Cố định tế bào nấm mem rượu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH
TẾ BÀO NẤM MEN RƯU VANG
SVTH : PHẠM THỊ HỒNG NGA
CBHD: THS.TÔN NỮ MINH NGUYỆT
BỘ MÔN : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Năm học 2006-2007
Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang
Nhận xét của giáo viên hướng dẫn
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
................................
................................
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga
Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang
Mục lục
....................................................................................iii
Lời mở đầu: ................................................................1
Chương I:TỔNG QUAN.............................................1

I.1 Nấm men................................................................................................................................1
I.1.1Đặc điểm hình thái và cấu tạo...............................................................................1
I.1.2Ứng dụng trong công nghiệp.[1, 2] .........................................................................2
I.1.3Tác hại của nấm men.[1, 2].......................................................................................2
I.2 Nấm men rượu vang............................................................................................................3
I.2.1Phân loại........................................................................................................................3
I.2.2Đặc điểm của các loài nấm men rượu vang:[2] .................................................4
I.2.3Trình tự lên men của các giống nấm men trong quá trình lên men vang. .......6
I.2.4Chỉ tiêu chọn lựa nấm men vang..............................................................................7
Bước thứ nhất là bước chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chòu đựng đối với
SO2, các loài có hại, khả năng phát triển tại nhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp. 7
Bước thứ hai là bước chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượng acid dễ bay hơi
và ethanol tạo thành cũng như hàm lượng đường sót còn lại trong rượu vang........7
I.2.5Kết hợp các giống nấm men và sử dụng kỹ thuật di truyền trong sản
xuất rượu vang .....................................................................................................................8
Shinohara và cộng sự (1994) đã nghiên cứu việc chọn lọc và lai giống các
chủng nấm men vang để cải thiện tốc độ lên men, tăng khả năng chòu đựng đối
với SO2 và làm tăng chất lượng rượu vang [33]. ...........................................................9
Serra và cộng sự (2005) đã nghiên cứu việc lai tạo giữa Saccharomyces cerevisiae
và Saccharomyces bayanus var. uvarum để kết hợp ưu điểm của 2 loài này, làm
tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất rượu vang có hàm lượng acid thấp (pH
cao) [32].......................................................................................................................................9
Chương II: CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ
BÀO............................................................................10
II.1 Các phương pháp cố đònh tế bào..............................................................................10
II.1.1Cố đònh trên bề mặt chất mang rắn...................................................................11
Ít hoặc không nguy hiểm đến tế bào. [8].......................................................................11
Đơn giản, dễ thực hiện, nhanh thu được sự cố đònh. [8, 26, 34]..................................11
Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối [26,34].................................................11
Các vật liệu cellulose: DEAE-cellulose, gỗ, mùn cưa, mùn cưa đã tách lignine, …

[20, 26].......................................................................................................................................11
II.1.2Nhốt trong khung mạng xốp (tạo gel)....................................................................11
Có thể đạt được mật độ tế bào trong một đơn vò thể tích chất mang cao hơn so
với canh trường vi sinh vật tự do [26]................................................................................11
Khi tế bào tăng quá nhiều sinh khối sẽ làm giảm độ bền của mạng gel.[20]..12
Polymer tự nhiên [20]:...........................................................................................................12
Polysaccharide: alginates, κ-carrageenan, agar, chitosan và polygalacturonic acid.............12
Polymer khác: gelatin, collagen và polyvinyl alcohol.........................................................12
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - i -
Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang
II.1.3 Keo tụ tế bào (tạo hạt)..........................................................................................12
Đơn giản, dễ thực hiện.......................................................................................................12
Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dòch cho nên các tế bào dễ
bò tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dòch....................................12
II.1.4Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn...........................12
II.2 Yêu cầu về chất mang. [20].........................................................................................13
II.3 Ưu, nhược điểm của tế bào cố đònh.........................................................................13
II.3.1Ưu điểm của tế bào cố đònh hơn tế bào tự do: [20].......................................13
II.3.2Nhược điểm của tế bào cố đònh:........................................................................14
Chương III:CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ
BÀO NẤM MEN RƯU VANG..............................15
III.1 Cố đònh trên bề mặt chất mang rắn........................................................................15
III.1.1Nguyên tắc thực hiện:...........................................................................................15
III.1.2Các chất mang:........................................................................................................15
III.1.2.1Vỏ nho: [25]...........................................................................................................15
III.1.2.2Miếng táo:.............................................................................................................18
III.1.2.3Vật liệu cellulose đã loại lignin (DCM): [5].....................................................22
III.1.2.4Đá kissiris:..............................................................................................................24
III.1.2.5DEAE-cellulose [24]................................................................................................26
III.2 Nhốt trong khung mạng xốp.........................................................................................30

III.2.1Polyvinyl alcohol ........................................................................................................30
III.2.2κ-carrageenan .............................................................................................................40
III.2.3Cố đònh nấm men trong gel alginate......................................................................41
III.2.3.1Alginate....................................................................................................................41
Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau..................................................41
Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau.......................................................41
Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với
nhau. 41
III.2.3.2Cơ chế tạo gel .......................................................................................................42
III.2.3.3Ưu nhược điểm của việc cố đònh nấm men trong gel alginate.....................44
Quá trình cố đònh dễ thực hiện........................................................................................44
Điều kiện cố đònh ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất. Do
đó, các tế bào cố đònh không bò mất hoạt tính..........................................................44
Alginate là chất mang trơ về mặt hóa học.....................................................................44
Alginate không có độc tính, thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm......................44
Độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm......44
Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ lên men cao......................................44
Độ bền gel giảm theo thời gian lên men do:...................................................................44
Gel Ca-alginate rất nhạy với các chất tạo chelate (hợp chất hữu cơ trong đó
nguyên tử tạo thành nhiều hơn một liên kết phối trí với các kim loại trong dung
dòch) như phosphate, citrate và lactate và các chất không tạo gel (non-gelling) như là
các ion sodium và magnesium. Sự có mặt của các ion này trong dung dòch sẽ làm
cho các hạt bò phồng ra, dẫn đến tăng kích thước các lỗ xốp, làm giảm tính ổn
đònh và phá vỡ cấu trúc hạt gel. Thông thường người ta thường thêm vào môi
trường lên men các chất ổn đònh gel như là CaCl2, celite và pectine với một hàm
lượng thích hợp để ổn đònh độ bền gel. Hoặc cũng có thể làm cứng gel bằng
cách sử dụng propylene glycol ester, polyethelenine (PEI) và các loại vật liệu
composite (colloidal silica).......................................................................................................45
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - ii -
Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang

III.2.3.4Ảnh hưởng của thành phần alginate và các điều kiện tạo gel đến độ
bền gel và quá trình lên men..........................................................................................46
Tốc độ lên men có xu hướng tăng, nhưng không đáng kể......................................46
Độ bền gel giảm, vì các ion hóa trò 2 như là calcium, barium, strontium được ưu
tiên liên kết vào block G hơn là block M và block MG. Do đó alginate có hàm
lượng G lớn sẽ tạo thành gel xốp, chắc hơn và vẫn giữ được độ cứng vững
trong một thời gian dài. Trong suốt quá trình tạo liên kết với Ca2+, các loại
alginate này sẽ không bò phồng nở hay co rút, vì thế vẫn giữ được hình dạng tốt
hơn. Thêm vào đó, alginate có hàm lượng G cao sẽ cản trở sự sinh trưởng của
tế bào nấm men sau khi cố đònh. Trái lại, alginate có hàm lượng M cao tạo thành
gel mềm và ít xốp hơn và dễ bò rã ra hơn so với các gel giàu G. Kazuaki và
cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu và kết luận rằng gel alginate giàu G thích
hợp để cố đònh nấm men hơn vì gel này ít gây cản trở đến khả năng khuếch
tán của glucose và có độ bền cơ học cao hơn...............................................................46
III.3 Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn................................48
III.3.1Màng membrane alginat............................................................................................48
III.3.2Màng vi bao sinh học (biocapsule) [28]..................................................................55
III.4 Thiết bò phản ứng membrane.[40]..............................................................................58
Tài liệu tham khảo: ................................................62
65
Mục lục bảng
Bảng I.1 : Các đặc tính mong muốn của nấm men
vang [15]......................................................................8
Bảng III.2: Kết quả kiểm tra mùi và vò của rượu
sản xuất từ tế bào Saccharomyces cerevisiae cố
đònh trên miếng táo trong suốt quá trình lên men
liên tục so sánh với rượu thương mại:[19].............21
Bảng III.3. Một số chế phẩm polyvinyl alcohol
thương mại.................................................................32
Bảng III.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ nhớt

của dung dòch 10% polyvinyl alcohol có phân tử
lượng là 115.000:........................................................34
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - iii -
Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang
Bảng III.5 Ảnh hưởng của nồng độ dung dòch đến
độ nhớt của dung dòch polyvinyl alcohol có phân tử
lượng là 115.000:........................................................34
Bảng III.6 So sánh phương pháp nhốt trong gel và
phương pháp vi bao:..................................................55

Mục lục hình
Hình II.1 : Các kỹ thuật cơ bản để cố đònh tế bào
[20].............................................................................10
Hình III.2 Hi u su t sản xuất cồn ở những nhiệt độệ ấ
lên men khác nhau....................................................17
Hình III.3 Năng suất riêng của việc sản xuất cồn ở
những nhiệt độ khác nhau.......................................17
Hình III.4 Nấm men cố đònh trên miếng táo trong
quá trình lên men rượu............................................20
Hình III.5 Đá kissiris...............................................25
Hình III.6 Công thức cấu tạo của phân tử polyvinyl
alcohol........................................................................30
Hình III.7 Công thức cấu tạo của phân tử
polyvinyl acetate.......................................................31
Hình III.8 Mức độ thuỷ phân của phân tử polyvinyl
alcohol: ......................................................................32
Hình III.9 Khả năng hoà tan phụ thuộc vào mức độ
thuỷ phân và nhiệt độ. .............................................33
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - iv -
Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang

Hình III.10 Cấu trúc của alginate: (a) các monomer
của alginate, .............................................................42
Hình III.11 Cơ chế tạo gel của alginate theo
phương pháp tạo gel từ bên ngoài...........................43
Hình III.12 Cơ chế tạo gel của alginate theo
phương pháp tạo gel từ bên trong ..........................44
Hình III.13. Phương pháp chuẩn bò bao Alg(PEG) 49
Hình III.14 Hệ thống tạo bao cố đònh tế bào.........50
Hình III.15 Ảnh hưởng của thời gian tạo gel lên sự
hình thành bao Alg(PEG). Bao Alg(PEG) được sản
xuất bằng cách dùng dung dòch PEG 6000 20%
(w/w) chứa 2% CaCl2 (w/w)....................................51
Hình III.16. Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 lên bán
kính và bề dày của lớp gel alginate của bao
Alg(PEG). Bao được sản xuất bằng cách dùng dung
dòch PEG 6000 30% (w/w) chứa 2% CaCl2 . .......52
Hình III.17 Sự thay đổi nồng độ PEG và xanthan
gum ............................................................................53
Hình III.18 Lượng bao hình cầu theo chiều cao lổ
hổng trong reactor....................................................54
Hình III.19 Biocapsule và hình ảnh liên kết của
nấm sợi và nấm men.................................................56
Hình III.20 Biểu đồ hoạt động của hệ thống thiết bò
phản ứng sinh học membrane một bình. ...............58
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - v -
Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang
Hình III.21 Biểu đồ hoạt dộng của hệ thống thiết bò
phản ứng sinh học membrane 2 bình. ....................59
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - vi -
Tổng quan tài liệu về các phương pháp cố đònh tế bào nấm men rượu vang

Lời mở đầu:
Như chúng ta đã biết, nấm men là một loài vi sinh vật có nhiều ứng dụng trong
công nghiệp và sản xuất. Một trong những ứng dụng phổ biến của chúng là trong
ngành sản xuất rượu vang, một ngành sản xuất sản phẩm lên men có truyền thống
lâu đời.
Theo các tài liệu cổ, rượu vang có xuất xứ từ các nước Ả Rập vào khoảng thế
kỷ 18 hay 19 trước Công nguyên và cho đến nay, rượu vang đã trở nên phổ biến
khắp nơi trên thế giới. Rượu vang được ưa thích trước hết là do hương vò hết sức
đặc trưng mà không loại sản phẩm nào có thể thay thế, sau đó là do nó đem lại
cảm giác sảng khoái và sức khỏe cho người uống.
Trong thời kì đầu, rượu vang được tạo ra bằng quá trình lên men tự phát với
những loài nấm men có sẵn trong dòch quả. Dần dần, người ta đã biết tiến hành
nuôi cấy các chủng nấm men thuần thiết để thúc đẩy quá trình lên men và tăng
chất lượng của rượu vang. Loài nấm men đóng vai trò chính trong quá trình lên
men cồn sản xuất rượu vang là loài Saccharomyces cerevisiae. Tuy nhiên, việc sử
dụng nấm men tự do để lên men gặp phải một số vấn đề như thời gian lên men dài,
năng suất lên men thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng để tách nấm men ra khỏi rượu
vang sau quá trình lên men, … Để giải quyết các vấn đề này, nhiều nghiên cứu về
việc sử dụng nấm men cố đònh trong sản xuất rượu vang đã được thực hiện. Các
nghiên cứu này đều cho thấy nấm men cố đònh có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với
nấm men tự do như là tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men, ổn
đònh hoạt tính của nấm men, góp phần tăng năng suất lên men, …
Chính vì những lợi ích về kỹ thuật và kinh tế do việc sử dụng nấm men cố đònh
trong sản xuất rượu vang mang lại mà những nghiên cứu về chúng ngày càng được
mở rộng và thu hút sự chú ý nhiều hơn. Các nhà nghiên cứu đã thực hiện việc cố
đònh tế bào bằng nhiều phương pháp khác nhau, sử dụng chất mang như những vật
liệu vô cơ, những polisaccarit hữu cơ với mong muốn tìm kiếm phương thức cố đònh
phù hợp cho quá trình lên men cồn trong sản xuất rượu vang. Cơ sở để đánh giá
liệu kỹ thuật này có thể ứng dụng thành công trong sản xuất công nghiệp hay
không thì phụ thuộc vào khả năng cải thiện năng suất lên men cồn, cải thiện chất

