Giáo trình công nghệ sinh học thực phẩm II - Chương 5 ppt

Glucose
Axit fotfoenol pyruvic

Eritrozo-4- P

Axit skimic
Axit corismic

Axit antranilic
Triptophan

Axit prephenic
Axit phenylpyruvic

Axit hydroxyphenylpyruvic

Phenylalanine
Tirozin
Sơ ñ 5: Cơ ch t ng h p triptophan, phenilalanin, tirozin trong
t bào vi sinh v t
ð t ng h p th a triptophan ngư i ta dùng ch ng e. coli tr dư ng tirozin
và phenylalanine.

CHƯƠNG V: S N XU T CH PH M ENZYM
5.1 Nh ng tính ch t ưu vi t c a enzyme
Enzym là m t ch t xúc tác sinh h c. Nó có đ y đ các tính ch t c a ch t
xúc tác hố h c, ngồi ra cịn có nh ng ưu vi t sau:
1. Có tính chun hố cao (tính ñ c hi u): m i enzyme ch tác d ng lên
m t cơ ch t nh t ñ nh nào đó theo ý mu n mà khơng gây nên m t bi n đ i nào
khác. Ví d : amylaza ch thu phân tinh b t, proteaza ch thu phân protein.v.v.
2. Cư ng l c xúc tác l n: v i m t lư ng nh enzyme có th làm xúc tác

đ chuy n hố m t lư ng cơ ch t l n. Ví d : 1g pepxin có kh năng thu phân
50kg tr ng, 1g rennin có th làm đơng t 72 t n s a, 1mol catalaza có th làm
chuy n hố 5x106mol H2O2 trong 1 giây.
3. Tác d ng trong m t ñi u ki n êm d u: ph n l n các enzyme ho t đ ng
nhi t đ khơng cao, pH thư ng là trung tính và áp su t thư ng.
4. Enzym khơng đ c h i: t t c các lo i enzyme đ u có ngu n g c t sinh
v t nên khơng đ c h i đ i v i s c kh e con ngư i.
Chính vì nh ng ưu vi t đó mà trong nh ng năm g n ñây ch ph m
enzyme ñư c s d ng r ng rãi và ngành công nghi p enzyme cũng đư c phát
tri n khơng ng ng.
5.2 Ngu n nguyên li u ñ thu nh n enzyme:
Enzyme có th thu nh n t nhi u ngu n nguyên li u khác nhau như: ñ ng
v t, th c v t và vi sinh v t.


5.2.1 ð ng v t:
Enzyme n m trong các cơ quan n i t ng c a ñ ng v t:
- Tu t ng: ch a nhi u enzyme amylaza, maltaza, proteaza, esteraza,
lipaza.v.v.
- D dày ch a nhi u enzyme pepxin, các enzyme tiêu hoá (trong ngăn th
tư c a d dày bị có 1 lo i vi khu n có kh năng sinh t ng h p xenlulaza), trong
d dày c a bê và nghé có ch a enzyme rennin làm đơng t s a.
- Ru t: ch a ch y u là enzyme enterokinaza có kh năng phá v các liên
k t peptit.
- Gan: là cơ quan ch a r t nhi u enzyme.
Không th thu enzyme t ñ ng v t trên qui mô công nghi p đư c vì th i
gian ni đ ng v t quá dài nên không kinh t .
5.2.2 Th c v t:
Ngư i ta có th thu đư c m t s enzyme trong th c v t thư ng ñ ng như
thu papain t ñu ñ , bromelain t d a, amylaza t malt, plazmin (c papain) t

h ficus (sung, v ).
Trong các h đ u có enzyme ureaza. Trong thu c lá có ch a enzyme
amylaza, esteraza, pectinaza, proteaza. Trong chè có ch a nhi u enzyme oxy
hố kh như polyphenoloxydaza. Trong rau qu cũng ch a nhi u lo i enzyme
khác nhau.
Thu enzyme t th c v t cũng khơng kinh t vì mu n có nhi u th c v t
thì ph i tr ng nên ph i có đ t và chi phí t n kém trong vi c chăm bón.
5.2.3 Vi sinh v t:
So v i ñ ng v t và th c v t thì vi c thu nh n enzyme t vi sinh v t có
nhi u l i th hơn.
- T vi sinh v t có th thu nh n đư c nhi u enzyme khác nhau, trong đó
có nh ng lo i khơng th thu nh n đư c t đ ng v t ho c th c v t.
- B ng cách thay đ i đi u ki n ni c y ho c dùng tác nhân ñi u ch nh
ngư i ta có th đi u khi n q trình sinh t ng h p enzyme c a vi sinh v t theo
ý mu n.
- Vi sinh v t có kh năng sinh s n và phát tri n nhanh, t ng h p enzyme
v i t c ñ c c kỳ l n trong m t th i gian ng n. Chính vì th vi c s n xu t
enzyme t vi sinh v t ít t n th i gian.
- Enzyme thu nh n t vi sinh v t có ho t tính r t m nh, vư t xa các
enzyme t các ngu n sinh v t khác.
- Vi sinh v t có kh năng sinh s n, phát tri n và t ng h p enzyme trên
các mơi trư ng dinh dư ng đơn gi n, d ki m và r ti n (có th là ph li u c a
các ngành s n xu t khác nhau). Cho nên vi c s n xu t enzyme t vi sinh v t
cũng r t kinh t .


