XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC THUỐC KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ VI SINH VẬT pdf

XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC THUỐC KHÁNG SINH
BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ VI SINH VẬT


Hoạt lực kháng sinh được thể hiện bằng khả năng ức chế một loại chủng chỉ thị nào đó,
ở điều kiện thích hợp. Sự giảm hoạt tính sinh học của kháng sinh được thể hiện trên
chủng chỉ thị, rất khó phát hiện bằng phương pháp phân tích hoá học, vì vậy phương
pháp vi sinh vật thường giữ một vai trò quan trọng trong việc đánh giá khả năng mất
hoạt lực của kháng sinh, nhất là những loại kháng sinh có cấu trúc phức tạp, hoặc thành
phần gồm một hỗn hợp kháng sinh cùng họ mà mức độ hoạt lực chênh lệch nhau không
lớn lắm.
Phương pháp vi sinh vật xác định hoạt lực của một kháng sinh bằng cách so sánh tác
động ức chế sự phát triển của một loại vi sinh vật (được gọi là chủng chỉ thị) bởi những
độ pha loãng đã biết của kháng sinh mang thử (chưa biết rõ hoạt lực) với tác động ức
chế bởi nồng độ đã biết của kháng sinh đối chiếu (chất chuẩn đã biết rõ hoạt lực).
Thử nghiệm phải dùng phương pháp phân tích thống kê để đánh giá những số liệu thu
được. Nếu áp dụng mô hình đường thẳng song song, hai đường log liều - đáp ứng của
chất chuẩn và chế phẩm thử phải song song với nhau và phải tuyến tính trong khoảng
liều đã dùng.
Hai phương pháp thường được sử dụng trong kiểm nghiệm là phương pháp khuếch tán
dùng môi trường thạch và phương pháp đo độ đục dùng môi trường lỏng.
Phương pháp thứ nhất dựa vào sự khuếch tán của kháng sinh từ chỗ chứa qua lớp thạch
đặc ở hộp Petri hoặc khay vào khoảng phát triển của vi sinh vật tạo ra một vòng ức chế
hoàn toàn xung quanh nơi chứa (ống trụ, lỗ thạch) dung dịch kháng sinh.
Phương pháp ống nghiệm dựa vào độ đục của canh khuẩn, biết được sự ức chế phát
triển của vi khuẩn gây ra bởi một loạt dung dịch kháng sinh trong môi trường lỏng là
môi trường thích hợp đối với sự phát triển của vi sinh vật khi không có kháng sinh.
Phương tiện và dụng cụ
Tất cả các dụng cụ phải được làm sạch hoàn toàn trước và sau mỗi lần thí nghiệm.
Những dụng cụ thuỷ tinh và những đồ đựng khác dùng trong thí nghiệm phải được loại
hết vi khuẩn và chất ảnh hưởng. Các dụng cụ dùng để giữ và chuyển chủng chỉ thị cần

