Phát hiện một số gen độc lực của E.Coli phân lập được từ phân và thịt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex-PRC

Download» Agriviet.com

1

Chương 1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế nhất
trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều
kiện thích hợp, một số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên
nhân quan trọng gây tiêu chảy trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non (tiêu
chảy trên bê nghé, tiêu chảy phân trắng ở heo con theo mẹ, tiêu chảy phù thủng
trên heo cai sữa).
E. coli được thải qua phân ra môi trường bên ngoài. Nếu qui trình vệ sinh
kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thòt tươi, đặc biệt là trong quá trình giết mổ. Từ
đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không thích hợp thì ngộ độc thực
phẩm do E. coli hoàn toàn có thể xảy ra. Trong số các tác nhân gây tiêu chảy ở
người thì E. coli luôn là tác nhân phổ biến nhất ở những nước công nghiệp phát
triển lẫn những nước đang phát triển. Do đó E. coli được xem là vi khuẩn chỉ danh
ô nhiễm thực phẩm và nước được đánh giá dựa trên số lượng của chúng.
Dựa trên đặc điểm gây bệnh,
E. coli
được chia thành nhiều nhóm. Mỗi
nhóm đều có những yếu tố độc lực khác nhau được qui đònh bởi những gen độc
lực. Một số gen độc lực quan trọng của E. coli gồm: gen stx1, stx2, stx2e, hly của
nhóm STEC (Shiga toxin-producing E. coli); gen eae của nhóm STEC và EPEC
(Enteropathogenic E. coli); gen sta, stb, lt-I của nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.
coli )…
E. coli
là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có mặt trong
thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E. coli trong phân để tìm nguyên

nhân gây bệnh hay xác đònh được số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn
không phản ánh được khả năng gây độc của chúng. Do vậy việc xác đònh các gen
Download» Agriviet.com

2
độc lực của E. coli là một bước rất cần thiết phục vụ cho việc đánh giá nguy cơ
gây bệnh trên vật nuôi và con người. Các kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là
kỹ thuật PCR thường được áp dụng để phát hiện các gen độc lực này.
Cho đến nay, ở Việt Nam việc xác đònh E. coli là nguyên nhân gây bệnh
thường chỉ thực hiện bằng kỹ thuật phân lập và xác đònh các đặc tính sinh hóa, và
theo Tiêu chuẩn Việt Nam, đánh giá tình trạng vệ sinh thực phẩm hiện chỉ dừng
lại ở mức độ xác đònh số lượng vi khuẩn, việc phát hiện những gen độc lực của vi
khuẩn chưa được quan tâm. Hơn nữa việc ứng dụng kỹ thuật multiplex - PCR để
phát hiện đồng thời các yếu tố độc lực của E. coli chưa được thực hiện ở Việt
Nam. Với mục tiêu phát hiện một số gen độc lực mã hóa các protein gây độc của
E. coli phân lập được từ phân và thòt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex – PCR, được
sự hướng dẫn của Thầy Nguyễn Ngọc Tuân, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Phát hiện một số gen độc lực của
E. coli
phân lập được từ phân và thòt bò,
heo bằng kỹ thuật multiplex - PCR”.
Bước đầu áp dụng kỹ thuật này, chúng tôi lần lượt thực hiện khảo sát trên
các nhóm đối tượng mẫu phân tiêu chảy, phân bình thường, và thòt tươi. Đề tài hy
vọng trở thành cơ sở để áp dụng kỹ thuật multiplex – PCR trong việc phát hiện
các gen độc lực của vi khuẩn E. coli trong chẩn đoán bệnh và đánh giá tình trạng
vệ sinh thực phẩm.
Yêu cầu:
- E. coli được phân lập đònh lượng theo qui trình của FAO (1992) và phân
lập đònh tính bằng môi trường chọn lọc MacConkey đối với mẫu phân hoặc bằng
môi trường tăng sinh chọn lọc CT-SMAC (Sorbitol MacConkey với kháng sinh

cefixime và tellurite potassium) đối với mẫu thòt.
- Ly trích DNA từ vi khuẩn E. coli phân lập được;
- Phát hiện một số gen độc lực (eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I) của
E. coli phân lập được bằng kỹ thuật mutiplex - PCR.
Download» Agriviet.com

3

Chương 2
TỔNG QUAN

2.1 Vi khuẩn E. coli
2.1.1 Đònh nghóa
Vi khuẩn Escherichia coli được phân lập và mô tả đầu tiên vào năm 1885
bởi nhà nghiên cứu người Đức Theodor Escherich.
Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn E. coli thuộc họ
Enterobacteriaceae, giống Escherichia.
E. coli là trực khuẩn Gram âm, di động, kích thước khoảng 2 – 3 x 0,5 μm,
không hình thành bào tử và có giáp mô. E. coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu
thế trong ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ở
ruột già.
2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
E. coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp là
35 - 37
0
C, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu nhất là 7,2 – 7,4).
Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ E. coli làm đục nhẹ môi trường, càng
để lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi
trường.
E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành

những khuẩn lạc dạng S màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước
khoảng 2 – 3 mm.
Trên môi trường thạch EMB: E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim.
Trên môi trường thạch MacConkey: E. coli cho khuẩn lạc đỏ hồng.
Trên môi trường thạch nghiêng TSI: E. coli tạo acid / acid (vàng / vàng).
Download» Agriviet.com

4
Để phân biệt E. coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng thử
nghiệm IMVC. E. coli cho kết quả IMVC là +
+