Chính vì các l i th trên nên ngu n enzyme t vi sinh v t có th đưa vào
ngành s n xu t ch ph m enzyme công nghi p.
B ng 1: Kh năng s d ng các lo i enzyme t vi sinh v t
Lo i enzyme

Vi sinh v t
S d ng
Amylaza
Bacillus Subtilis, Bacillus
Bia và rư u (phân hu tinh b t
Stearotherophilus.
thành ñư ng lên men, s n xu t
nha)
Asp.niger
S n xu t bánh mì, bánh ng t
α-amylaza
Asp.oryzac
(thu phân m t ph n tinh b t)
Glucoamylaza Asp.niger
S n xu t glucoza, bia (làm
Asp.oryzac
gi m hàm lư ng dextrin)
Endomycopsis bispora
Pectnaza
Asp.niger
S n xu t và làm trong d ch qu ,
Asp.oryzac
các ch ph m rau cho dinh
Sclerotinia libertina
dư ng tr sơ sinh.
Các xenluloza Trichoderma viride
CN th c ph m (làm tan thành
t bào th c v t
rau), rư u
(thu nh n ñư ng t xenluloza).

ðextranaza
Penicillium funiculorum
S n xu t dexran v i kích thư c
phân t nh t đ nh. Ch t b
sung cho thu c đánh răng.
Invectaza
Sacch.Cerevisiac
D ch hố ñư ng ñ làm keo,
s n xu t m t ong nhân t o.
Các proteaza
Bacil.Subtilis, Bacil.Cereus B sung vào b t gi t ñ lo i
Bacil.Stearotheroopilus,
protein, làm m m th t, ch t tr
Streptomyces griseus,
tiêu hố, dùng trong cơng ngh
Asp.oryzac
làm phim
Enzym làm đơng Mucor pusillus
S n xu t fomat
s a
Keratinaza
Streptomyces fradiac
Ngành da (kh lông)
B o qu n th c ph m (lo i O2)
β-galactozidaza Asp.niger, Pen.notatum
Xác ñ nh glucoza (ch n đốn
b nh đái đư ng).
Streptokinaza
Streptococcus,
ði u tr (tiêu c c ngh n)

Spec.chotridium
ði u tr các v t thương, v t
histolyticum
b ng
L-asparaginaza Eschericha coli, Erivinia
ði u tr b nh b ch c u
aroidac
Penixilinazylaza Escherichia coli
SX các penixilin bán t ng h p


5.3 S n xu t enzym t vi sinh v t:
Quá trình s n xu t g m 3 giai ño n:
- Tuy n ch n vi sinh v t và c i t o gi ng
- Nuôi c y vi sinh v t
- Tách và tinh ch enzym
5.3.1 Tuy n ch n vi sinh v t và c i t o gi ng:
1. Tuy n ch n:
Kh năng t o enzym c a vi sinh v t r t ña d ng và phong phú. M i lo i
enzym có th thu nh n đư c t nhi u ch ng vi sinh v t khác nhau và ngư c l i
m t ch ng vi sinh v t cũng có kh năng sinh nhi u lo i enzym.
Ví d :

Aspergillus oryzae
Amylaza có th thu nh n nh
Bacillus Subtilis
Bac.Stearothermophilus
α-Amylaza
Asp.niger
Asp.oryzae

Asp.awamori
Glucoamylaza
Asp.oryzae, niger
Endomycopsis, awamori
Asp.niger
Pectinaza
Asp. oryzae
Asp.awamori
Asp.oryzae
Proteaza
Bac.Subtilis
Streptomyces griseus
Proteinaza
Asp.awamori, flavus, Candidus
Bac.mesentericus, Bac.Subtilis
Xenlulaza
Trichoderma viride
Asp.terreus
Kh năng sinh enzym c a các ch ng vi sinh v t không gi ng nhau và
khác nhau ngay c trong cùng m t ch ng. Vì v y, khi tuy n ch n vi sinh v t
ph i ti n hành tìm ki m, phân l p, l a ch n hàng ch c, hàng trăm th m chí đ n
hàng nghìn gi ng vi sinh v t khác nhau m i có đư c nh ng ch ng vi sinh v t
có ho t l c cao trong vi c t o nh ng enzym c n thi t.
2. C i t o gi ng:
ð nâng cao s c s n xu t enzym c a vi sinh v t cũng như làm tăng cư ng
ho t tính c a enzym ngư i ta ph i s d ng các phương pháp khác nhau ñ c i
t o gi ng, ñ c bi t là phương pháp gây ñ t bi n. B ng phương pháp ñ t bi n
nhi u nư c ñã thu ñư c nh ng ch ng vi sinh v t có nh ng đ c tính t t, ch t ng

