 1.3). Khơng giống như các protein
RAS kiểu hoang dại luôn bị bất hoạt sau một khoảng thời gian rất ngắn, các
protein RAS đột biến có khả năng kích hoạt vĩnh viễn các con đường truyền
tín hiệu nằm xi dịng nó bất kể có sự hoạt hóa của thụ thể EGFR nào
hay khơng. Đây chính là cơ chế phân tử lý giải cho tình trạng kháng
thuốc điều trị đích ở những BN mang khối u bị đột biến gen K-RAS
[39], [63], [64], [114], [134], [136].

Gen K-RAS

Bình
thường

Đột biến

Đột biến gen K-RAS gây kích
hoạt vĩnh viễn RAS

Các tế bào tăng sinh
và phát triển bình thường

Rối loạn các quá trình tăng sinh,
phát triển và biệt hóa của tế bào


17

Hình 1.3. Đột biến gen K-RAS
hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu nội bào
Nguồn: theo Van Krieken J.H và CS, (2008) [136]
1.3. Yếu tố nguy cơ và quá trình phát sinh ung thư đại trực tràng
1.3.1. Các yếu tố nguy cơ
1.3.1.1. Tuổi và giới
Kết quả thu được từ nhiều nghiên cứu cho thấy tỉ lệ mắc UTĐTT tăng
theo tuổi, tỉ lệ gặp thấp ở tuổi dưới 40, trừ trường hợp có bệnh do gen hoặc
viêm mạn tính vùng chậu trước đó [65], [66].
UTĐTT là bệnh chung cho cả hai giới nhưng nam thường bị nhiều hơn
nữ, tỉ lệ nam/nữ thay đổi từ 1,1 - 2,1 lần. Phụ nữ ở các vùng khác nhau có tỉ lệ
mắc tương tự như nhau, vào khoảng 60 - 80% so với nam giới

[36], [59], [109].
1.3.1.2. Địa dư
Sự phân bố của UTĐTT rất khác nhau giữa các châu lục và các quốc gia
trên thế giới [105]. Ở Việt Nam, tỉ lệ mắc UTĐTT tăng lên hàng năm. Năm
1991 tại Hà Nội, tỉ lệ mắc UTĐTT là 4,3/100.000 dân nhưng đến năm 1999
đã tăng lên 13,3/100.000 dân [6], [11], [109].
1.3.1.3. Polype
Khoảng từ 70 - 90% các trường hợp UTĐTT hình thành từ polype u
tuyến (adenomatous polype). Quá trình từ một polype u tuyến tiến triển thành
một UT phải có biến đổi về gen và thời gian phải mất 5 - 10 năm. Bệnh nhân
có polype u tuyến thì 50% phát triển thành UT sau 15 năm [92], [104].
1.3.1.4. Yếu tố di truyền


18

Yếu tố di truyền trong UTĐTT bao gồm các hội chứng di truyền như
bệnh đa polype tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis - FAP) và
UTĐTT di truyền không polype [33],
- UTĐTT di truyền không polype (Hội chứng Lynch), được mô tả
năm 1895 bởi Aldred Warthin. Năm 1962, Henry Lynch bổ sung các
đặc điểm của hội chứng là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể.
Nguyên nhân của hội chứng là do đột biến các gen hMLH1 (50%),
hMSH2 (40%) và hMSH6 (10%). UTĐTT di truyền không polype bao
gồm 2 hội chứng [123], [132], [135].
+ Hội chứng Lynch I: Hội chứng UTĐTT gia đình (Familial colorectal
cancer syndrome) là UTĐTT khơng kèm theo UT nào khác.
+ Hội chứng Lynch II: Hội chứng UTBMT di truyền (Hereditary
adenocarcinomatosis syndrome) với đặc điểm bệnh xuất hiện sớm từ 20 - 30
tuổi, tổn thương ở đoạn đầu của ĐT kèm theo các UT biểu mơ khác ngồi ĐT

như UT buồng trứng, UT nội mạc tử cung [53].
- Bệnh đa polype tuyến gia đình (FAP): là bệnh di truyền theo tính trội, tỉ
lệ gặp từ 1 - 2% các UTĐTT. Nguyên nhân do đột biến gen APC
(Adenomatous polyposis coli), trong đó có 80% do đột biến gen APC, 15% có
giảm biểu hiện gen APC và 5% có biểu hiện gen APC bình thường. Người
bệnh đa polyp tuyến gia đình thường phát triển từ hàng trăm tới hàng ngàn
polyp trước tuổi 30, trong đó 90% xuất hiện ở tuổi 20, 10% ở lứa tuổi lên 10
và chắc chắn (100%) phát triển thành UTĐTT ở tuổi 40 [36], [132].
1.3.1.5. Bệnh viêm ruột
- Bệnh viêm loét ĐTT chảy máu:
Viêm loét ĐTT chảy máu là một yếu tố làm tăng nguy cơ UTĐTT.
Nguy cơ UT ở người viêm loét ĐTT chảy máu tương đối thấp trong 10 năm
đầu nhưng sau đó lại tăng lên 0,5 - 1% mỗi năm và nằm trong khoảng từ 8 30% sau 25 năm. Những người trẻ bị viêm lt chảy máu tồn bộ ĐTT có


