Tổng quan về ENZYM LIPASE

Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VỀ ĐẶC ĐIỂM CỦA ENZYM
LIPASE
1. Định nghĩa Lipase
Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3)
 Là enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân triacylglycerol ( dầu thực vật,
mỡ động vật ) tạo thành glixerin và axit béo tương ứng. Lipase xúc tác
phản ứng thuỷ phân lần lượt từng liên kết
α
- ester trong phân tử chứ
không phải c ắt đứt cả 3 liên kết ester cùng lúc.
 Có hoạt tính mạnh đối với cơ chất không tan trong nước, thể hiện hoạt
tính bề mặt.
 Hoạt động mạnh trong hệ nhũ hóa, đặc biệt là hệ nhũ đảo (nước trong
dầu).
2. Phân loại và cấu trúc của lipase
2.1. Phân loại
 Theo nguồn gốc:
 Lipase từ động vật : thu nhận thường khó và hiệu quả kinh tế
không cao
 Lipase từ thực vật
 Lipase từ vi sinh vật : vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để
sản xuất enzym với quy mô công nghiệp lớn, đồng thời việc thu
nhận chế phẩm cũng dễ dàng và có thể thoã mãn trong 1 mức độ
lớn nhu cầu của các ngành công nghiệp khác nhau.
 Theo tính chất:
 Lipase có tính đặc hiệu vò trí
C. (cylindracae) rugosa
Corynebacterium
Staphylococus aureus
 Lipase có tính đặc hiệu cơ chất : Cơ chất có khả năng kết hợp vaò

trung tâm hoạt động của enzym và bò chuyển hoá dưới tác dụng
của enzym.
C. rugosa (C18:1 cis-9)
A. niger (C10 và C12 hoặc C18:1 cis-9)
M. miehei (C12)
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
G. Candidum đặc hiệu với γ-linolenate trong dầu cây borage và axit
eruic từ dầu hạt nho.v.v.
o Bertolini nhân hai giống lipase vô tính I và II từ chủng G. candidum
ATCC 34614
o Loại I đặc hiệu với axit béo không no nối đôi vò trí cis-9
o Loại II đặc hiệu với các cơ chất có chuỗi acyl từ C8-C14
o Yuzo và các đồng sự báo cáo về tính đặc hiệu của hai loại lipase từ
chủng Pseudomonas (lipase HU 308 và AK 102) đối với các axit béo
C20 nối đôi vò trí delta 5
o Sự thay đổi hàm lượng axit béo C20 trong axit béo phân đoạn tách ra
trong suốt quá trình thủy phân dầu giàu PUFA bằng lipase
2.2. Cấu trúc của lipase
Lipase từ động vật
 Cấu tạo lipase tuyến tụy từ người gồm hai tiểu phần, phần lớn hơn
chứa ù đuôi N, phần nhỏ hơn chứa đuôi C.
 Nhân của tiểu phần đuôi N hình thành bởi 9 sợi xếp song song
trên mặt phẳng gấp nếp β
 Tiểu phần C hình thành bởi hai lớp mặt phẳng không song song
 Tiểu phần N chứa trung tâm hoạt động, liên kết với nhóm
glycosyl, liên kết với Ca2+ và có thể liên kết với heparin
 Trung tâm hoạt động bò che dưới các vòng xoắn α mạch ngắn gọi
là các nắp hay nút đậy
 Lipase từ nấm
 Không có sự tương đồng cấu trúc với lipase tuyến tụy ngoài mối