h p m t ho c vài ba enzym nhưng đ u có ho t tính cao so v i ch ng ngun
thu ban đ u.
5.3.2 Ni vi sinh v t:
5.3.2.1 Các y u t nh hư ng t i s t ng h p enzym:
1. nh hư ng c a thành ph n môi trư ng dinh dư ng:
Là y u t quan tr ng có nh hư ng l n ñ n s phát tri n và t ng h p
enzym c a vi sinh v t. Cùng m t lo i vi sinh v t nhưng n u ni c y trên các
mơi trư ng có thành ph n dinh dư ng khác nhau thì m c ñ t o thành enzym
và thành ph n enzym ñư c t o thành cũng khác nhau.
Ví d : ni Asp.oryzae b ng phương pháp b m t trên môi trư ng cám đ i
m ch thì có th t o đư c nhi u enzym, trong đó có các lo i enzym có ho t tính
cao như amylaza, proteaza, maltaza, pectinaza, invectaza, ribonucleaza. Nhưng
n u nuôi trên môi trư ng Kzapek c i ti n v i nitrat và tinh b t thì ch t o thành
ch y u là α-amylaza, còn các enzym khác t o thành v i lư ng khơng đáng k .
Hi n tư ng này đư c gi i thích b ng lý thuy t sinh t ng h p c m ng
enzym. Hi n tư ng c m ng này ch th y vi sinh v t ch khơng th y đ ng
và th c v t. Khi trong mơi trư ng có nh ng ch t khó đ ng hố vi sinh v t ph i
ti t vào môi trư ng m t ho c nh ng enzym tương ng ñ phân hu nó thành
nh ng ch t có th đ ng hố đư c. Cho nên khi thêm các ch t c m ng vào mơi
trư ng dinh dư ng thì kh năng sinh t ng h p enzym c a vi sinh v t có th
tăng lên g p nhi u l n so v i trư ng h p bình thư ng.
ð nh nghĩa: M t quá trình sinh t ng h p ñư c g i là c m ng n u như
nó ch x y ra m c đ đáng k khi trong mơi trư ng có cơ ch t ñ c hi u c a
enzym này ho c các ch t trao đ i có c u trúc tương t cơ ch t. Các enzym
thu c lo i này g i là enzym c m ng, các cơ ch t kích thích q trình t ng h p
này g i là ch t c m ng.
Mu n t ng h p ñư c enzym c m ng c n có 4 đi u ki n:
- Th nh t: Có gen tương ng trong nhi m s c th
- Th hai: Có ngun li u đ y ñ ñ xây d ng các phân t enzyme ñó
(các axit amin, các h p ph n coenzyme).

-Th ba: Có năng lư ng c n thi t cho vi c t ng h p enzyme.
- Th tư: Có ch t c m ng.
N u có đ 3 đi u ki n trên nhưng thi u ch t c m ng thì enzyme cũng
khơng đư c t o thành.
Trong cơng ngh s n xu t enzyme c n ph i l a ch n ch t c m ng thích
h p và xác ñ nh n ng ñ t i ưu c a nó trong mơi trư ng đ có hi u su t sinh
t ng h p cao nh t.
2. nh hư ng c a đ m:
Trong phương pháp ni c y b m t, đ m c a mơi trư ng có v trí đ c
bi t quan tr ng. Khi ñ m th p vi sinh v t b rơi vào tình tr ng b t l i cho ho t


ñ ng s ng nên có khuynh hư ng t o bào t và h n ch s t ng h p enzyme.
Khi đ m q cao thì đ tơi x p và thống khí c a canh trư ng b gi m, do đó
s t ng h p enzyme khó khăn.
ð m cho phép vi sinh v t t ng h p enzyme t t thư ng t 53÷65%, ph
thu c vào đ c đi m sinh lí c a vi sinh v t, vào c u trúc cơ h c c a mơi trư ng
và đi u ki n thốt m c a mơi trư ng ni c y.
3. pH c a môi trư ng:
So v i phương pháp ni chìm thì phương pháp b m t ít ch u nh hư ng
c a pH môi trư ng ñ n quá trình sinh t ng h p enzyme vì trong q trình ni
pH c a mơi trư ng khá n đ nh. V i phương pháp ni c y chìm pH mơi
trư ng bi n đ i khá rõ r t trong q trình ni và gây nh hư ng l n t i s
t ng h p enzyme. Do đó, ngư i ta thư ng đi u ch nh pH ñ thu ñư c enzyme
v i hi u su t cao.
M i lo i enzyme thư ng ñư c t ng h p m nh trong m t vùng pH xác
ñ nh ñ i v i t ng lo i vi sinh v t. Ví d : amylaza và pectinaza c a n m m c
ñư c t ng h p m nh trong môi trư ng có pH=4,5÷5, cịn proteaza trong mơi
trư ng có pH=6÷6,5.
4. Nhi t ñ :

Ph n l n các vi sinh v t có kh năng t ng h p m nh các enzyme ñ u
thu c lo i ưa nhi t trung bình, có nhi t đ t i thích 22÷320C. V i vi khu n có
lo i thích nhi t đ cao hơn (35÷550C) và chúng có kh năng t ng h p các
enzyme có đ b n nhi t cao. Khi nâng nhi t đ mơi trư ng t i q m c thích
h p thì kh năng sinh t ng h p enzyme b gi m rõ r t.
5. Oxy:
ð vi sinh v t sinh trư ng và phát tri n đư c thì ph i có oxy. Do đó,
trong th i kỳ tích lu sinh kh i ph i cung c p ñ y ñ oxy cho môi trư ng.
6. Th i gian nuôi:
Th i gian nuôi c y thích h p c a m i lo i vi sinh v t ñư c xác ñ nh b ng
th i gian cho phép tích t enzyme t i đa. Th i gian đó ph thu c vào ch ng vi
sinh v t và ít ph thu c vào enzyme chúng t ng h p.
5.3.2.2 L a ch n môi trư ng nuôi c y:
Thành ph n môi trư ng dinh dư ng là m t trong nh ng y u t có nh
hư ng quy t đ nh ñ n ho t ñ ng s ng c a vi sinh v t cũng như kh năng sinh
t ng h p enzyme c a chúng.
ð b o ñ m nh ng yêu c u t i thi u cho vi sinh v t phát tri n và t ng h p
enzyme thì trong mơi trư ng c n có các ch t ch a cacbon, nitơ, hydro, oxy và
các ch t khoáng như Mg, Ca, P,S , Fe, K .v.v.
- Ngu n cung c p cacbon thư ng dùng là gluxit. Khi s d ng ñư ng c n
nh r ng m t s đư ng có tác d ng kìm hãm s sinh t ng h p m t s enzyme


thu phân. Ví d : đư ng glucose có th kìm hãm sinh t ng h p m t s enzyme
h amylaza.
Ngồi gluxit cũng có th s d ng ngu n cacbon khác như m , d u, axit
h u cơ, rư u. Trong s các axit h ư cơ thì axit lactic đư c vi sinh v t h p th
d dàng hơn c . Axit này có nhi u trong nư c chi t ngô. Cho nên cao ngơ đư c
dùng v a là ngu n b sung ñ m v a là ngu n cung c p cacbon cho vi sinh v t
phát tri n.