làm sạch cẩn thận và tiệt khuẩn bằng sức nóng khô hoặc hơi nước ở điều kiện thích
hợp.
Điều kiện nhiệt độ: Khi nuôi cấy chủng chỉ thị và chế tạo nhũ dịch cấy truyền, cần thực
hiện trong môi trường đảm bảo nhiệt độ qui định. Đối với phương pháp đo độ đục, cần
kiểm tra chặt chẽ buồng điều khiển nhiệt độ sao cho nhiệt độ quanh các ống nghiệm
phải đồng đều và phải đạt được nhiệt độ cần thiết trong ống nghiệm. Nên dùng điều
nhiệt bằng nước luân chuyển sẽ tốt hơn điều nhiệt bằng không khí.
Máy đo quang phổ: Được dùng để đo sự truyền qua hoặc hấp thụ trong khoảng sóng
khá hẹp, do đó cần có máy đo quang thích hợp có thể thay đổi được bước sóng hoặc
dùng dùng kính lọc 650 nm hoặc 580 nm để đo nhũ dịch nuôi cấy đã pha chế và dùng
kính lọc 530 nm để đo độ hấp thụ ánh sáng ở phương pháp đo độ đục. Dùng canh thang
đã tiến hành như mẫu nhưng thêm ngay dung dịch formaldehyd để chỉnh máy cho độ
hấp thụ về điểm “ 0 ”
Dụng cụ thí nghiệm:
- Phương pháp khuếch tán: Dùng các khay hoặc đĩa Petri bằng thuỷ tinh hoặc plastic,
đạt tiêu chuẩn bằng phẳng. Đĩa Petri có hai loại, cỡ nhỏ đường kính 100 mm, cỡ lớn
đường kính lớn hơn 160 mm. Các khay thí nghiệm đã được tiêu chuẩn hoá, bằng kính
hoặc plastic với kích thước 25 x 25 cm (loại vuông) hoặc 28,8 x 19,8 cm (loại chữ
nhật). Có thể sử dụng những chất liệu thích hợp đạt tiêu chuẩn bằng phẳng.
Ống trụ bằng thép không rỉ, bằng thuỷ tinh, hoặc bằng sứ, có kích thước như sau:
Đường kính ngoài 8,0 mm; đường kính trong 6,0 mm; cao 10,0 mm.
Vật liệu dùng làm ống trụ phải là loại trơ, riêng đối với kháng sinh nhạy cảm với ánh
sáng phải dùng vật liệu có pha màu nâu. Khi dùng phải làm sạch cẩn thận, loại hết cặn,
khử khuẩn. Đôi khi phải rửa bằng acid như dung dịch acid nitric 2M, hoặc acid
sulfocromic.
Dụng cụ dùng cho phương pháp đo độ đục: Dùng các ống nghiệm loại 16 x 125 mm
hoặc 18 x 150 mm bằng thuỷ tinh có cùng chiều dài, đường kính và độ dày, bề mặt
phải không có vết xước, không dây bẩn. Khi dùng, ống nghiệm phải sạch hoàn toàn,
đảm bảo không còn vết kháng sinh hoặc vết các chất tẩy rửa và phải tiệt khuẩn trước
khi dùng.

Môi trường, dung môi và chất pha loãng
Phải dùng các chất đạt từ mức tinh khiết hoá học trở lên để pha chế.
Môi trường
Dưới đây là công thức môi trường cần thiết dùng cho kiểm nghiệm kháng sinh. Các
loại môi trường này có thể được thay thế bằng môi trường khô tương ứng hoặc bằng
một loại môi trường thúc đẩy vi sinh vật phát triển tốt hơn mà cùng cho một đường đáp
ứng tương tự. Pha môi trường bằng cách hoà tan thành phần trong công thức vào một
phần nước, sau đó thêm nước vừa đủ một lít. Dùng dung dịch acid hydrocloric 1N
hoặc dung dịch natri hydroxyd 1N để điều chỉnh môi trường sao cho sau khi tiệt khuẩn
ở 121
o
C trong
15 phút có pH như ghi trong công thức. Thời gian cần cho việc tiệt khuẩn có thể kéo
dài tới 30 phút đối với những môi trường có thể tích lớn hơn 500 ml.
Môi trường số 1
Pepton khô
Casein pancreatic
Cao men bia
Dextrose monohydrat
Thạch
Nước cất
pH: 6,0 đến 7,0
6,0 g
4,0 g
3,0 g
1,0 g
20,0 g
1000 ml

Môi trường số 2:

Pepton khô
Cao men bia
Cao thịt
Thạch
Nước cất
6,0 g
3,0 g
1,5 g
20,0 g
1000 ml
pH: 6,0 đến 7,0
Môi trường số 3:
Pepton khô
Cao men
bia
Cao thịt
Dextrose monohydrat
Dikali hydrophosphat
(K
2
HPO
4
)
Kali dihydrophosphat
(KH
2
PO
4
)
Natri clorid