liên hệ chuỗi Gly-X-Ser-X-Gly có liên hệ với trung tâm hoạt
động
 Cũng có cấu trúc nắp đậy
 Lipase từ vi khuẩn
 Một số lipase từ chủng Pseudomonas như P. cepacia, P. glumae,
P. flourensence
 Có kích thước phân tử dao động từ 30-35kDa cho thấy có
nhiều sự đồng đẳng
 Chuỗi G-X-S-X-G liên kết với trung tâm hoạt động
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
 Lipase từ loài Bacillus
 Có khối lượng phân tử khoảng 19kDa
 Chuỗi A-X-S-X-G liên kết với trung tâm hoạt động
3. Tính chất của enzym lipase:
 Lipase có hoạt tính bề mặt ở phân pha nước/lipit và chỉ thuỷ phân chất béo
đã nhũ hố. Lipase khác với ccác enzym esterase khác ở điểm, esterase chỉ
thuỷ phân các ester tan trong nước như TAG.
 Lipase có nhiều trong sữa, các hạt có dầu (đậu nành, đậu phộng), ngũ cố (lúa
mạch, yến mạch), trong trái cây và rau, trong hệ thống tiêu hố của động vật
và nhiều loại vi sinh vật.
 Lipase có thể thuỷ phân cả 3 liên kết ester trong TAG hoặc chỉ thuỷ phân
một số liên kết ester nhất định giữa gốc –OH và các gốc acyl trong phân tử
acyl lipit. Bảng 4.9 cho biết đặc tính đặc hiệu của một số enzym lipase
Liên kết bị thuỷ phân Nguồn lipase
Các gốc acyl ở vị trí 1,3 Tuyến tuỵ, sữa, Pseudomonas fragi,
Penicillium roqueforti
Các gốc acyl ở vị trí 1, 2 và 3 yến mạch, hạt thầu dầu, Aspergillus flavus
Axit oleic và linoleic ở vị trí 1,2 và 3 Geotrichum candidum
Kích thước của giọt dầu trong hệ nhũ tương càng nhỏ thì tổng diện tích bề mặt
phân pha dầu / nước càng lớn dẫn đến hoạt tính của lipase càng cao. Lipase

trong tụy heo là enzim được nghiên cứu đầy đủ nhất. Nó có MW 48kDa, khả
năng thủy phân giảm dần trong dãy cơ chất : TAG > DAG >MAG.
Phân tử pancreatic lipase ( lipase tuyến tụy ) có đầu kỵ nước gắn với giọt dầu
nhờ các tương tác kỵ nước, còn tâm hoạt động của enzym thì gắn với phân tử cơ
chất tại tâm hoạt động có các axit amin Ser, His, và Asp có vai trò tham gia vào
việc cắt các liên kết ester ( tương tự như ở serine proteinase ). Tâm hoạt động
của lipase còn chứa nhóm Leucine có tác dụng tạo ra liên kết kỵ nước với cơ
chất lipid và đặt cơ chất đúng vào vị trí tại tâm hoạt động của enzym. Hoạt tính
của lipase được tăng cường bởi iơn Ca
2+
, các axit béo tự do tạo ra sẽ kết hợp với
Ca
2+
để tạo thành muối khơng tan.
- Lipase của sữa cũng tương tự như lipase tuyến tụy. Các lipase thu được từ vi
sinh vật thường có độ bền nhiệt cao. Ví dụ như lipase từ Pseudomonas
fluosescence có thể khơng bị mất hoạt tính khi thanh trùng hay xử lý ở nhiệt
độ cao cũng như trong q trình sấy. Lipase này có thể gây ra những hư hỏng
và làm giảm chất lượng sữa bột trong q trình bảo quản.
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
- Hoạt tính lipase trong thực phẩm khơng hồn tồn dự đốn được độ bền của
thực phẩm trong q trình bảo quản. Tính đặc hiêu cơ chất của lipase rất
khác biệt nên các axit béo tự do tạo ra trong q trình thủy phân rất khó xác
định. Ngưỡng giá trị cảm nhân mùi và vị của các axit béo cũng thay đổi rất
khác nhau nên ảnh hưởng của lipase lên mùi của thực phẩm cũng rất khác
biệt. Các thơng tin chính xác chỉ có được khi định lượng các axit béo tạo ra
torng q trình bảo quản bằng sắc kí khí.
Chú thích : HLL: Humicola lanuginosa
PcamL: Penicillium camembertii
RDL: Rhizopus delemar