- Ngu n cung c p nitơ có th là các h p ch t h u cơ ho c vô cơ. Các h p
ch t h u cơ là nh ng h p ch t giàu đ m như cao ngơ, b t đ u tương, khơ đ u,
khơ l c… Ngu n nitơ vô cơ như urê, NH3, các mu i amơn.
Ngồi ra, m t s axit amin, bazơ purin (adenine, guanine…), pyrimidin
cũng đư c b sung vào mơi trư ng ni c y.
Các axit amin có tác d ng khác nhau ñ i v i vi sinh v t cũng như vi c
sinh t ng h p enzyme. Nhi u axit amin có kh năng tăng cư ng sinh t ng h p
enzyme, m t s khác l i kìm hãm ho c khơng có nh hư ng rõ r t.
- Các ngun t khống cũng có nh hư ng rõ r t đ n q trình sinh t ng
h p enzyme. Các nguyên t này bao g m c nguyên t ña lư ng và vi lư ng.
Vi lư ng là s t, k m, ñ ng, coban. Các nguyên t này thư ng có trong nư c
ho c trong các thành ph n h u cơ khác c a mơi trư ng (b t, cao ngơ) do đó
khơng c n b sung ho c ch b sung d ng v t. N ng ñ c a các nguyên t
này tăng s kìm hãm m nh s phát tri n c a vi sinh v t.
Các nguyên t ña lư ng ñư c ñưa vào dư i d ng mu i vơ cơ nhưng c n
tính c hàm lư ng c a chúng đã có s n trong các thành ph n c a môi trư ng.
Trong các nguyên t này c n lưu ý ñ n P và S vì 2 nguyên t này là thành ph n
c u t o c a nhi u ch t quan tr ng, nh t là nucleotit, lipit, vitamin…
- Các y u t sinh trư ng: các vitamin ch y u dùng đ kích thích sinh
trư ng c a vi sinh v t. Tuy nhiên c n nh r ng, trong nhi u trư ng h p mơi
trư ng thích h p cho s sinh trư ng c a vi sinh v t chưa h n đã là thích h p đ
sinh t ng h p enzyme. Có khi mơi trư ng kìm hãm s tích lu sinh kh i t bào
nhưng v n tăng cư ng sing t ng h p enzyme.
ð xác đ nh thành ph n mơi trư ng dinh dư ng thích h p cho m i vi sinh
v t có th ti n hành l a ch n trên cơ s kinh nghi m ho c dùng các phương
pháp toán h c qui ho ch th c nghi m.
Khi l a ch n nguyên li u ñ chu n b môi trư ng c n chú ý r ng, trong
các nguyên li u t nhiên có ch a nhi u ch t khác nhau, k c các ngun t
khống đa lư ng cũng như vi lư ng và có c các y u t sinh trư ng. Do v y,
trong nhi u trư ng h p không c n b sung thêm các lo i mu i vô cơ. M t khác,

các nguyên li u này r ti n do v y nó thư ng dùng trong cơng nghi p đ s n
xu t ch ph m enzyme t vi sinh v t.


Các nguyên li u t nhiên thư ng dùng ñ chu n b môi trư ng là cám
g o, b t ngơ, b t đ u tương, khơ l c ho c các ph li u như men bia, r ñư ng…
Trong các nguyên li u này thì cám g o và b t ngô là ngu n cacbon t t nh t.
Cịn n m men bia t phân, khơ l c là ngu n nitơ t t nh t.
Khi chu n b mơi trư ng cịn c n ph i chú ý đ n các ch t có tác d ng đi u
hồ sinh t ng h p enzyme, ñ c bi t là các ch t c m ng. ð i v i m i lo i
enzyme có th có nhi u ch t c m ng cho nên ph i l a ch n ch t c m ng có
hi u qu nh t. Ví d như ch t c m ng c a sinh t ng h p amylaza là tinh b t,
dextrin; c a proteaza là các protein có tr ng lư ng phân t nh .
S d ng các ch t c m ng thư ng làm tăng ñáng k lư ng enzyme ñư c
t ng h p. Tuy nhiên, khi l a ch n ch t c m ng c n tính tốn c n th n v giá
thành c a nó.
5.3.2.3 Các phương pháp ni c y vi sinh v t:
Có nhi u phương pháp khác nhau đ ni vi sinh v t t ng h p enzyme.
1. Phương pháp b m t:
Phương pháp này thích h p đ ni các lo i n m m c vì kh năng phát
tri n c a nó nhanh, m nh nên ít t p nhi m.
• Qui trinh cơng ngh :
Mơi trư ng ph i tr n làm m h p ñánh tơi và làm ngu i gieo
m c gi ng vào thi t b ni vào phịng ni ni m c canh trư ng.
Các ch t dinh dư ng thư ng là các nguyên li u t nhiên như các ch t th i
c a công ngh th c ph m ho c h n h p c a nhi u ch t. Trong môi trư ng c n
thêm ch t c m ng c n thi t cho s t ng h p enzym ho c b sung thêm ch t
dinh dư ng ngu n nitơ, photpho như nư c chi t ngô, khoai tây, d ch t phân
n m men…ð b o đ m đ x p c a mơi trư ng c n có ch t làm x p như tr u
(10÷20%). Trư c khi gieo c y c n thanh trùng mơi trư ng đ đ m b o khơng b