lượng, mùi vò cho sản phẩm. Đồng thời kỹ thuật đó phải đảm bảo sử dụng chất
mang phù hợp với thực phẩm, phong phú trong tự nhiên và hiệu quả về kinh tế.
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 1 -
Chương I: Tổng quan
Chương I: TỔNG QUAN
I.1 Nấm men.
I.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo.
I.1.1.1Đặc điểm hình thái: [2]
Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như là hình cầu, hình ovan
hoặc elip, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy hoặc đôi khi kéo dài ra thành hình
sợi. Nấm men có thể thay đổi hình dáng kích thước trong các giai đoạn phát triển
và điều kiện môi trường xung quanh. Hình thái của chúng không thay đổi chỉ ở các
giống nuôi cấy khi còn trẻ trong các môi trường dinh dưỡng tiêu chuẩn.
So với các vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn) tế bào nấm men có
kích thước tương đối lớn, đường kính khoảng 1 µ, chiều dài 8 µm. Với kích thước
này ta có thể ước tính bề mặt tế bào nấm men trong một lít dòch lên men vào
khoảng 10 m
2
và do vậy cường độ trao đổi chất của tế bào nấm men với môi trường
xung quanh là vô cùng to lớn.
I.1.1.2Cấu tạo tế bào nấm men : [1, 2]
Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống với động thực vật.
So sánh tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hoá nhảy vọt từ nhân sơ đế
nhân chuẩn. Cùng với sự tiến hoá về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có
màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ … ) ở cơ thể nhân chuẩn xuất hiện
nhiều thể không thấy ở thể nhân sơ như ti thể, lục lạp v.v…
Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Trong tế bào có các
cấu tử – tiểu thể và có thể chia thành: các cơ quan nội bào hay cơ quan tử của tế
bào và các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào.
- Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm ( chiếm 25% khối lượng khô

của tế bào). Đa số nấm men có thành tế bào cấu tạo từ glucan và mannan.
Một số nấm men có thành tế bào chứa mannan và kitin. Trong thành tế bào
còn chứa khoảng 10% protein ( tính theo khối lượng khô), trong số protein
này có một phần là các enzim. Trên thành tế bào còn thấy có một lượng nhỏ
lipit.
- Dưới lớp thành tế bào là lớp màng tế bào chất có 3 tầng kết cấu khác
nhau. Cấu tạo chủ yếu là protein (chiếm 50% khối lượng chất khô), phần
còn lại là lipit (40%) và một ít polisaccarit.
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 1 -
Chương I: Tổng quan
- Nhân của tế bào nấm men được bao bọc bởi một màng nhân như ở các
sinh vật có nhân thật khác. Màng nhân của nấm men có cấu trúc 2 lớp và có
rất nhiều lổ thủng. Nhân của tế bào men rượu Saccharomyces cerevisiae có
chứa 17 đôi nhiễm sắc thể. ADN trong tế bào nấm men đơn bội có khối
lượng phân tử là 1x10
10
Da, so với khối lượng phân tử của ADN vi khuẩn
Escherichia coli thì lớn hơn 10 lần nhưng so với ADN của người thì nhỏ hơn
100 lần.
I.1.2 Ứng dụng trong công nghiệp.[1, 2]
Rất nhiều loài nấm men đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất: công nghiệp
sản xuất bia, rượu, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi, và cao nấm men,
lipit nấm men, các enzim như là amylaza, invertyaza, lactaza, uricaza,
poligalacturonaza, sản xuất esgosterol, axit ribonucleic, riboflavin (vitamin B2),
các axit amin như lizin, xixtein, metionin.
- Phần lớn nấm men được sử dụng trong công nghiệp thuộc giống
Saccharomyces trong lớp nấm túi và vài giống thuộc lớp nấm bất toàn.
Giống Endomyces vernalis là một loài nấm men dùng trong thế chiến thứ
nhất để tổng hợp chất béo.
- Giống Saccharomyces, quan trọng nhất là loài Saccharomyces

cerevisiae, được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Một số chủng của
nấm men này dùng làm men nở bánh mì, một số khác dùng trong công
nghiệp rượu, bia, rượu vang, sản xuất glycerin hoặc enzim invertaza.
Saccharomyces fragilis lên men đường lactoza đóng vai trò quan trọng trong
sản xuất sữa và các sản phẩm của sữa. Có lẽ trong tương lai loài người trông
cậy vào giống nấm men này để thu nhận cồn tuyệt đối từ những nguyên liệu
tái tạo được để thay thế xăng khi dầu mỏ ở trái đất bò cạn kiệt.
- Giống Zygosaccharomyces, một vài tác giả coi giống này là giống phụ
của giống Saccharomyces. Zygosaccharomyces nusbarumeri được tìm thấy
trong mật. Các loài này tham gia vào lên men rượu vang và đặc biệt lên men
đậu tương làm thành một thứ đồ uống đặc biệt.
Các giống Pichia, Hasenula, Debaryomyces … cũng như các giống Mycoderma,
Candida … là những nấm men không hình thành màng trên dòch nuôi cấy, phát triển
trên bề mặt các dòch ướp chua dưa chuột và các loại rau quả. Chúng oxy hóa các
chất hữu cơ làm giảm độ chua và làm tăng pH của dòch ướp. Hasenula và Pechia có
thể chòu đựng độ cồn cao và oxy hóa rượu etylic. Debaryomyces có thể chòu được
muối cao, đặc biệt ở phomat có muối tới 24% vẫn thấy men này phát triển. Nấm
men tạo màng không hoặc sản sinh ra ít rượu etylic từ đường.
I.1.3 Tác hại của nấm men.[1, 2]
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 2 -
Chương I: Tổng quan
Bên cạnh các nấm men có ích như đã trình bày ở trên cũng có không ít các
nấm men có hại, chúng gây ra hiện tượng làm hư hỏng thực phẩm tươi sống hoặc
các thực phẩm chế biến. Có khoảng 13-15 loài nấm men có khả năng gây bệnh cho
người và cho động vật chăn nuôi . Đáng chú ý nhất là các loài Candida albicans,
Cryptococus neoformans, Trichosporon cutaneum, Trichosporon Capitatum …
Một số loài thuộc giống Zygosaccharomyces có thể phát triển ở dòch đường
nồng độ cao và làm hỏng mật siro. Giống Saccharomycodes và Hasenula spora có
hình quả chanh cũng như các nấm men giả Kloekera không sinh bào tử có tế bào
hình chùy. Những giống men này làm hỏng rượu, đặc biệt là mất mùi rượu vang.