CLL: Candida lipolytica
RJL: Rhizomucor javanicus
ROL: Rhizopus oryzae
GCL: Geotrichum candidum
CRL: Candida rugosa
Toồng quan ve enzym lipase tửứ caự GVHD: Tran Bớch Lam
PCL: Pseudomonas cepacia
PFL: Pseudomonas fluorescens
Toồng quan ve enzym lipase tửứ caự GVHD: Tran Bớch Lam
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
3.1. Cường lực xúc tác :
Lipase là chất xúc tác sinh học,nó có đầy đủ các tính chất của 1 chất xúc tác.
Tuy nhiên lipase có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so vi71 các chất xúc tác
thông thường.
Khả năng xúc tác của enzym được xác định thơng qua hoạt độ hoạt động của
enzym. Hoạt độ hoạt động của enzym được xác định thơng qua đơn vị hoạt độ.
Người ta biểu diễn đơn vị hoạt độ qua những đơn vị sau :
a) Đơn vị enzym quốc tế (UI) là lượng enzym có khả năng xúc tác làm chuyển
hố được một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn
1 UI = 1µmol cơ chất (10
-6
mol)/phút
b) Katal (Kat) là lượng enzym có khả năng xúc tác làm chuyển hố được 1mol
cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn
1 Kat = 1mol cơ chất/giây
1 UI =
10
1
. 10
-6

Kat = 16.67 nKat (nanokatal)
c) Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzym là số đơn vị UI ( hoặc số đơn vị
Katal) ứng với 1ml dung dịch (nếu là dịch) hoặc 1mg Protein (nếu là bột khơ)
của chế phẩm enzym.
Nếu chế phẩm enzym đã tinh sạch, hoạt độ được biểu thị bằng số UI (hoặc Kat)
trên 1mg enzym. Khi biết được khối lượng ptử của enzym ta hồn tồn có thể
tính được hoạt độ riêng của phân tử.
d) Hoạt độ riêng phân tử: là số phân tử cơ chất được chuyển hố bởi một phân
tử enzym trong một đơn vị thời gian.
3.2. Tính đặc hiệu của enzym:
3.2.1. Đặc hiệu kiểu phản ứng: Enzym lipase chỉ có thể xúc tác cho phản ứng
thuỷ phân.
3.2.2. Đặc hiệu cơ chất: Cơ chất là chất có khả năng kết hợp vào trung tâm
hoạt động của enzym và bò chuyển hoá dưới tác dụng của enzym.
Lipase có tính đặc hiệu tương đối : nó có khả năng tác dụng lên 1 kiểu liên kết
nhất đinh trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần
tham gia tạo thành mối liên kết đó. Lipase có khả năng thuỷ phân được tất cả
các mối liên kết ester carboxylic.
Cơ chế tác dụng của lipase:
Thông thường, trong phản ứng có xúc tác enzym, nhờ sự tạo thành phức hợp
trung gian enzym – cơ chất mà cơ chất được hoạt hoá, bởi lẽ khi cơ chất kết
hợp vào enzym do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dòch của các electron và
sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
đổi động năng cũng như thế năng, kết quả làm cho phân tử cơ chất trởø nên hoạt
động hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng
Quá trình tạo thành phức enzym – cơ chất (ES) và biến đổi phức này thành sản
phẩm, giải phóng enzym tự do thường trải qua 3 giai đoạn :
E + S ES P + E
- Giai đoạn 1: Enzym kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức ES

không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hoá thấp
- Giai đoạn 2: Khi cơ chất tạo phức với E sẽ bò thay đổi cả cấu hình không gian,
cả về mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả là các liên kết bò phá vỡ
- Giai đoạn 3: tạo thành sản phẩm còn ezym dc giải phóng dưới dạng tự do.
• Cơ chế tác dụng của Lipase : tâm ái nhân của lipase
sẽ tương tác với 1 trong 2 nguyên tử tích điện dương của liên kết bò thuỷ
phân. Sự tạo thành phức hợp trực tiếp như thế với trung tâm phản ứng sẽ
làm cho sự đứt các liên kết và sự thuỷ phân dc dễ dàng thuận lợi.
• Một cơ chế khác liên hệ tính tác dụng của ezym với
sự khuyết electron của liên lết bò thuỷ phân là : Enym làm tăng sự
khuyết electron vốn đã tồn tại trước đó, bằng cách tạo thành liên kết
tương ứng với cơ chất ở những vò trí ít nhiều gần gũi với liên kết bò thuỷ
phân. Nhờ vậy mà làm cho sự phân bố electron trong phân tử cơ chất bò
thay đổi theo 1 chiều hướng cần thiết, khiến cho việc đứt liên kết được
dễ dàng hoặc khiến cho 1 trong 2 nguyên tử của liên kết tương tác được
với các tác nhân ái nhân.
AB + H
2
O AOH + BH
Dưới tác dụng của enzym lipase, khi hợp chất AB kết hợp với enzym thì liên
kết A-B bò kéo căng , kèm theo sự chuyển dòch electron dẫn đến làm đứt liên
kết A-B và gắn nhóm HO
-
của nước vào phần B của phân tử.
Sau khi hoàn thành phản ứng enzym dược giải phóng dưới dạng tự do.
4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của enzym lipase.
 Cơ chất
 Hệ nhũ tương thường
 Hệ nhũ tương đảo
 Hệ nhũ tương nhỏ (các micell đảo)