Nước cất
pH: 6,0 đến 7,0
5,0 g
1,5 g
1,5 g
1,0 g
3,58 g
1.32 g
3,5 g
1000 ml
Môi trường số 4:
Giống như môi trường số 2 nhưng có pH là 7,0 đến 8,0.
Môi trường số 5:
Giống như môi trường số 1, nhưng có pH là 7,8 đến 8,0.
Môi trường số 6:
Casein pancreatic

Bột đậu tương papaic

Natri clorid
Dextrose monohydrat
Dikali hydrophosphat (K
2
HPO
4
)

Thạch

Polysorbat 80

Nước cất
pH : 7,0 đến 7,3
17,0 g
3,0 g
5,0 g
2,5 g
2,5 g
15,0 g
10,0 ml
1000 ml
Chú ý: Polysorbat 80 được thêm vào một lượng dung dịch nóng của các thành phần
khác trước khi thêm nước vừa đủ dung tích cần thiết.
Môi trường số 7:
Pepton khô

Cao men bia
Cao th
ịt
Dextrose monohydrat
Natri clorid
Th
ạch
Nư
ớc cất
pH: 6,0  0,2
9,4 g
4,7 g
2,4 g
10,0 g
10,0 g

20,0 g
1000 ml
Dung môi và chất pha loãng
Dung môi và chất pha loãng dùng trong thí nghiệm phải không ảnh hưởng đến sự phát
triển của vi sinh vật. Chúng được dùng để pha các dung dịch theo yêu cầu trong từng
thí nghiệm. Các loại dung môi như nước vô khuẩn, acid hydrocloric, ethanol,
dimethylformamid và các dung dịch đệm có dải pH khác nhau hoặc các loại khác tuỳ
thuộc vào từng kháng sinh riêng biệt (bảng 2).
Các dung dịch đệm phosphat được chế tạo bằng cách hoà tan lượng dikali
hydrophosphat và kali dihydrophosphat (theo bảng 1) vào trong nước vừa đủ để được
1000 ml. Sau đó điều chỉnh với acid phosphoric 18 N hoặc natri hydroxyd 18 N đến pH
cần thiết. Giá trị pH chỉ ra trong bảng là pH của dung dịch sau khi đã tiệt khuẩn.
Bảng 1.
Số
dung
dịch
đệm
Dikali
hydrophospha
t K
2
HPO
4
(g)
Kali
dihydrophospha
t KH
2
PO
4

(g)
pH
điều chỉnh
đến
1
2
3
4
5
6
2,0
16,73
0
20,0
35,0
13,6
8,0
0,523
13,61
80,0
0
4,0
6,0  0,1
8,0  0,1
4,5  0,1
6,0  0,1
10,5  0,1
7,0  0,2
Chất đối chiếu và đơn vị
Chất đối chiếu được dùng trong thử nghiệm là những chất có hoạt lực được xác định chính