I.2 Nấm men rượu vang.
Sự chuyển hóa trong sản xuất rượu vang là một quá trình hóa sinh phức tạp. Nó
liên quan đến tương tác giữa nấm men vi khuẩn và những loài vi sinh vật khác.
Trong những loài vi sinh vật này thì nấm men đóng vai trò quan trọng, kiểm soát
quá trình lên men cồn trong sản xuất rượu vang. [7]
Trong thời kì đầu sản suất rượu vang, quá trình lên men tự phát là chính với
nấm men từ 2 nguồn gốc khác nhau: bề mặt trái nho (từ vườn nho) , bề mặt thiết bò
(từ môi trường bên trong nhà máy). Và về sau có thêm một hướng phát triển trong
sản xuất rượu vang là dùng nấm men từ quá trình nuôi cấy. Thành phần và chất
lượng của rượu vang có liên quan chặt chẽ đến quần thể nấm men. Trong quá trình
lên men, bên cạnh các sản phẩm chính là ethanol và CO
2
, nấm men tạo thành
nhiều sản phẩm phụ, ví dụ như glycerin, axit acetic, axit succinic và đặc biệt là các
hợp chất hương, góp phần đáng kể vào chất lượng của rượu vang. [16,18]
I.2.1 Phân loại.
Nấm men có thể được phân thành 2 nhóm:
Thứ nhất gọi là non-Saccharomyces (NS – là những loài nấm men không
thuộc giống Saccharomyces), thường xuất hiện trên bề mặt của trái nho cùng với
nhiều loại vi sinh vật khác. Hầu hết các loài NS không có khả năng tồn tại khi
nồng độ cồn cao hơn 6% v/v (chính vì vậy mà các loài NS thường phát triển ở giai
đoạn đầu của quá trình lên men cồn). Ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis có thể
phát triển trong môi trường có nồng độ cồn lên đến 12%, loài này thích nghi tốt hơn
những loài NS khác, và nó vượt trội hơn những loài khác nhất là vào cuối quá trình
lên men, chúng góp phần chính vào mùi vò của rượu, nhưng sản phẩm phụ của nó,
phenol dễ bay hơi, thì là nguyên nhân gây ra hư hỏng rượu. Trước đây, nấm men
NS được xem là các vi sinh vật gây hư hỏng. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây
cho thấy rằng, một số loài nấm men NS có lợi cho chất lượng rượu vang và góp
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 3 -
Chương I: Tổng quan

phần rõ ràng vào đặc điểm của sản phẩm cuối, giúp tăng cường hương vò của rượu
vang bởi vì khả năng của chúng trong việc sản xuất ra những sản phẩm phụ như là
glycerin, ester, aceton…. [31]
Nhóm khác góp phần vào hương vò rượu vang, cũng là nhân tố chính của quá
trình lên men cồn là các loài thuộc giống Saccharomyces. Saccharomyces có khả
năng chòu đựng sự thay đổi của điều kiện môi trường với nồng độ ethanol và axit
hữu cơ tăng và sự cạn kiệt chất dinh dưỡng (Pretorius, 2000). Như vậy, mặc dù có
nhiều giống và loài nấm men trong dòch nho, nhưng giống Saccharomyces, mà chủ
yếu là loài Saccharomyces cerevisiae mới là loài đảm nhiệm việc thực hiện các quá
trình chuyển hóa sinh học quan trọng trong lên men vang. Chính vì thế,
Saccharomyces cerevisiae còn được gọi là “nấm men vang”. [31]
I.2.2 Đặc điểm của các loài nấm men rượu vang:[2]
Saccharomyces: có bào tử trong nan thường là 1-4 bào tử, có khi tới 8. Tế
bào của chúng có hình dạng khác nhau: hình tròn, ovan, hoặc elip. Sinh sản bằng
lối nảy chồi, sử dụng đường trong quá trình hô hấp và lên men, có trường hợp lên
men ở dòch đường 30% và tạo được 18
o
cồn. Không đồng hóa được muối nitrat.
Giống Sacharomyces có tới 18 loài nhưng chỉ có 7 loài thường gặp trong
nước quả.
Các loài nấm men không sinh bào tử thường gặp trong nước quả và khả năng
lên men hoặc tiêu hao đường trong đó, phổ biến là Kloeckera, Torulopsis. Người ta
thường gọi chúng là men dại.
Sau đây là một số loài nấm men thường gặp trong quả và có vai trò quan
trọng trong nghề làm rượu vang.
o Saccharomyces vini.
 Đây là tên hiện nay dùng phổ biến, trước đây người ta gọi là
Saccharomyces vini Meyer hay là Saccharomyces ellipsoideus theo Lodder là
Saccharomyces cerevisea Hansen.
 Nấm men này phổ biến trong quá trình lên men nước quả chiếm

đến 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên men. Khả năng
kết lắng của nó phụ thuộc vào từng nòi: các tế bào dạng bụi hoặc dạng bông.
Nguồn dinh dưỡng cacbon của loài này là đường, sồn, và axit hữu cơ, những tác
nhân sinh trưởng là axit pantotenic, biotin, mezoinit, tiamin, và piridoxin.
 Đa số tế bào của loài này hình ovan có kích thước (3 - 8) x (5
-12) µm, sinh sản theo lối nảy chồi và tạo thành bào tử Saccharomyces vini sinh ra
enzim invertaza có khả năng khử đường saccaroza thành fructoza và glucoza, vì
vậy trong lên men ta có thể bổ sung loại đường này vào dung dòch quả và hàm
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 4 -
Chương I: Tổng quan
lượng rượu tạo thành bình thường đối với nhiều nòi của men và chỉ đạt được 8-10
% so với thể tích.
 Ở giai đoạn cuối quá trình lên men Saccharomyces vini kết lắng
nhanh và làm trong dòch rượu.
 Các nòi của giống này có đặc tính riêng về khả năng tạo cồn,
chòu sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp tạo ra cho vang
mùi vò đặc trưng riêng biệt.
 Giai đoạn cuối cùng của quá trình lên men các tế bào
Saccharomyces vini thường bò già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bò
chết rất nhanh.
o Saccharomyces uvarum.
 Men này được tách từ nước nho, rượu và nước quả phúc bồn tử
lên men tự nhiên. Về hình thái nó không khác với các loài khác. Khả năng sinh
bào tử khá mạnh trên môi trường thạch – malt. Các nòi của loài này có thể lên men
12-13
o
cồn trong dung dòch nước nho. Một vài nòi được dùng trong sản xuất rượu
vang.
o Saccharomyces chevalieri.
 Theo Lodder là Saccharomyces chevalieri Guiliermond.