• Liu và các đồng sự tìm ra tỷ lệ mỡ heo/tristearin 3:1 là tối ưu trong tổng
hợp chất thay thế bơ cacao từ Lipozym IM-20
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
• Báo cáo của Ting và các đồng sự thì tỷ lệ dầu nước là 10/5 là tối ưu với
hiệu suất thủy phân dầu nành là 48% với lipase cố đònh trên hạt chitosan
bằng phương pháp BINARY
 pH
Ting và đồng sự báo cáo pH tối ưu cho lipase cố đònh trên hạt chitosan là
7-8 thì cho hiệu suất phản ứng hủy phân dầu nành là cao nhất
Liu và các đồng sự báo cáo pH tối ưu của Lipozym là 9 trong phản ứng
nội chuyển hóa tổng hợp bơ cacao từ mỡ heo và tristearin.
o Romija chiết xuất trong dòch gan và t tạng của lớp đầu túc như mực
(Sepiaofficinalis), bạch tuộc ( Eledne cierbosa ) được enzym lipase
xúc tác phản ứng thuỷ phân thấy pH thích hợp nhất của lipase dòch
gan là 6.0, còn của dòch t tạng là 6.4
o Hykeo đã lấy dòch ruột cá vược ( perca fluviatelis ) đem thuỷ phân
tributirin thì thấy tác dụng của chúng mạnh nhất ở 25–37
o
C,
pH = 12.3 – 12.8
o Các nhà khoa học Nhật đã dùng dòch t tạng của tôm càng ( Squil-
laoratoria ) thuỷ phân methylacetat thấy chúng hoạt động mạnh ở
38
o
C, pH = 7.2 với thời gian là 15h.
 Nhiệt độ:
Ting và đồng sự báo cáo nhiệt tối ưu cho lipase cố đònh trên hạt chitosan là
35-60
0
C thì cho hiệu suất phản ứng hủy phân dầu nành là cao nhất

Liu và các đồng sự báo cáo nhiệt độ tối ưu của Lipozym là 50
0
C trong phản
ứng nội chuyển hóa tổng hợp bơ cacao từ mỡ heo và tristearin.
 Chất hoạt hóa và ức chế:
Canxi ( Ca ) hoạt hóa lipase trong phản ứng thủy phân theo ba cơ chế :
 Kết hợp với enzym làm thay đổi cấu trúc
 Giúp lipase dễ dàng hấp thụ lên bề mặt cơ chất-nước
 Khử các axit béo sản phẩm của phản ứng thủy phân giảm khả
năng ức chế của axit với enzym
- Muối mật hoạt hóa lipase từ tuyến tụy của người
- Một vài cơ chất ức chế như :
o Các hợp chất bề mặt có chứa anion
o Protein
o Ion kim loại
o Axit boronuc
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
o Các hợp chất có chứa phospho như cabarmate, β-lactone…
 Nước:
Nước không những là môi trường để khuyếch tán enzym và cơ chất mà còn
là tác nhân tham gia vào phản ứng nữa. Nước có ảnh hưởng không những
tới vận tốc mà cả đến chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzym nữa.
Nước cũng là 1 yếu tố điều chỉnh các phản ứng thuỷ phân bởi enzym, có thể
dùng nước làm nhân tố tăng cường hay kìm hãm các phản ứng thuỷ phân có
enzym xúc tác.
Ting và đồng sự báo cáo tỷ lệ dầu-nước 10/5 là tối ưu cho lipase cố
đònh trên hạt chitosan thì cho hiệu suất phản ứng thủy phân dầu nành
là cao nhất.
Liu và các đồng sự báo cáo aw tối ưu của Lipozym là 0.61 trong
phản ứng nội chuyển hóa tổng hợp bơ cacao từ mỡ heo và tristearin.