xác so với chuẩn quốc tế hoặc chất đối chiếu quốc tế tương ứng.
Hoạt lực của một kháng sinh được thể hiện bằng đơn vị quốc tế. Một đơn vị quốc tế là
hoạt lực đặc biệt chứa trong một lượng (tính theo cân nặng) của chuẩn sinh học quốc tế
tương ứng hoặc chế phẩm đối chiếu sinh học quốc tế. Từng thời kỳ, Hội đồng về
chuẩn sinh học của Tổ chức y tế thế giới sẽ có chỉ dẫn và qui định chính xác cho mỗi
chuẩn quốc tế . Trong một vài trường hợp, định nghĩa số đơn vị quốc tế có thể bao gồm
một tổng lượng của một vài nguyên liệu vì thực tế khó cân một lượng nhỏ dù chính xác
của chất chuẩn sinh học quốc tế hoặc chất đối chiếu sinh học quốc tế.
Hoạt lực của một vài chất kháng sinh có thể được biểu thị bằng g. g hoạt lực không
nhất thiết tương ứng với khối lượng của chất kháng sinh vì nó không thể bao hàm toàn
bộ thực thể hoá học tinh khiết riêng của từng kháng sinh đó.
Chủng chỉ thị và dịch cấy truyền
Các chủng chỉ thị dùng phải nhạy cảm, phù hợp với từng kháng sinh, theo qui định ở
bảng 2. Có thể dùng chủng chỉ thị khác với chủng chỉ thị giới thiệu trong chuyên luận
này miễn sao chủng phải nhạy cảm với kháng sinh cần định lượng.
Chế tạo dịch cấy truyền
Chế tạo nhũ dịch vi khuẩn không có nha bào
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae (không tạo vỏ )
Micrococcus luteus
Saccharomyces cerevisiae
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus faecium
Dùng chủng chỉ thị mới phát triển trên thạch nghiêng sau 24 giờ, cấy truyền lại lên mặt
một ống thạch nghiêng khác hoặc một bề mặt thạch rộng (như trong bình Roux) của
môi trường số 1 (Saccharomyces cerevicae dùng môi trường số 8; Streptococcus faecium
dùng môi trường số 3) ủ ở 32 - 35
0
C trong 24 giờ (riêng với Klebsiella pneumoniae và

Streptococcus faecium ủ ở 37
0
C) với Saccharomyces cerevisiae ủ ở 30
0
C. Thu vi khuẩn
đã phát triển trên bề mặt môi trường bằng nước muối sinh lý, rồi hoà loãng với cùng
một chất hoà loãng tới độ đục thích hợp để được đáp ứng thích hợp trong phương pháp
đo độ đục, hoặc để tạo ra vùng ức chế rõ ràng, sắc nét thuận lợi khi đo trong phương
pháp khuếch tán.
Thí dụ: Pha loãng hỗn dịch vi khuẩn tới nồng độ sao cho khi đo ở bước sóng 650 nm,
cốc đo dày 1cm, độ truyền qua T = 50%, ở bước sóng 580 nm T = 25%, hay cho vòng
vo khuẩn rõ, sắc net có đường kính 13 mm.
Nhũ dịch vi khuẩn chế tạo như trên đem bảo quản ở nhiệt độ dưới 4
0
C có thể sử dụng
trong 2 tuần.
Chế tạo nhũ dịch nha bào
Bacillus cereus
Bacillus pumilus
Bacillus subtilis
Cho chủng vi khuẩn mọc qua đêm trên ống thạch nghiêng môi trường số 1 ở 37
0
C
(riêng với Bacillus cereus nuôi ở 30
0
C). Thu vi khuẩn đã phát triển trên mặt thạch bằng
nước muối sinh lý, rồi chuyển sang một bề mặt thạch rộng hơn (như trong bình Roux)
của môi trường số 1, trong môi trường này đã thêm vào dung dịch 0,001% (kl/tt)
mangan sulfat (MnSO
4

) để giúp thúc đẩy sự hình thành nha bào. Nhũ dịch vi sinh vật
được trải cho phủ kín bề mặt môi trường bằng cách cho vào bề mặt thạch một vài viên
bi thuỷ tinh vô khuẩn. Đem ủ ở 37
0
C (riêng với Bacillus cereus ủ ở 30
0
C) trong 7
ngày. Dùng nước cất vô khuẩn rửa vi khuẩn đã mọc (chủ yếu là nha bào) đem hoà
loãng tới nồng độ thích hợp, thí dụ khoảng 10
7
- 10
8
nha bào trong 1ml, đun cách thủy
nhũ dịch nha bào ở nhiệt độ 70
o
C trong 30 phút. Dùng test phiến kính để kiểm tra khả
năng sống của nha bào. Xác định lượng nhũ dịch nha bào để cho vào 100 ml môi
trường định lượng có thể tạo được vùng ức chế rõ ràng, sắc nét. Nhũ dịch nha bào có
thể giữ lâu ở nhiệt độ 4
0
C.
Các loại thử nghiệm
Thử nghiệm hai liều và ba liều.
Phương pháp khuếch tán
Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử: Dung dịch chuẩn nồng độ đã biết và dung dịch
thử được coi như xấp xỉ nồng độ dung dịch chuẩn. Các dung dịch chuẩn và thử này ban
đầu được pha vào dung môi thích hợp để được những dung dịch gốc. Sau đó pha loãng
dung dịch gốc bằng dung môi hoặc dung dịch đệm vô khuẩn đến nồng độ thích hợp, có
pH thích hợp cho từng loại kháng sinh ( xem bảng 2). Để xác định hiệu lực của kháng
sinh, dùng ba liều khác nhau của chuẩn (S