 Nấm men này được tách từ nước nho lên men tự nhiên, từ vang
non được gây men nước dừa hoặc nước cọ.
 Saccharomyces chevalieri thuần chủng lên men nước nho có thể
tạo 16
o
cồn. Nó thường lẫn với Saccharomyces vini.
o Saccharomyces ovifomis.
 Theo Lodder là Saccharomyces Beuanes saccado.
 Được tách ra từ nước nho tự lên men, nhưng loại nấm men này ít
hơn Saccharomyces vini. Giống thuần chủng phát triển tốt trong nước nho và các
nước quả khác , có khả năng chòu được đường cao, lên men kiệt đường và tạo thành
18
o
cồn. Các yếu tố sinh trưởng của loại này giống như Saccharomyces vini và có
khả năng chòu được lượng cồn cao. Dùng các nòi thuần chủng của giống này để lên
men dòch quả có hàm lượng đường cao để chế vang khô cho kết quả tốt. Có hình
dàng giống như Saccharomyces vini và có thể tạo thành 18% rượu trong quà trình
lên men, giống này tạo thành màng trên dòch quả. Saccharomyces ovifomis lên men
được glucoza, fructoza, manoza, sacaroza, maltoza, và 1/3 rafinoza, không lên men
được lactoza, pentoza. Điều káhc nhau cơ bản của Saccharomyces ovifomis với
Saccharomyces vini là Saccharomyces ovifomis không lên men được galactoza và
men nổi lên mặt dòch lên men tạo thành màng.
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 5 -
Chương I: Tổng quan
 Hai giống men rượu vang này (Saccharomyces vini và
Saccharomyces ovifomis) có nhiều nòi được dùng trong sản xuất. Nói chung, nhiều
nòi men rượu quả có khoảng nhiệt độ thích hợp là 18-25
o
C , ở 35
o

C sinh sản của
chúng bò ức chế, ở 40
o
C sinh sản bò nhừng hoàn toàn, ở nhiệt độ thấp hơn 16
o
C sinh
sản và lên men bò kéo dài. Các điều kiện hóa – lý , thành phần và chất lượng dòch
quả, cũng như pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sống của nấm
men.
o Hanseniaspora apiculate- Kloeskera apiculata.
 Kích thước tương đối nhỏ có hình ovan, elip, hoặc hình quả
chanh, tế bào có một đầu nhỏ ngưới ta thường gọi là men hình chùy. Sinh sản bằng
nảy chồi, rất phổ biến ở vỏ quả và nhiễm vào nước quả chiếm tới 90% tổng số men
khi bắt đầu lên men. Nó có thể lên men tạo thành 6-7
o
cồn, nhưng tạo thành một
loạt các axit bay hơi cũng giống như các ester của chúng làm cho dòch có mùi tạp
và nó còn kiềm hãm các loài nấm men chính trong lên men, Kloeskera apiculata
nhạy cảm với SO
2
.
 Trong nghề làm rượu vang người ta không mong muốn loại men
này phát triển, nếu có thì chỉ cần trong trong giai đoạn đầu tạo được 3-4
o
cồn.
 Qua phân tích hệ vi sinh vật trong quá trình lên men tự nhiên
cũng gợi mở cho chúng ta ý thúc được khi dùng nấm men thuần chủng để lên men
nước quả không nên dùng một chủng đơn độc mà cần phối hợp với những chủng
chòu được cồn cao để lên men tiếp theo. [2]
I.2.3 Trình tự lên men của các giống nấm men trong quá trình

lên men vang.
Quá trình lên men rượu vang có thể được tiến hành một cách tự nhiên mà
không cần cấy giống hoặc bằng cách cấy vào dòch nho các nấm men vang chọn lọc.
Trong nước nho tươi có những nhóm vi sinh vật khác nhau rơi từ môi trường xung
quanh , chủ yếu ờ vỏ quả, thân, cuống và thiết bò. Trong đó nấm men chiếm 9-
22%.[2]
Việc lên men dòch nho được thực hiện bởi một hệ vi sinh vật phức tạp, trong đó
các chủng nấm men phát triển và chết tùy theo sự thích nghi của chúng đối với môi
trường. Tương tác nấm men-nấm men xảy ra trong suốt quá trình sản xuất rượu
vang ngay từ khi bắt đầu quá trình lên men cồn. Trong quá trình lên men tự nhiên,
sự lên men nước quả được thực hiện bởi sự nối tiếp của những quần thể nấm men
khác nhau. Những giai đoạn đầu của quá trình lên men nói chung trội hơn hẳn là
loài nấm men đầu nhọn thuộc về giống (genus) Hanseniaspora và cũng bởi những
loài nấm men khác như là Candida stellata và Metschinikowia pulcherrima.. Theo
dõi quá trình lên men ở nhiều nơi một cách tự nhiên thấy rằng một vài ngày đầu
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 6 -
Chương I: Tổng quan
các men dại hình thoi đầu nhỏ hoặc hình chùy (Kloeskera) chiếm ưu thế (70-80%
trong tổng số nấm men). Ít phổ biến hơn là những loài thuộc giống Pichia và
Kluyveromyces cũng được tìm thấy. Các nấm men này chết dần khi hàm lượng cồn
tăng, chỉ còn lại Saccharomyces cerevisiae có khả năng chòu được hàm lượng cồn
cao tiếp tục quá trình lên men cho đến khi kết thúc. Theo nghiên cứu của Xufre và
cộng sự Saccharomyces phát triển hơn non-Saccharomyces chỉ sau khi nồng độ
ethanol tiến đến khoảng 4-5%(v/v). Sự chuyển biến này rất quan trọng vì các
chủng non-Saccharomyces thường tạo ra các hợp chất không mong muốn như rượu
bậc cao, acid acetic và acetaldehyde. Bên cạnh đó, chúng cũng được trích dẫn là
ảnh hưởng quan trọng đến mùi vò và chất lượng của của rượu vang và những tác
động của loài này lên sản phẩm cuối vẫn còn là vấn đề gây tranh cãi. Theo nhiều
tác giả thì khi có các loài nấm men non-Saccharomyces phát triển trong rượu vang
với một mức độ vừa phải, hương vò của rượu vang sẽ phong phú hơn và được ưa