nhi m vi sinh v t l .
Q trình ni c y kéo dài t 33÷48h. Có các hi n tư ng:
- Th i nhi t, c n gi to=28÷32oC
- Gi m m, gi ϕphịng=96÷100%
- Cung c p O2: trong quá trình m c phát tri n l y O2 và th i CO2
c n cung c p không khí vơ trùng.
• Ưu như c đi m c a phương pháp:
Ưu:
- Cho n ng ñ enzym cao hơn so v i phương pháp b m t
- Có th s y khơ nhanh chóng mơi trư ng (d ng thơ) mà khơng
nh hư ng đ n ho t l c enzym.
- Tránh s nhi m trùng toàn b kh i canh trư ng
- T n ít đi n năng.


Như c:
- Khó cơ gi i hố, t đ ng hoá.
- Năng su t th p.
- T n nhi u lao ñ ng.
- T n nhi u m t b ng.
2. Phương pháp ni c y chìm:
• V i phương pháp này vi sinh v t phát tri n trong mơi trư ng l ng có
s c khí và khu y ñ o liên t c. Ngu n cacbon s d ng trong phương pháp này là
tinh b t, các ch t th i có đư ng như r đư ng và các nguyên li u khác. Ngu n
nitơ hay dùng là ch t h u cơ như cao ngô, d ch men bia, d ch thu phân, khơ
l c…Ngồi ra trong thành ph n môi trư ng cũng c n b sung thêm các ch t
khống. Mơi trư ng c n ñư c thanh trùng b ng cách s c hơi tr c ti p
to=121÷125oC trong th i gian 60÷90 phút đ i v i mơi trư ng ch a ngun li u
b t, đ m thơ và 20÷30 phút v i các lo i mơi trư ng có ch a đư ng.
Trong q trình ni c y chìm c n ph i s c khí vơ trùng và khu y đ o

liên t c. N u có b t ph i dùng d u phá b t. Th i gian t 1÷4 ngày tuỳ ch ng.
Ph i chú ý đi u ch nh pH.
• Ưu, như c:
+ Ưu:
- Ti t ki m di n tích
- D cơ gi i hố, t đ ng hố.
- S d ng h p lí ch t dinh dư ng, tránh lãng phí.
- Thu enzym ít t p ch t
- ð m b o v sinh, vơ trùng nên ít nhi m vi sinh v t l .
+ Như c:
- N ng ñ enzym th p, c n làm ñ c canh trư ng trư c khi tách
nên giá thàcao.
- T n ñi n do s c khí.
- N u khơng đ m b o vô trùng s nhi m hàng lo t.
3. Phương pháp ni chìm 2 bư c:
- Bư c 1: vi sinh v t ni trong thi t b đ phát tri n t i ña.
- Bư c 2: chuy n sinh kh i sang thi t b khác ñ sinh t ng h p
enzym.
5.3.3 Tách và tinh ch enzym:
Trong th c t enzym ñư c s d ng nhi u d ng khác nhau. M t s lĩnh
v c có th s d ng dư i d ng canh trư ng khô mà ch t lư ng s n ph m khơng
thay đ i (như s n xu t rư u, công ngh thu c da). ða s các ngành công nghi p
(ch y u là th c ph m và cơng nghi p nh ) địi h i ph i s d ng các ch ph m
enzym s ch (g i là ch ph m k thu t). Còn trong y h c ph i s d ng các ch
ph m enzym tinh khi t. Tuy nhiên, cho ñ n nay chưa tìm ñư c m t phương


pháp chung đ tách m t enzym nào đó mà ph i ph i h p nhi u phương pháp
khác nhau.
Quá trình làm s ch enzym g m 2 giai ño n là chi t enzym và tách enzym.

5.3.3.1 Chi t enzym:
M c đích c a cơng đo n này là tách các enzym ra kh i canh trư ng sau
lên men. Quá trình này ph thu c vào lo i enzym (ngo i bào hay n i bào) và
môi trư ng lên men (l ng ho c r n) mà ti n hành khác nhau.
ð i v i enzym ngo i bào n m trong canh trư ng l ng thì ti n hành tách
sinh kh i đ thu dung d ch có ch a enzyme. N u enzym ngo i bào n m trong
canh trư ng r n (x p) thì dùng nư c vơ trùng ho c các dung d ch đ m thích
h p đ chi t enzym.
ð thu các enzym n i bào thì ph i ti n hành phá v t bào b ng m t trong
các phương pháp sau:
- Phương pháp ñ ng hố (nghi n trong máy đ ng hố)
- Nghi n v i b t thu tinh, cát…
- T phân
- Làm l nh đơng và tan giá l p đi l p l i nhi u l n
- Nh tác ñ ng c a siêu âm
- Dùng áp su t th m th u cao
- Phương pháp khuy ch tán
Sau khi phá v t bào thì dùng nư c c t ho c dung d ch mu i loãng ho c
các dung d ch đ m thích h p đ chi t enzym.
5.3.3.2 Tách enzym:
M c đích c a giai đo n này là làm s ch và tách các enzym ra kh i h n
h p ph thu c vào m c ñ tinh s ch c a các ch ph m enzym mà quá trình tách
cũng r t khác nhau.
1. Thu nh n ch ph m k thu t:
Ch ph m enzym k thu t là ch ph m enzym đư c tinh ch sơ b có th
ch a m t ho c vài enzym ch y u.
ð thu ch ph m enzym k thu t thì đ u tiên ph i cơ đ c dung d ch
enzym nhi t ñ 30oC cho ñ n khi ñ t n ng đ 20g/lit. Sau đó ti p t c cơ
nhi t đ 40oC cho đ t n ng đ 30÷50g/lit. Khi cơ có th cho thêm ch t b o
qu n ho c ch t n ñ nh. Ti p theo ñem s y phun v i nhi t ñ khơng vư t q