1
, S
2
, S
3
) mang so sánh với ba liều khác nhau
của thử (U
1
, U
2
, U
3
) có hoạt lực được coi như dung dịch chuẩn. Nồng độ được pha theo
cấp số nhân, thí dụ pha một loạt độ pha loãng theo tỷ lệ 2 : 1 hoặc 4 : 1. Nếu quan hệ
giữa logarit nồng độ kháng sinh và đường kính vùng ức chế đã chỉ ra gần như thẳng
với hệ số đã dùng thì có thể dùng định lượng thường xuyên bằng cách chỉ dùng hai
nồng độ chuẩn (S
1
, S
2
) và hai nồng độ thử (U
1
, U
2
) - Thử nghiệm hai liều. Trong
trường hợp có tranh chấp bắt buộc phải sử dụng định lượng ba liều.
Chuẩn bị cấy truyền
Các thử nghiệm có thể tiến hành trên những đĩa Petri hoặc khay bằng phẳng. Đổ vào
hộp Petri hoặc khay môi trường thích hợp đã cấy truyền chủng chỉ thị thích hợp cho
từng kháng sinh. Lớp môi trường này thường có độ dày 3 - 4 mm (riêng với

amphotericin B nystatin độ dày là 1 - 2 mm, đối với bleomycin, mithramycin độ dày 2
- 3 mm). Thạch dinh dưỡng có thể được đổ thành một lớp hoặc hai lớp (gồm lớp nền
không có vi khuẩn và lớp gieo cấy), nên chọn nồng độ nhũ dịch cấy vào môi trường
sao cho tạo được vùng ức chế sắc nét nhất tương ứng với các liều lượng của kháng
sinh. Dùng nhũ dịch chủng chỉ thị đã chế tạo như phần trên, thường cấy vào môi
trường với nồng độ 1 ml chủng cho 100 ml môi trường là thích hợp. Khi nhũ dịch
chủng là loại không có nha bào, thường phải cấy vào môi trường thạch đã đun chảy
hoàn toàn và để nguội đến 45 - 50
0
C. Trường hợp nhũ dịch chủng là nha bào, nhiệt độ
cho phép khi cấy tối đa là 65 - 70
0
C. Dùng một lượng thích hợp môi trường đã cấy
chủng chỉ thị, rót một cách vô khuẩn vào đĩa petri hoặc khay kính (trên đĩa thạch hoặc
khay đã có thạch nền hoặc không tuỳ theo yêu cầu) để được một lớp môi trường có độ
dày thích hợp, dàn trải nhanh và đậy nắp ngay. Trong khi đợi thạch đông đặc, đặt khay
kính hoặc hộp petri trên một tấm kính để tạo một mặt phẳng giúp cho môi trường trên
khay hoặc hộp có độ dày đồng nhất. Những môi trường đã chuẩn bị được để khô ở
nhiệt độ phòng 30 phút trước khi sử dụng (riêng đối với colistin và colistin sulfomethat
natri, đĩa petri hoặc khay kính đã cấy truyền phải để ở tủ lạnh 4
0
C trong vài giờ).
Tiến hành thử:
Đối với thử nghiệm 3 liều, dùng 6 ống trụ vô khuẩn đặt lên mặt thạch đã cấy truyền
trong một hộp petri (với thử nghiệm 2 liều dùng 4 ống trụ cho mỗi hộp). Có thể thay
các ống trụ bằng cách dùng dụng cụ đục lỗ đã tiệt khuẩn, đục vào môi trường thạch để
tạo ra những lỗ thạch đường kính 6 - 8 mm (hoặc thay bằng những khoanh giấy tẩm
kháng sinh). Phân phối các dung dịch thử nghiệm của chuẩn và mẫu thử trên mỗi hộp
Petri hay khay vuông sao cho phù hợp với kiểu bố trí thí nghiệm đã chọn (xem phụ lục
13.10). Việc bố trí ống trụ, lỗ khoan, hoặc khoanh giấy trên mặt thạch phải sao cho các