thích nhiều hơn so với rượu vang chỉ được lên men từ giống Saccharomyces. Sự
biến mất hoặc giảm mật độ của giống non-Saccharomyces có thể là do khả năng
chòu đựng cồn thấp, hoặc bò ức chế bởi các chất diệt men (acid béo mạch ngắn và
trung bình, glycoprotein,…) hoặc do hàm lượng oxy và nitrogen còn lại thấp. Các
quá trình lên men có kiểm soát thường được thực hiện bằng cách cấy canh trường
Saccharomyces cerevisiae thuần khiết, nhờ đó quá trình lên men diễn ra nhanh hơn
và có thể tạo ra rượu vang với hương vò đặc trưng. [16,17,18]
I.2.4 Chỉ tiêu chọn lựa nấm men vang
Nấm men được lựa chọn đương nhiên là phải có đặc tính kỹ thuật phù hợp
với sản xuất rượu vang. Sự đa dạng của đặc tính không chỉ phụ thuộc vào loại rượu
mà còn phụ thuộc vào quan điểm khác nhau của những nhà chuyên môn.
Ngoài vai trò quan trọng của nấm men vang là xúc tác việc chuyển hóa
hoàn toàn và có hiệu quả đường thành cồn mà không tạo ra các hương vò không
mong muốn thì ngày nay, do yêu cầu ngày càng cao, canh trường Saccharomyces
cerevisiae cần phải có nhiều đặc tính khác, như liệt kê trong bảng 1.1 [15]. Tuy
nhiên, để có thể kiểm tra hết tất cả các chỉ tiêu này thì tốn rất nhiều thời gian.
Regodon và cộng sự (1997) đã đưa ra một phương pháp đơn giản và hiệu quả để
chọn lựa nấm men vang dùng trong sản xuất công nghiệp dựa trên các tính chất
công nghệ của nấm men vang. Phương pháp này chỉ bao gồm 2 bước [30]:
− Bước thứ nhất là bước chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chòu đựng đối với
SO
2
, các loài có hại, khả năng phát triển tại nhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp.
− Bước thứ hai là bước chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượng acid dễ bay hơi
và ethanol tạo thành cũng như hàm lượng đường sót còn lại trong rượu vang.
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 7 -
Chương I: Tổng quan
Bảng I.1 : Các đặc tính mong muốn của nấm men vang [15]
Đặc tính lên men
Thích nghi với quá trình lên men nhanh

Tốc độ sử dụng cơ chất và tốc độ hình
thành sản phẩm cao
Khả năng chòu cồn cao
Khả năng chòu áp suất thẩm thấu cao
Sinh khối tạo thành vừa phải
Các tính chất về hương vò
Tạo thành ít sulphite/DMS/thiol
Tạo thành ít acid dễ bay hơi
Tạo thành ít rượu bậc cao
Giải phóng ra các tiền chất hương
glycosylate
Hoạt tính esterase thấp
Đặc tính công nghệ
Tính ổn đònh cao về mặt di truyền
Khả năng chòu sulphite cao
Ít liên kết với sulphite
Ít tạo bọt
Có khả năng kết bông
Kết lắng cặn nhanh
Nhu cầu nitơ thấp
Các đặc tính trao đổi chất có liên quan
đến sức khỏe con người
Tạo thành ít sulphite
Tạo thành ít biogenic amine
Tạo thành ít ethyl carbamate (urea)
I.2.5 Kết hợp các giống nấm men và sử dụng kỹ thuật di truyền
trong sản xuất rượu vang
Theo nghiên cứu của Renouf và cộng sự (2006), việc quan sát sự tương tác giữa
Saccharomyces cerevisiae và Brettanomyces bruxellensis và những loài nấm men
khác đă xác đònh mặc dù Saccharomyces cerevisiae là tác nhân chính trong quá

trình lên men cồn trong sản xuất rượu vang nhưng Brettanomyces bruxellensis có
khả năng chuyển hóa glucoza và fructoza thành ethanol và chòu được hàm lượng
cồn cao. Trong môi trường sử dụng kết hợp Saccharomyces cerevisiae và
Brettanomyces bruxellensis, thời gian cần thiết để tiêu thụ toàn bộ lượng đường
ngắn hơn là trong môi trường chỉ có Saccharomyces cerevisiae. Sự trao đổi chất của
Saccharomyces cerevisiae và Brettanomyces bruxellensis bổ sung cho nhau và giảm
thời gian tổng cộng lên men đường. Sự kết hợp giữa Saccharomyces cerevisiae và
Metschnikowia pulcherrima làm tăng tốc độ lên men và cải thiện về mùi vò. Còn
kết hợp giữa Saccharomyces cerevisiae và Candida stellata sẽ làm tăng hàm lượng
glycerin, tăng tốc độ lên men và chất lượng rượu vang.[11,12,13,31]
Trong những năm gần đây, kỹ thuật di truyền đã được ứng dụng để cải thiện
các đặc tính của nấm men vang:
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 8 -
Chương I: Tổng quan
− Shinohara và cộng sự (1994) đã nghiên cứu việc chọn lọc và lai giống các
chủng nấm men vang để cải thiện tốc độ lên men, tăng khả năng chòu đựng
đối với SO
2
và làm tăng chất lượng rượu vang [33].
− Serra và cộng sự (2005) đã nghiên cứu việc lai tạo giữa Saccharomyces
cerevisiae và Saccharomyces bayanus var. uvarum để kết hợp ưu điểm của 2
loài này, làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất rượu vang có hàm
lượng acid thấp (pH cao) [32].
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 9 -
Chương II: Các phương pháp cố đònh tế bào
Chương II: CÁC PHƯƠNG
PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO
II.1 Các phương pháp cố đònh tế bào.
Khái niệm: Kỹ thuật cố đònh tế bào được đònh nghóa là: “Kỹ thuật bao bọc
hoặc đònh vò các tế bào còn nguyên vẹn lên một “vùng không gian nhất đònh”

nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn” (Karel và cộng sự, 1985) [20].
Cố đònh thường là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên do các tế
bào có thể phát triển trên bề mặt hoặc bên trong các cấu trúc của nguyên liệu có
trong tự nhiên. Nhiều vi sinh vật tự nó có khả năng gắn lên trên những bề mặt khác
nhau trong tự nhiên.
Nhiều quá trình trong công nghệ sinh học thuận lợi hơn nhờ kỹ thuật cố đònh,
do đó mà nhiều kỹ thuật và chất mang được đưa ra. Những kỹ thuật này có thể chia
thành 4 nhóm chính như là cố đònh trên bề mặt chất mang rắn, nhốt trong khung
mạng xốp, keo tụ tế bào (tạo hạt), nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một
màng chắn. [20].
Hình
II.1 : Các
kỹ thuật
cơ bản để
cố đònh tế
bào [20]
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 10 -
Chương II: Các phương pháp cố đònh tế bào
II.1.1Cố đònh trên bề mặt chất mang rắn.
II.1.1.1 Nguyên tắc
Đây là phương pháp cố đònh dựa vào tương tác bề mặt giữa tế bào và chất
mang. Các lực liên kết như là lực hấp phụ vật lý, liên kết tónh điện (như lực Van
der Waal, liên kết ion, tương tác ưa nước), hoặc liên kết cộng hóa trò. Những lực
liên kết này yếu nhưng đủ lớn về số lượng để có thể liên kết hợp lý. [8, 20, 34].
II.1.1.2 Ưu điểm
Ít hoặc không nguy hiểm đến tế bào. [8]
Đơn giản, dễ thực hiện, nhanh thu được sự cố đònh. [8, 26, 34].
Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối [26,34].
Diện tích tiếp xúc giữa tế bào cố đònh và chất mang lớn hơn so với các kỹ
thuật khác [26].