70oC.
Ngồi ra đ thu ch ph m enzym k thu t ngư i ta cũng có th k t t a
b ng dung môi h u cơ ho c mu i trung tính và sau đó cho ch t n đ nh vào s y
khơ r i nghi n.
Dung môi h u cơ thư ng dùng là rư u etylic, izopropylic, axeton…k t
t a b ng dung môi h u cơ d a trên nguyên t c khi thêm dung mơi vào dung
d ch enzym thì l c hút gi a các phân t protein-enzym tích đi n và các phân t


nư c bao quanh chúng b gi m. Khi n ng đ dung mơi thêm vào đ t đ n m c
làm cho năng lư ng hydrat hoá gi a các phân t nư c và protein nh hơn năng
lư ng liên h p gi a các phân t protein-enzym thì lúc đó các phân t proteinenzym liên h p l i t o k t t a.
Tuỳ theo tính ch t c a enzym và dung môi h u cơ mà m i m t lo i
enzym ñư c k t t a m t n ng ñ dung mơi khác nhau. Ví d proteaza k t t a
trong etanol 76÷78%, α-amylaza k t t a trong etanol 70%, glucoamylaza k t
t a trong etanol 45% và trong axeton 70%.
Dùng dung mơi h u cơ có ưu đi m là c t và thu h i ñư c. Nhưng dung
môi d làm cho enzym b vô ho t. ð kh c ph c như c đi m đó ph i ti n hành
k t t a enzym nhi t ñ th p (5oC) và th i gian ng n.
Các mu i trung tính thư ng dùng đ k t t a enzym là: (NH4)2SO4,
NaCl…tuỳ theo tính ch t t ng lo i enzym mà ngư i ta dùng n ng đ mu i
khác nhau. Ví d amylaza thư ng k t t a trong (NH4)2SO4 n ng ñ 0,75% đ
bão hồ; glucoamylaza n ng đ 0,8÷0,9% đ bão hồ.
Phương pháp dùng mu i trung tính k t t a cịn g i là diêm tích. Phương
pháp này d a trên nguyên t c các ion mu i có tác d ng phá v các l p hydrat
bao quanh phân t protein do s hút các phân t trái d u v phía nó. K t qu
làm phân t protein b m t nư c và đơng t .
Sau khi k t t a ph i lo i các mu i trung tính ra kh i enzym b ng phương
pháp th m tích. ð th c hi n ngư i ta cho enzym vào các màng bán th m
(xenlofan) r i cho vào các dung d ch đ m thích h p ngâm trong 24 gi và sau

đó th l i n u ñã lo i h t mu i thì đưa đi x lí ti p.
2. Thu nh n ch ph m tinh khi t:
ð thu nh n ch ph m tinh khi t ph i k t h p nhi u phương pháp và qua
nhi u giai ño n. ð u tiên ph i ti n hành lo i b các protein khơng ho t đ ng
b ng phương pháp bi n tính ch n l c. Các protein bi n tính có th tách ra b ng
cách l c ho c ly tâm. Sau đó enzym đư c k t t a b ng dung môi h u cơ ho c
mu i trung tính. Ti p theo dùng s c kí (s c kí trao đ i ion, h p ph , phân b ,
gel phân t v.v...) đ thu phân đo n enzym có ho t l c cao nh t.
Sau khi tinh ch xong ph i dùng phương pháp ñi n di ñ ki m tra m c ñ
ñ ng nh t c a enzym.
5.4 ðánh giá ch t lư ng c a enzym:
5.4.1 Phương pháp ñánh giá:
Ch t lư ng c a enzym ñư c ñánh giá b ng m c ñ ho t ñ ng c a nó t c
là ho t ñ c a enzyme. Th c t ngư i ta ño ho t đ c a enzym thơng qua vi c
xác ñ nh lư ng cơ ch t m t ñi hay lư ng s n ph m ñư c t o thành trong ph n
ng. V nguyên t c có th chia ra làm 3 nhóm phương pháp xác đ nh ho t ñ
enzym:


1. ðo lư ng cơ ch t b m t ñi hay lư ng s n ph m ñư c t o thành trong
m t th i gian nh t ñ nh v i m t n ng ñ enzym xác ñ nh.
2. ðo th i gian c n thi t ñ thu ñư c m t lư ng bi n thiên nh t ñ nh c a
cơ ch t hay s n ph m ng v i m t n ng ñ enzym nh t ñ nh.
3. ðo n ng ñ enzym c n thi t ñ làm bi n ñ i m t lư ng cơ ch t hay thu
nh n m t lư ng s n ph m nh t ñ nh trong m t th i gian nh t ñ nh.
5.4.2 ðơn v :
ð ño ho t ñ c a enzym ngư i ta dùng ñơn v ho t ñ .
- ðơn v enzym qu c t (kí hi u UI): là lư ng enzym có kh năng xúc tác
làm chuy n hóa m t micromol cơ ch t sau m t phút ñi u ki n tiêu chu n (
pHopt, toopt ñ i v i enzym c n xác ñ nh)