vùng ức chế không bị trùm lên nhau.
Dùng pipet nhỏ vào ống trụ, hoặc lỗ thạch một lượng bằng nhau các dung dịch kháng
sinh. Nếu dùng các khoanh giấy phải tiêu chuẩn hoá trước thể tích chính xác chất lỏng
cho mỗi khoanh giấy. Giữ hộp petri hoặc khay ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 - 4 giờ
tuỳ theo đặc tính của mỗi kháng sinh. Đối với những kháng sinh nhạy cảm với nhiệt
độ, phải được giữ ở nhiệt độ 4
0
C để sự khuếch tán của kháng sinh vào môi trường xẩy
ra chậm và làm giảm đến mức tối thiểu hiệu quả của sự biến đổi theo thời gian giữa các
dung dịch khác nhau. Đối với colistin và colistin sulfomethat natri nên để 2 - 4 giờ ở
nhiệt độ phòng trước khi ủ. Các hộp Petri hoặc khay sau thời gian để khuếch tán, mang
ủ ở nhiệt độ thích hợp cho từng kháng sinh riêng (bảng 2). Nhiệt độ ủ phải được kiểm
tra để khoảng nhiệt độ chênh lệch so với quy định chỉ trong khoảng  0,5
0
C. Thời gian
ủ thường kéo dài 16 - 18 giờ. Dùng dụng cụ đo có độ chính xác tối thiểu 0,1mm, đo
đường kính vùng ức chế tạo bởi các nồng độ khác nhau của chuẩn và thử.
Kiểm tra tính có giá trị của định lượng, tính hoạt lực và giới hạn tin cậy của hoạt lực
kháng sinh theo phụ lục 13.10

Phương pháp đo độ đục
Pha các dung dịch thử nghiệm của chuẩn và mẫu thử
Dung dịch dịch thử nghiệm của chuẩn và mẫu thử được pha trong dung môi thích hợp
và được pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat có pH thích hợp cho từng kháng sinh
theo chỉ dẫn ở bảng 2. Để đảm bảo giá trị hiệu lực của phép thử, làm thử nghiệm 3 liều
là thích hợp. Pha song song những độ hoà loãng gồm 3 liều chuẩn (S
1
, S
2
, S

