Urease và Protase trong thế tiết

UREASE VÀ PROTEASE TRONG THỂ TIẾT CỦA
Helicobacter pylori, CHỦNG VNH - 85

Nguyễn Hoàng Uyên & Nguyễn Thị Hồng Hạnh
Viện Công Nghệ Sinh học

I. MỞ ĐẦU

Các dịch thể có nguồn gốc từ màng ngoài của Helicobacter
pylori mang một số protein là yếu tố bệnh lý như VacA [1],
CagA và HP1125 [2, 3]. Các protein đã được xác định là
những độc tính gây bệnh của vi khuẩn. Các nghiên cứu ở
điều kiện invitro cho thấy, các dịch thể có thể xâm nhập
vào bên trong tế bào ung thư dạ dày AGS, gây nên sự
cường tiết của interleukin IL-8 [4]. Có đến 80% số tế bào
AGS bị chết dưới ảnh hưởng của các độc chất chứa trong
dịch thể. Những tế bào sống sót đã tăng sinh gấp hai lần
[5].

Urease là một trong những yếu tố giúp cho vi khuẩn
Helicobacter pylori sống trong dạ dày của ngưòi, do phân
huỷ urea và nâng cao độ pH của dịch dạ dày [6,7]. Urease
tổng hợp trong tế bào vi khuẩn và có thể được đưa ra bên
ngòai theo cơ chế tự autolysis [6, 7].
Trong bài báo này, chúng tôi thông báo phát hiện urease và
protease trong các dịch thể của vi khuẩn Helicobacter
pylori, chủng VNH-85 phân lập từ một bệnh nhân Việt
Nam bị loét dạ dày. Đây là 2 protein, sau cagA, VacA và
HP1125 được tìm thấy trong các thể dịch của vi khuẩn.
Như vậy, sự có mặt của nhiều protein trong dịch thể của vi
khuẩn Helicobacter pylori mang các hoạt tính sinh học

khác nhau nhấn mạnh các vai trò chưa biết của chúng trong
quá trình phát triển bệnh ở người.

II. NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

1. Nguyên liệu

- Phân lập chủng vi khuẩn
Vi khuẩn Helicobacter pylori, chủng VHN - 85 được phân
lập và nuôi cấy như đã miêu tả [8]. Sau khi nuôi ở điều kiện
chuẩn trong ba ngày, vi khuẩn được thu thập cho các
nghiên cứu tiếp.

2. Phương pháp

- Tách chiết các dịch thể

Các dịch thể được thu nhận như đã miêu tả [9]. Chế phẩm
được bảo quản ở –20
0
C trong vòng một năm.

- Xác định hoạt tính urease

a) Các dịch thể được ủ trong 0,.2 ml dung dịch đệm
phosphate pH = 6 (Urea 2%; NaH
2
PO
4
0.428% và

Na
2
HPO
4
1% ) trong 30 phút ở 370 C. 10 l của phản ứng
được lấy ra ở các thời điểm khác nhau để xác định hàm
lượngNH
3


b) bằng phương pháp Berthellot.

NH
3
được xác định theo phương pháp của Berthellot như
sau:
Chuẩn bị ba dung dịch có thành phần:
1) 2% Na - phenolate

2)50 gram Na Nitroprusside trong 1 lit nước cất

3)15% NaOCl

Các dung dịch được chuẩn bị và bảo quản lạnh.

Phản ứng định lượng màu được tiến hành như sau: Cho 0.1
- 1 l mẫu vào ống nghiêm sạch và 2 ml nước cất. Cho
thêm vào ống nghiệm 3 dung dịch đã chuẩn bị như trên
theo thứ tự 1ml dung dịch 1; 0. 5 ml dung dịch hai và ba.
Lắc ống nghiệm sau mỗi lần cho chất vào. Các ống nghiệm

được ủ ở nhiệt độ phòng khỏang 30 phút, sau đó tiến hành
đo OD ở bước sóng 630nm. Đường chuẩn được xây dưng
cho các hàm lượng NH3 là 0-5 g. Phương pháp cho phép
xác định lượng NH
3
nhỏ nhất là 0.5 g.

- Xác định hoạt tính protease của các dịch thể

Sự có mặt của các protease trong dịch thể được xác định
bằng phương pháp SDS-PAGE zymogram protease. Tủa
dịch thể trong cồn tuyệt đối (1:1) ở –20
0
C. Ly tâm tủa ở
4
o
C trong 15 phút, sau đó hoà tủa trong nước cất để chạy
điện di SDS-PAGE 70V trong 2 giờ. Sau SDS-PAGE, ủ gel
trong dung dịch 3% casein đệm Tris-HCl 50 mM, pH 8 ở
40
0
C trong vòng 30 phút, sau đó rửa sạch gel trong nước
cất và nhuộm bằng dung dịch 40% ethanol, 10% acid
acetic, 0.1 % Coomasie Blue trong 4 giờ. Sau khi tẩy trong
dung dịch 40% ethanol., 10% acid acetic, băng protein có
hoạt tính protease hiện lên màu trắng. Protein albumin
chuẩn được sử dụng làm đối chứng.

III - KẾT QUẢ

1. Phát hiện sự thay đổi pH của dịch đệm

Các dịch thể sau khi được tách chiết từ dịch nổi nuôi cấy
của vi khuẩn Helicobacter pylori bằng phương pháp siêu ly
tâm được ủ trong dung dịch đệm có pH = 6,9. Sau một vài