- ðơn v Katal (Kat): là lư ng enzym có kh năng xúc tác làm chuy n hoá
m t mol cơ ch t trong m t giây đi u ki n tiêu chu n
1UI=

1
-6
× 10 Kat=16,67 nKat (nanoKat)
60

- Ho t ñ riêng c a ch ph m enzym: là s ñơn v UI ho c s ñơn v Kat
ng v i 1ml ch ph m (n u là dung d ch) ho c 1mg ch ph m (n u là b t).
N u enzym ñã tinh s ch thì ho t đ đư c bi u th b ng s UI ho c s Kat
trên 1mg enzym.
- Ho t ñ phân t : s phân t cơ ch t đư c chuy n hố b i m t phân t
enzym trong m t ñơn v th i gian.
5.4.3 Nh ng chú ý khi ñánh giá ch t lư ng enzym:
ð đánh giá chính xác đ ho t đ ng c a enzym thì khi xác ñ nh ho t ñ
c a nó c n chú ý:
- N ng ñ cơ ch t trong ph n ng ph i trong m t gi i h n thích h p đ
th a đ bão hồ enzym nhưng khơng q cao đ n m c kìm hãm enzym.
- V i nh ng enzym c n có ch t ho t hoá ho c ch t làm b n thì ph i cho
ch t này vào enzym trư c khi cho cơ ch t vào ph n ng.
- Xác ñ nh ho t ñ c n ti n hành pHopt và c ñ nh. pH thư ng thay ñ i
ph thu c vào cơ ch t và thành ph n dung d ch ñ m.
- Nhi t ñ dùng xác ñ nh ho t ñ ph i nh hơn nhi t ñ t i ưu c a enzym
ñ ñ phịng s kìm hãm c a enzym nhi t đ cao.
- Th i gian xác ñ nh ho t ñ thư ng 5÷30 phút. Nhưng cũng có trư ng
h p kéo dài ñ n 24 gi n u ho t ñ c a enzym quá th p. Trong th i gian dài
ph i cho thêm nh ng ch t di t khu n ñ tránh hi n tư ng t p nhi m.
5.5 Enzym khơng tan:

Enzym khơng tan hay cịn g i là enzym c ñ nh là enzym n m trong m t
không gian b gi i h n. S gi i h n linh ho t c a enzym đ t đư c b ng cách
đưa nó vào m t pha cách li, tách r i kh i pha dung d ch t do và đó nó v n


có kh năng ti p xúc đư c v i phân t cơ ch t. Pha ch a enzym thư ng khơng
tan trong nư c nhưng cũng có th là polymer cao phân t ưa nư c.
5.5.1 Ưu như c ñi m c a enzym không tan:
1. Ưu ñi m:
- Gi m giá thành vì có th s d ng l p l i nhi u l n m t lư ng
enzym xác đ nh.
- Enzym khơng l n trong các s n ph m do đó tránh đư c nh
hư ng khơng t t c a nó đ i v i s n ph m.
- Có th làm ng ng nhanh chóng các ph n ng khi c n thi t.
- Enzym không tan b n hơn enzym tan do đó k t h p t n d ng
các y u t nhi t ñ , pH…
- Dùng enzym c đ nh có th d dàng thay th các quá trình lên
men b ng các ph n ng enzym ngồi t bào.
2. Như c đi m:
Enzym khơng tan có ho t ñ riêng nh hơn enzym tan
5.5.2 Phương pháp s n xu t enzym khơng tan:
G m có 3 phương pháp:
5.5.2.1 G n liên k t đ ng hố tr :
ða s các enzym khơng tan đư c s n xu t b ng phương pháp này. Nó
chia ra làm hai phương pháp là g n enzym vào ch t khơng hồ tan ho c g n các
phân t enzym v i nhau ñ t o thành ñ i phân t khơng hồ tan.
1. G n phân t enzym vào ch t mang khơng hồ tan:
• u c u v ch t mang:
- Có đ hồ tan th p và b n v ng v i các tác ñ ng cơ, nhi t và
hoá h c.

- Các ch t mang khơng gây tác đ ng kìm hãm enzym.
- Khơng h p ph phi ch n l c ñ i v i protein.
- Nên háo nư c vì ch t mang k nư c có th gây c ch v i
enzym đư c mang.
- Vi c g n s có hi u qu hơn n u ch t mang và enzym có đi n
tích trái d u.
• Nh ng ch t mang thư ng dùng:
+ Ch t mang h u cơ: như là polypeptit, polysaccarit, các d n xu t c a
xenlulo (DEAE-xenlulo: dietyl animoetyl xenlulo, CM-xenlulo: cacboxyl metyl
xenlulo), d n xu t c a dextran (DEAE-sephadex, CM-sephadex) ho c agaroza
(aga khác v i agaroza, trong thành ph n c a agaroza có g c sunfat).
Ch t mang thơng d ng hơn c là các detran có liên k t ngang g i là
sephadex và agaroza d ng h t g i là sepharoza. Nói chung c 2 lo i này đ u
có c u trúc l x p làm cho các phân t l n có th xâm nh p vào gel m t cách
d dàng.