3
) và 3 liều
thử (U
1
, U
2
, U
3
).
Chế tạo canh thang để cấy truyền
Để có được một độ đục thích hợp dùng được ngay ở dịch cấy truyền, pha dịch cấy
truyền như mô tả ở phần chế tạo nhũ dịch cấy truyền rồi dùng ngay. Chủng chỉ thị và
điều kiện thử nghiệm của từng kháng sinh sử dụng trong phương pháp này được ghi
trong bảng 2.
Tiến hành
Các ống nghiệm được xếp thành từng nhóm, mỗi nhóm 3 - 5 ống, thêm vào mỗi ống 1
ml dung dịch của từng độ pha loãng của dung dịch chuẩn hoặc mẫu thử. Đặt các ống
nghiệm vào giá ống nghiệm theo quy tắc ngẫu nhiên theo khối hoặc theo hình vuông
latinh. Trong mỗi giá có 2 ống dùng kiểm tra không thêm kháng sinh, một ống chứa 1
ml dịch pha loãng, còn ống kia chứa 1 ml dịch pha loãng và 0,5 ml dung dịch
formaldehyd 12% (tt/tt).
Thêm vào mỗi ống 9 ml canh thang đã cấy truyền. Đặt giá đã chuẩn bị xong ngay vào
trong tủ ấm hoặc cách thuỷ, giữ ở nhiệt độ thích hợp, khống chế nhiệt độ ở mức sai số
 0,5
0
C so với nhiệt độ cần ủ (theo bảng 2) trong 3 - 4 giờ. Sau khi ủ, làm ngừng sự
phát triển của vi khuẩn bằng cách thêm vào mỗi ống 0,5 ml dung dịch formaldehyd
12% (tt/tt) trừ ống kiểm tra đã thêm formaldehyd 12% trước hoặc nhúng giá có các ống
nghiệm đã ủ vào nước sôi . Lấy từng giá ống nghiệm khỏi nơi ủ, xác định độ truyền
qua hoặc độ hấp thụ của mỗi dung dịch bằng máy đo quang ở 530 nm.

Kiểm tra tính có giá trị của định lượng, tính hoạt lực và giới hạn tin cậy của hoạt
lực kháng sinh theo phụ lục 13.10
Phương pháp đường chuẩn
Hoà tan một lượng cân chính xác chất đối chiếu hoặc chất chuẩn sinh học của một
kháng sinh đã cho trong dung môi thích hợp, có thể phải làm khô trước. Pha loãng với
dung môi qui định để được dãy chuẩn có 5 nồng độ. Tỷ lệ tăng giữa các nông độ nên là
1: 1,25. (xem hướng dẫn ở bảng 2)
Tiến hành
Khi tiến hành xây dựng đường chuẩn, khảo sát trên ít nhất 12 hộp Petri. Khi xác định
hàm lượng của một kháng sinh dùng ít nhất 3 hộp Petri. Đổ vào mỗi hộp Petri 21 ml
môi trường đã đun chảy, đợi thạch đông cứng lại tạo thành lớp có độ dày đồng đều và
một bề mặt bằng phẳng để làm nền. (Riêng với amphotericin B, nystatin thì không dùng
lớp nền). Đối với bleomycin, cycloserin, mithramycin hoặc mytomycin dùng 10 ml làm
lớp nền. Lớp nuôi cấy dùng 4 ml cho mỗi hộp, được đổ và láng đều sau khi lớp nền đã
đông cứng, đặt lên mặt thạch trong đĩa 6 ống trụ bằng thép không rỉ hoặc những ống
bằng chất liệu khác như đã quy định ở phần dụng cụ. Các ống trụ tạo thành một hình
lục giác đều cách tâm khoảng 2,8 cm. Chia 12 hộp Petri để xây dựng đường chuẩn
thành 4 nhóm, mỗi nhóm 3 hộp. Dung dịch có nồng độ trung gian được lấy làm nồng
độ kiểm tra dùng hiệu chỉnh các giá trị đo được ở mỗi nhóm. Đổ đầy dung dịch kiểm
tra vào 3 ống trụ, bố trí xen kẽ trong mỗi hộp Petri. Các ống trụ còn lại được đổ đầy
dung dịch có nồng độ của một nhóm. Sau khi ủ các hộp ở nhiệt độ thích hợp 32 - 35
0
C
(theo chỉ dẫn bảng 2) khoảng 16 - 18 giờ sẽ đo được 9 giá trị đường kính vòng vô
khuẩn của nồng độ kiểm tra theo nhóm. Tổng số cả 4 nhóm sẽ đo được 36 giá trị đường
kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra. Độ chính xác của mỗi kết quả đo là  0,1 mm.
Cách tính
Giá trị trung bình các đường kính vòng vô khuẩn ở mỗi nồng độ là a, b, d, e; giá trị
trung bình các đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra của mỗi nhóm 3 hộp (9
kết quả) là C