Có thể phục hồi trở lại tế bào tự do. [8]
II.1.1.3 Nhược điểm
Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dòch cho nên các tế bào dễ
bò tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dòch [8,20]
Nếu điều chỉnh không cẩn thận, sự quá tải trên bề mặt chất mang có thể dẫn
đến làm giảm hoạt tính xúc tác. [8]
Sự thiếu không gian phù hợp giữa tế bào và chất mang có thể sản sinh ra
vấn đề liên quan đến sự cản trở không gian.[8]
II.1.1.4 Chất mang
Các vật liệu cellulose: DEAE-cellulose, gỗ, mùn cưa, mùn cưa đã tách
lignine, … [20, 26]
Các vật liệu vô cơ: polygorskite, montmorilonite, hydromica, sứ xốp, thủy
tinh xốp, vòng Raschig, silicate, hợp chất titanium, … [20, 26]
II.1.2Nhốt trong khung mạng xốp (tạo gel).
II.1.2.1 Nguyên tắc
Đưa tế bào vào bên trong một mạng đủ chặt để ngăn cản tế bào khuếch tán
vào môi trường xung quanh, trong khi vẫn cho phép sự vận chuyển tự do của các
chất dinh dưỡng và sự trao đổi chất diễn ra [8, 20].
II.1.2.2 Ưu điểm
Có thể đạt được mật độ tế bào trong một đơn vò thể tích chất mang cao hơn
so với canh trường vi sinh vật tự do [26].
Chất mang có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại thực khuẩn hoặc tế bào
ngoại lại cũng như những điều kiện gây stress [26].
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 11 -
Chương II: Các phương pháp cố đònh tế bào
II.1.2.3 Nhược điểm
Khi tế bào tăng quá nhiều sinh khối sẽ làm giảm độ bền của mạng gel.[20]
Tế bào trên bề mặt tăng lên nhiều lần và dễ thoát ra khỏi mạng gel và phát
triển trong môi trường như là các tế bào tự do [20].
II.1.2.4 Chất mang

Polymer tự nhiên [20]:
- Polysaccharide: alginates, κ-carrageenan, agar, chitosan và
polygalacturonic acid.
- Polymer khác: gelatin, collagen và polyvinyl alcohol.
Polymer tổng hợp: polyacrylamide, polyurethane và polyvinyl chloride [26].
II.1.3 Keo tụ tế bào (tạo hạt).
II.1.3.1 Nguyên tắc
Sự tập hợp tế bào gia tăng kích thước của khối tế bào hoặc tạo huyền phù tế
bào gắn thành cụm và lắng xuống để dễ dàng sử dụng trong các bình phản ứng. Có
thể là keo tụ tự nhiên hoặc là keo tụ nhân tạo bằng cách tạo thành các liên kết
ngang [20].
II.1.3.2 Ưu điểm
Đơn giản, dễ thực hiện.
Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối.
II.1.3.3 Nhược điểm
Do không có màng chắn giữa các tế bào và dung dòch cho nên các tế bào dễ
bò tách ra, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong dung dòch.
II.1.4Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn.
II.1.4.1 Nguyên tắc
Phương pháp này có thể được thực hiện theo 2 cách sử dụng màng
membrane vi xốp, sử dụng màng vi bao. Phương pháp này giống với phương pháp
nhốt trong khung mạng xốp ở chổ tế bào tự do trong dung dòch, nhưng không gian
bên trong là trống.[20, 21]
II.1.4.2 Ưu điểm
Canh trường lên men không bò lẫn tế bào, do đó sản phẩm tạo thành có thể
không cần lọc [20, 26].
II.1.4.3 Nhược điểm
Khả năng truyền khối kém [20].
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 12 -
Chương II: Các phương pháp cố đònh tế bào

Màng membrane có thể bò bám bẩn do sự hấp phụ cơ chất lên bề mặt màng
[20].
II.1.4.4 Chất mang
Membrane làm bằng vật liệu cellulose acetate, cellulose nitrat, polyamide
[20, 26].
II.2 Yêu cầu về chất mang. [20]
o Chất mang phải có bề mặt lớn với nhóm chức năng để tế bào có thể
gắn vào.
o Chất mang phải dễ điều khiển và tái sinh.
o Với chất mang đó thì khả năng sống của tế bào và khả năng hoạt động
ổn đònh của chất xúc tác sinh học phải cao và giữ được trong thời gian dài.
o Hoạt động của vi sinh vật được cố đònh phải không bò ảnh hưởng bất lợi
bởi quá trình cố đònh.
o Độ xốp của chất mang phải đồng đều và có thể kiểm soát, cho phép sự
trao đổi tự do của cơ chất, sản phẩm, cofactor, chất khí.
o Chất mang phải có tính ổn đònh cơ học, hóa học, nhiệt, sinh học và
không dễ dàng bò giảm giá trò bởi enzim, dung môi, sự thay đổi áp suất hoặc lực
uốn cắt.
o Chất mang và kỹ thuật cố đònh phải dễ thực hiện, và hiệu quả về kinh
tế.
o Chất mang phải thuộc loại thuần khiết tiêu chuẩn thực phẩm, không
ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm bởi việc còn lại những phần cặn và dễ dàng
được chấp nhận bởi người tiêu dùng.
II.3 Ưu, nhược điểm của tế bào cố đònh.
II.3.1Ưu điểm của tế bào cố đònh hơn tế bào tự do: [20]
o Hoạt động kéo dài và sự ổn đònh của chất xúc tác sinh học, chất mang
có thể đóng vai trò như một chất bảo vệ chống lại ảnh hưởng hóa lý của nhiệt độ,
pH, dung môi, hoặc thậm chí là kim loại nặng.
o Mật độ tế bào trên một đơn vò thể tích của thiết bò phản ứng sinh học
cao hơn, thời gian phản ứng ngắn hơn và sự loại bỏ sự tăng trưởng của những tế