Ngồi ra cịn có các polymer t ng h p khác như polyacrylamit,
polysterol, polyamit.
+ Ch t mang vô cơ: so v i ch t mang h u cơ thì ch t mang vô cơ b n hơn
v nhi t, cơ h c, hoá h c, vi sinh v t và nh t là khơng thay đ i c u hình c a
khn khi thay đ i tính ch t c a môi trư ng xung quanh. Các ch t mang vô cơ
như: silicagen, pentonit, nhôm hydroxyt …
2. G n các enzyme v i nhau
Ngư i ta có th g n nh ng enzyme l i v i nhau nh nh ng tác nhân ña
hay lư ng ch c ñ t o thành nh ng đ i phân t enzyme khơng hồ tan. V i
phương pháp này thu đư c nhi u d n xu t enzyme khơng tan, ví d thu d n
xu t tripxin không tan b ng cách dùng andehyt glutaric (OHC-(CH2)3-CHO)
1% ñ liên k t các phân t enzyme.
Phương pháp này có ưu đi m:

- Ít t n th t enzyme do gi i phóng ra mơi trư ng
- Tăng kh năng ch ng ch u c a enzyme ñ i v i các y u t bi n
tính nên đưa vào s n xu t đư c.
Như c ñi m c a phương pháp này là s enzyme c đ nh ít.
5.5.2.2 “Gói”enzyme trong khn gel
Ph i ti n hành trùng h p hoá các gel ñ ng th i v i s có m t c a enzyme.
Sau đó enzyme đư c gi l i trong gel và gel đã có enzyme có th làm nh b ng
cách nghi n trong máy đ ng hố ho c ép qua các l rây r i ñem s y khơ nhi t
đ khơng q 400C.
Có th “gói” enzyme b ng các phương pháp sau:
- Các gel ñư c hình thành trong s polymer hố t ng h p
- Các enzyme b nh t trong các l nh c a các s i t ng h p
- Gói trong bao vi th
- Phương pơháp ti n polymer
5.5.2.3 Phương pháp h p ph v t lí
Phương pháp h p ph v t lí khơng thơng qua liên k t hoá tr g n các
enzyme trên ch t mang. Quá trình th c hi n h p ph khá đơn gi n: ch t h p
ph và enzyme ñư c tr n l n v i nhau trong m t kho ng th i gian cho phép s
h p ph x y ra nh tương tác c a các liên k t ion, k nư c, hydrogen và l c
Van der Wals.
Phương pháp này có như c đi m là quá trình gi i h p ph enzyme d
dàng x y ra b i s thay ñ i pH, nhi t ñ và thành ph n ion.
5.5.3 M t s tính ch t c a enzyme khơng tan:
- Enzyme khơng tan có ho t đ riêng nh hơn enzyme tan
- Enzyme khơng tan cũng tn theo đ nh lu t Michaelis Menten (s nh
hư ng c a n ng ñ cơ ch t đ n ho t tính enzyme). Tuy nhiên do có hi n tư ng
c nh tranh gi a cơ ch t và ch t mang, do hi n tư ng khuy ch tán nên cũng có


nh ng sai khác ñáng k v t c ñ ph n ng c a enzyme: khi ch t mang và cơ

ch t tích đi n cùnh d u thì Khơngm khơng tan > Km tan, n u tích đi n trái d u
thì ngư c l i (Km - H ng s Michaielis)
- Enzyme khơng tan có tính b n nhi t cao hơn enzyme tan
- Enzyme không tan có s d ch chuy n pH t i ưu sang mi n ki m ho c
axit hơn so v i enzyme tan.
- Enzyme khơng tan có th i gian b o qu n lâu hơn và b n v i các ch t
kìm hãm cũng như các tác nhân gây bi n tính.

CHƯƠNG VI: S N XU T AXIT H U CƠ
Axit h u cơ ñư c s d ng r ng rãi trong ch bi n và b o qu n th c ph m
cũng như trong công ngh vi sinh v t. Chính vì th mà hi n nay axit h u cơ
ñư c nghiên c u và s xu t r ng rãi.
6.1 Các phương pháp s n xu t axít h u cơ:
ð s n xu t axít h u cơ ngư i ta có th dùng nhi u phương pháp khác
nhau như:
- Phương pháp t ng h p hoá h c
- Phương pháp chi t tách t nguyên li u th c v t
- Phương pháp sinh t ng h p nh vi sinh v t
Trong các phương pháp này thì phương pháp sinh t ng h p nh vi sinh
v t r t có ý nghĩa vì q trình s n xu t nhanh, s d ng nguyên li u s n có r
ti n và có th t o đư c nhi u lo i axít h u cơ khác nhau.
6.2 K thu t s n xu t m t s axít h u cơ nh vi sinh v t:
6.2.1 S n xu t axít axetic:
Axit axetic có th thu nh n b ng cách lên men ñư ng ho c oxy hố rư u
etylic. Sau đây xét q trình s n xu t axit axetic t rư u etylic.
1. Ch ng vi sinh v t:
ð oxy hoá rư u etylic thành axít axetic ngư i ta có th s d ng nhi u
lo i vi khu n khác nhau. Nhưng s d ng nhi u hơn c là các ch ng vi khu n:
Bacterium schuzenbachi, Bacterium curvum. Các lo i vi khu n này có kh năng
oxy hóa r t l n.

2. Phương trình lên men:
CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O + Q
3. K thu t lên men:
Có th s d ng phương pháp lên men liên t c ho c gián đo n. ð q
trình lên men ti n tri n đư c t t thì c n chú ý các ñi m sau:
- Nguyên li u và h n h p dinh dư ng: có th s d ng c n thơ ho c c n
tinh ch đ làm môi trư ng. Theo kinh nghi m cho th y s n xu t t c n thơ thì