Condoret và các đồng sự [8] báo cáo a
w
tối ưu của Lipozyme IM-20 là
0.4-0.7
 p suất:
Liu và các đồng sự báo cáo áp suất tối ưu của Lipozym là 17Mpa trong
phản ứng nội chuyển hóa tổng hợp bơ cacao từ mỡ heo và tristearin.
Nandy và các đồng sự báo cáo áp suất tối ưu là 15mbar cho lipase dùng
tổng hợp dẫn xuất của AHA trong ngành mỹ phẩm.
 Lipase cố đònh và lipase tự do:
Ting và đồng sự báo cáo lipase cố đònh trên hạt chitosan dùng tỷ lệ cơ
chất nước 10/5 có hiệu suất 48% còn lipase tự do với tỷ lệ cơ chất 10/7 có
hiệu suất thấp hơn là 45% trong phản ứng thủy phân dầu nành là cao nhất.
• Olivier và các đồng sự báo cáo rằng 20.1 mg lipase từ chủng
Burkholdenia (BCL) cho phản ứng chuyển hóa ester nhanh hơn khi dùng
38mg lipase đó ở dạng tự do.
Một vài báo cáo về các thông số ảnh hưởng :
 Thủy phân dầu nành bằng lipase cố đònh bằng phương pháp BINARY
trên hạt chitosan báo cáo bởi Ting và các đồng sự
 Yếu tố tỷ lệ dầu nước (10/5)
Tỷ lệ dầu-
nước (w/w)
Biến đổi nhờ
lipase tự do (%)
Biến đổi nhờ lipase
cố định (%)
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
10:1 33.10 38.58
10:3 37.71 45.31
10:5

41.40
48.21
10:7 45.08
47.37
10:9 36.04 43.46





 Động lực học phản ứng thủy phân

V max (U/mg-protein) K m (mg)
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
Lipase cố định 254 1841
Lipase tự do 21.6 469
Liu và các đồng sự báo cáo ứng dụng lipase trong tổng hợp chất thay thế bơ
cacao từ mỡ heo và tristearin bằng phản ứng chuyển hóa ester trong hệ thống
CO
2
siêu tới hạn và ảnh hưởng của các thông số.
 Cơ chất tối ưu (mỡ heo và tristearin)
 Thời gian tối ưu (3h)

Thời gian phản ứng
(h)
Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %)
POP POS POO SOS SOO
1 23.8 ± 0.7 36.9 ± 1.4 18.3 ± 1.2 12.3 ± 1.1 8.7 ± 1.0
3 23.0 ± 0.4 39.9 ± 1.2 15.8 ± 0.8 13.5 ± 0.5 7.8 ± 0.7

7 24.0 ± 1.1 38.4 ± 1.9 15.6 ± 1.2 14.0 ± 1.8 8.0 ± 1.9
Nguồn dầu Hàm lượng triacylglycerol (w/w, %)
POP POS POO SOS SOO
Thanh phần dầu ban đầu
Dầu cọ 43.4 ± 0.5 6.2 ± 0.3 48.5 ± 0.3 0.0 ± 0.0 1.9 ± 0.1
Mỡ heo 19.0 ± 1.0 31.9 ± 0.6 42.8 ± 2.1 1.9 ± 1.1 4.4 ± 1.0
Mỡ bò 26.1 ± 0.6 22.6 ± 0.5 40.9 ± 0.2 4.0 ± 0.2 6.4 ± 0.3
Sau phản ứng nội chuyển hóa este
Dầu cọ 21.6 ± 0.2 35.1 ± 0.1 20.3 ± 0.0 14.1 ± 0.2 8.9 ± 0.4
Mỡ heo 23.0 ± 0.4 39.9 ± 1.2 15.8 ± 0.8 13.5 ± 0.5 7.8 ± 0.7
Mỡ bò 19.3 ± 0.3 32.7 ± 0.8 18.8 ± 1.2 17.4 ± 0.9 11.8 ± 0.7