bào vi sinh vật không có lợi.
o Sự hấp thu cơ chất tăng và năng suất được cải thiện.
o Có thể thực hiện được với quá trình liên tục.
o Khả năng chòu đựng được nồng độ cơ chất cao tăng, và giảm sự ức chế
của sản phẩm cuối.
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 13 -
Chương II: Các phương pháp cố đònh tế bào
o Với quá trình lên men, có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp dẫn đến cải
thiện chất lượng cho một số sản phẩm.
o Hoàn thiện sản phẩm dễ dàng hơn do giảm được thủ tục tách chiết và
lọc, do đó giảm giá thành cho thiết bò và yêu cầu về năng lượng.
o Sự tái sinh và tái sử dụng chất xúc tác sinh học cho nhiều thời của sự
vận hành gián đoạn mà không phải tháo bỏ nó ra khỏi thiết bò phản ứng sinh học.
o Giảm rủi ro nhiễm vi sinh vật có hại bởi vì mật độ tế bào cao.
o Có thể sử dụng thiết bò phản ứng sinh học nhỏ hơn, với sự thiết kế quá
trình sông nghệ đơn giản hóa và do đó giảm chi phí vốn.
o Giảm thời gian sản xuất ra sản phẩm.
II.3.2Nhược điểm của tế bào cố đònh:
o Khi sử dụng tế bào vi sinh vật cố đònh, trong môi trường sản xuất, hiện
tượng rò rỉ hay rửa trôi tế bào ra khỏi chất mang ít hay nhiều là điều không thể
tránh khỏi. Do đó, việc thu nhận và tinh sạch sản phẩm đôi khi cũng khá phức tạp.
o Tế bào cố đònh đòi hỏi nhiều nguồn dinh dưỡng và năng lượng đa dạng
đảm bảo khả năng phát triển và hoạt động bình thường. Khi đó, trong hệ thống sử
dụng tế bào cố đònh có thể xảy ra hiện tượng phân huỷ sản phẩm để cung cấp đầy
đủ chất dinh dưỡng và năng lượng cần thiết cho tế bào. Vì thế mà hiệu suất sử
dụng tế bào cố đònh có thể thấp hơn hiệu suất sử dụng tế bào tự do.
o Do được bao bọc bởi chất mang, thành tế bào, màng tế bào chất, … có
thể gây cản trở việc thẩm thấu cơ chất, sản phẩm và các cấu tử từ môi trường ra
vào tế bào.
o Một nhược điểm thường thấy ở những tế bào vi sinh vật được “gói”

trong khuôn có cấu trúc gel, những cơ chất có kích thước phân tử lớn sẽ không có
điều kiện tiếp xúc với tế bào vi sinh vật cố đònh. Vì thế mà hoạt lực của những tế
bào cố đònh có thể sẽ thấp hơn so với những tế bào tự do.
o Trong trường hợp cụ thể khi sản xuất ethanol, người ta không quan tâm
đến sự ức chế của ethanol lên hoạt động sống của nấm men khi tiến hành lên men
gián đoạn, khi đó nấm men chỉ được sử dụng một lần rồi được hoạt hoá lại cho lần
sản xuất tiếp theo. Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng của ethanol đến hoạt động của
nấm men là rất lớn trong quá trình lên men liên tục. Sau khi lên men, hoạt tính của
tế bào nấm men có thể bò ức chế bởi ethanol. Tương tự như vậy, khi sử dụng
phương pháp cố đònh nấm men để sản xuất ethanol liên tục, hoạt tính của nấm men
cố đònh cần được duy trì và nồng độ ethanol phải thấp để không gây ức chế đến tế
bào nấm men. Như thế thì hiệu suất thu nhận sản phẩm không cao. Nhiều phương
pháp tháo sản phẩm liên tục khỏi thiết bò lên men được nghiên cứu nhằm tránh
những tác động không tốt của sản phẩm lên men đối với nấm men.
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 14 -
Tài liệu tham khảo
Chương III: CÁC PHƯƠNG
PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM
MEN RƯU VANG
III.1 Cố đònh trên bề mặt chất mang rắn.
III.1.1 Nguyên tắc thực hiện:
Phương pháp cố đònh trên bề mặt chất mang rắn bao gồm việc trộn tế bào
cần cố đònh và các chất mang có tính chất hấp phụ lại với nhau dưới điều kiện phù
hợp của pH, lực ion v.v… , để hỗn hợp lên men một khoảng thời gian , tiếp theo là
tập hợp chúng lại và đem đi rửa để loại bỏ những thành phần không liên kết. [8]
Có thể thực hiện việc cố đònh tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang rắn
như sau [38]:
• Phương pháp cổ điển: phương pháp ngâm chất mang trong dung dòch
huyền phù vi sinh vật. Vi sinh vật sẽ tự động kết lắng và liên kết với chất mang
bằng cách hấp phụ trên chất mang đó.

• Phương pháp cổ điển có cải tiến bằng cách sử dụng cánh khuấy: tế bào
vi sinh vật và chất mang phân bố đều khắp trong dung dòch. Diện tích tiếp xúc
giữa chất mang và vi sinh vật là cực đại, do đó hiệu suất gắn tế bào lên chất
mang được cải thiện đáng kể.
• Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật qua cột chứa chất mang: cần
có hồi lưu dòng canh trường để nâng cao hiệu suất gắn tế bào vào chất mang.
III.1.2 Các chất mang:
Người ta đặc biệt quan tâm đến việc sử dụng tế bào cố đònh trong quá trình
lên men cồn. Việc lựa chọn chất mang phù hợp để hấp phụ tế bào là một việc khó,
bởi vì tương tác của tế bào và chất mang bò ảnh hưởng bởi một lượng những nhân
tố (như bản chất của chất mang và tế bào vi sinh vật, điều kiện môi trường) [26]
III.1.2.1 Vỏ nho: [25]
Vỏ nho được dùng làm chất mang để cố đònh tế bào nấm men
Saccharomyces cerevisiae trong sản xuất rượu vang. Tế bào cố đònh này được dùng
lên men ở các mẻ nối tiếp nhau và hiệu suất được cải thiện hơn khi so sánh với tế
bào tự do.
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 15 -
Tài liệu tham khảo
a. Giới thiệu về chất mang:
Vỏ nho được sử dụng bởi vì chúng là phụ phẩm của công nghệ sản xuất rượu
vang nho, và nó có thể cấu thành một chất mang tự nhiên , độ sạch theo tiêu chuẩn
thực phẩm, rẻ và phong phú dùng để cố đònh tế bào.
b. Phương pháp cố đònh nấm men trên vỏ nho:
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 chòu cồn, chòu lạnh cho
tăng trưởng trong môi trường bán tổng hợp chứa 20 g glucose/L, 4g chất chiết nấm
men/l, 1g (NH
4
)
2
SO

4
/L, 1g KH
2
PO
4
/L and 5 g MgSO
4
.7H
2
O/L, và môi trường được
SVTH: Phạm Thò Hồng Nga - 16 -
Môi trường bán
tổng hợp
Tiệt trùng
Nuôi cấy
Nấm men
Ly tâm
Phối trộn
Vỏ nho
Tiệt trùng
Môi
trường
Nấm men cố đònh
trên vỏ nho
Rửa
Lên men