a
, C
b
, C
d
, C
e
và giá trị trung bình các đường kính vòng vô khuẩn của nồng
độ kiểm tra ở tất cả 12 hộp (ký hiệu là C), gồm 36 kết quả .
So sánh giá trị trung bình của các đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra của
mỗi nhóm với giá trị trung bình của các đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra
của 12 hộp(C). Hiệu của chúng (C - C
a
; v. v ) là số hiệu chỉnh dùng để điều chỉnh giá
trị trung bình của các đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ mỗi nhóm. Cộng đại số giá
trị hiệu chỉnh đạt được vào giá trị trung bình của đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ
của mỗi nhóm ta được các giá trị trung bình của các đường kính vòng vô khuẩn đã hiệu
chỉnh của mỗi nồng độ là a, b, d, e.
Thí dụ: Giá trị trung bình của đường kính 36 vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra tính
được là 19,2 mm; giá trị trung bình của đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ kiểm tra
của nhóm nồng độ a là C
a
= 19,0 mm. Số hiệu chỉnh là 19,2 - 19,0 = 0,2 mm. Giá trị
trung bình của đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ của nhóm là 17,9 mm. Vậy giá trị
trung bình của đường kính vòng vô khuẩn ở nồng độ của nhóm sau khi đã hiệu chỉnh là
a = 17,9 + 0,2 = 18,1 mm.
Trên hai chu kỳ giấy bán logarit vẽ đường chuẩn qua các điểm giá trị trung bình đã
hiệu chỉnh. Trên trục tung (chia theo thang logarit) lấy nồng độ kháng sinh bằng àg
hoặc đơn vị hoạt lực trong ml. Trên trục hoành (chia theo thang số học) lấy giá trị
đường kính vòng ức chế. Như vậy đường chuẩn được vẽ qua điểm tương ứng với giá

trị đường kính vòng ức chế cao nhất và thấp nhất tính được bằng phương trình sau:

3a + 2b + C -
e
L =
5
3e + 2d + C -
a

H =
5

L: Đường kính vòng vô khuẩn tính cho nồng độ thấp nhất của đường chuẩn.
H: Đường kính vòng vô khuẩn tính cho nồng độ cao nhất của đường chuẩn.
C: Đường kính trung bình của 36 kết quả của nồng độ kiểm tra.
a, b, d, và e: Những giá trị đường kính trung bình đã hiệu chỉnh cho từng dung dịch còn
lại xếp theo thứ tự từ nồng độ thấp nhất tới nồng độ cao nhất.
Ba hộp Petri dùng cho mẫu thử nghiệm cũng được tiến hành đồng thời khi xây dựng
đường chuẩn. Trong ba hộp này nhỏ xen kẽ giữa nồng độ trung gian của dung dịch
chuẩn với nồng độ của mẫu thử đã pha loãng với dung dịch đệm thích hợp để có nồng
độ giả định tương đương nồng độ trung gian của chuẩn.
Sau khi đo đường kính các vòng vô khuẩn của mẫu thử, tính trung bình hiệu chỉnh theo
giá trị đường kính nồng độ trung gian sẽ được đường kính của chế phẩm thử. Trên trục
hoành ứng với giá trị đường kính vừa tìm được của mẫu thử, kẻ đường vuông góc với
trục hoành cắt đường đường chuẩn vừa vẽ được tại một điểm và từ điểm này trên
đường chuẩn hạ vuông góc với trục tung sẽ tìm được giá trị nồng độ ứng với đường
kính của mẫu thử.
Hoạt lực của chế phẩm được tính ra phần trăm so với chuẩn theo công thức sau:

Hoạt lực tìm thấy của chế phẩm 

100

R%
=
Hoạt lực tìm thấy ở nồng độ trung
gian