19

nguy cơ mắc UT là 12% năm 15 tuổi, 23% năm 20 tuổi và 42% năm 24 tuổi.
Để phòng ngừa phải theo dõi và phát hiện sớm những tổn thương sinh UT,
đặc biệt là loạn sản độ cao là biểu hiện sớm của quá trình hình thành UT [78].
- Bệnh Crohn's:
Bệnh viêm hạt mạn tính của ống tiêu hóa chủ yếu là ở đoạn cuối của
hồi tràng, 20% phối hợp với tổn thương ở đại tràng (ĐT), tổn thương ĐT đơn
độc là 20%. Bệnh thường gặp ở nam giới từ 20 - 40 tuổi. Bệnh Crohn 's làm
tăng nguy cơ phát sinh UTĐTT [24].
1.3.1.6. Những yếu tố nguy cơ khác
Chế độ ăn nhiều mỡ động vật làm tăng các vi khuẩn kị khí ở ruột, làm
chuyển đổi axít mật bình thường thành các chất gây UT. Các amin dị vòng
được sinh ra trong q trình nướng các loại thịt có màu đỏ ở nhiệt độ cao là
các chất có khả năng gây UT [31]. Ăn nhiều rau và hoa quả, hoạt động thể lực

làm giảm nguy cơ UTĐTT [24].
Thừa cân béo phì làm tăng nguy cơ phát triển UTĐTT từ 15 - 33%.
Nguy cơ polype u tuyến cũng tăng ở những người có chỉ số khối cơ thể cao
(BMI 45 - 46%) [36], [109].
Khói thuốc lá làm khởi động quá trình sinh UTĐTT do tham gia vào các
phức hợp hoạt hóa pha I và pha II của q trình hoạt hóa và giải độc tế bào,
do tác động tới một số gen liên quan đến quá trình sinh UTĐTT như:
Glutationine-S-transferase (GSTM1 và GSTT1), Cytochrome P450A1
(CYP1A1) và N-acetyl transferase (NAT1 và NAT2) [36], [41], [105].
Đái tháo đường type II làm tăng nguy cơ ở mức trung bình đối với u
tuyến và UTĐTT. Mức selenium thấp làm tăng nguy cơ UTĐTT. Folate là
methion cần thiết cho q trình methyl hóa. Có mối liên quan giữa mức tăng
cholesterol và UTĐTT với RR = 1,65 khi làm lượng cholesterol > 276 mg/dl
[59], [109], [126].
1.3.2. Cơ chế hình thành và phát triển của ung thư đại trực tràng


20

1.3.2.1. Quá trình phát sinh ung thư đại trực tràng qua nhiều bước
UTĐTT hình thành và phát triển do tích lũy các biến đổi gen trong tế bào
biểu mô của niêm mạc của ĐTT. Các biến đổi gen kết hợp với những tác nhân
gây UT sẽ gây đột biến hoặc khiếm khuyết gen, tạo nên UT và làm mất chức
năng của gen ức chế UT. Sự tích lũy dần các biến dị di truyền thường cần
phải qua nhiều năm (từ 10 - 20 năm), và điều này phù hợp với các nghiên cứu
dịch tễ học di truyền về diễn biến của phát sinh UTĐTT trải qua nhiều bước
[76], [81], [124] .
UTĐTT phát sinh từ một tế bào đơn lẻ phát triển bằng cách tạo dịng tế
bào. Các biển đổi đó được coi là do đột biến hoặc được di truyền, tích lũy dần
trong dịng tế bào này. Có những biến đổi bị loại trừ, có biến đổi chiếm ưu

thế. Những tế bào có ưu thế phát triển dần dần tạo ra một dòng tế bào tiếp tục
phát triển và những đột biến kế tiếp được tích lũy lại trong tế bào gây ra
polype (biểu hiện sớm nhất có thể quan sát được trong u ĐTT), dần dần
những biến đổi di truyền đủ gây ra phát sinh UT và UT sẽ phát triển. Thực tế,
các BN có polype thì sau một thời gian dài (nếu có) thì mới tiến triển
thành UT. Những phân tích MBH khối u thường phát hiện thấy các tế
bào u tuyến nằm cạnh ngay khối u. Khối u phát sinh như là từ một tế
bào nguồn gốc từ polype [111].
Về mặt MBH, có hai loại polype chính là polype tăng sản (polype không
loạn sản) và polype u tuyến (polype loạn sản). Polype khơng loạn sản có cấu
trúc biểu mơ vẫn giữ trật tự bình thường, những khối này là lành tính và phát
triển chậm [132]. Polype u tuyến thể hiện loạn sản rõ, các tuyến càng loạn sản
mạnh khi u phát triển to hơn và xâm lấn ra các mơ lân cận (tính chất ác tính).
Khối u có thể phát triển khơng liên tục. Một polype nhỏ có thể khơng
tiến triển trong nhiều năm, thậm chí vài chục năm, nhưng khi có một đột biến
tiếp theo xuất hiện trên một tế bào nào đó, một làn sịng phát triển mới có thể