−

−
(biotype 1) hoặc
−
+
−

−

(biotype 2).
2.1.3 Yếu tố kháng nguyên
E. coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp. Trước kia, kỹ thuật xác đònh
kháng nguyên bề mặt là phương tiện chính để phân biệt các dòng E. coli gây
bệnh. Năm 1947, Kauffmann đưa ra hệ thống phân nhóm serotype mà vẫn còn
được sử dụng đến ngày nay. Hệ thống phân nhóm này dựa vào việc xác đònh
kháng nguyên bề mặt O, H, K.
* Kháng nguyên thân O (somatic antigen): có bản chất là

lipopolysaccharide của màng ngoài tế bào, bền với nhiệt và cồn. Khi đun nóng ở
100
0
C trong 2 giờ vẫn giữ được tính kháng nguyên. Kháng nguyên O có thể được
phát hiện bằng phản ứng ngưng kết. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất đònh đối
với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng
loài vật chủ. Kháng nguyên O tạo nền tảng cho việc phân loại serogroup của E.
coli. Có hơn 170 serogroup kháng nguyên O. Trong mỗi serogroup có 1 hay nhiều
serotype được phân loại dựa vào kháng nguyên lông H.
* Kháng nguyên lông H (flagellar antigen):
có bản chất là protein, tạo nên
khả năng di động của E. coli, kém chòu nhiệt. Có khoảng 56 type kháng nguyên H.
* Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): Kháng nguyên K lúc đầu
được xác đònh bằng phản ứng ngưng kết. Người ta xác đònh có sự hiện diện của
kháng nguyên K ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh O
khi bò đun nóng. Dựa vào khả năng chòu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành
3 type là A, L và B. Về sau người ta phân loại kháng nguyên K dựa vào thành
phần hóa học của chúng và đã có hơn 80 type kháng nguyên K đã được xác đònh.
Một vài E. coli, đặc biệt là E. coli tiết độc tố ruột có những lông bám
kháng mannose (mannose resistant - MR) cũng được dùng để phân loại về mặt
Download» Agriviet.com

5
huyết thanh học. Một vài lông bám kháng mannose này (ví dụ như K88 và K89)
đã từng được coi là kháng nguyên K. Về sau, khi xác đònh được thành phần hóa
học của những lông bám này có bản chất là protein nên việc xếp chúng vào
kháng nguyên K không còn phù hợp, chúng được xếp vào nhóm kháng nguyên
tiêm mao F.
* Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): Tiêm mao (fimbriae) dài
khoảng 4μm, đường kính 2,1 – 7,0 nm, dạng thẳng hay xoắn. Tiêm mao không

tham gia vào sự di chuyển, ngắn hơn và nhiều hơn flagella. Tiêm mao giúp vi
khuẩn kết dính vào tế bào niêm mao ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây
bệnh của vi khuẩn.
Hiện nay có hơn 700 type kháng nguyên hay serotype của E. coli từ sự tổ
hợp của các nhóm kháng nguyên O, H, K, F. Tuy nhiên nói chung, chỉ những E.
coli
ngoài đường ruột mới không có capsul (Jann và Jann, 1992), do đó đối với
những E. coli gây tiêu chảy, thường thì việc xác đònh serotype chỉ là sự kết hợp
đặc hiệu giữa kháng nguyên O và kháng nguyên H.
2.1.4 Phân loại E. coli
Mặc dù E. coli là vi khuẩn cộng sinh vô hại trong đường ruột. Tuy nhiên
trong một điều kiện thuận lợi, giống như hầu hết các tác nhân gây bệnh trên
màng nhầy, E. coli có các yếu tố cần thiết để gây bệnh gồm (1) cư trú trên màng
nhầy, (2) kháng được sự phòng vệ của vật chủ, (3) nhân lên, và (4) gây tổn hại
vật chủ. Đặc tính quan trọng nhất của dòng E. coli gây tiêu chảy là khả năng cư
trú trên màng nhầy ruột bất chấp nhu động ruột và sự cạnh tranh dinh dưỡng của
hệ vi sinh vật bình thường ở ruột (gồm cả những dòng
E. coli
khác). Sự hiện diện
của những lông bám là một đặc điểm của hầu hết các dòng E. coli, cả ở những
dòng E. coli không gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998). Tuy nhiên những dòng E.
coli gây tiêu chảy có những kháng nguyên lông đặc hiệu giúp E. coli có thể bám
dính vào màng nhầy ruột non mặc dù đây không phải là vò trí cư trú bình thường
Download» Agriviet.com

6
của E. coli (Levine và ctv, 1984). Một khi sự cư trú đã được thiết lập, việc gây
bệnh của các dòng E. coli gây tiêu chảy rất đa dạng. Dựa trên đặc điểm gây
bệnh (gồm các đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhầy ruột, hội
chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dòch tễ của bệnh), E. coli được

chia thành 5 nhóm chính:
- STEC (Shiga toxin-producing E. coli) hoặc VTEC (Verotoxigenic E. coli)
và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli)
- EPEC (Enteropathogenic
E. coli
)
- ETEC (Enterotoxigenic E. coli)
- EAggEC hay EAEC (Enteroaggregative E. coli)
- EIEC (Enteroinvasive E. coli)
Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli:
(1) Sản xuất độc tố (ETEC, EAEC, STEC)
(2) Tấn công / xâm lấn (EIEC)
(3) Bám dính, truyền tín hiệu qua màng (EPEC và EHEC)
Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc
hiệu cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.5 Shiga toxigenic E. coli (STEC)
2.1.5.1 Thuật ngữ:
Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra
những thuật ngữ khác nhau để gọi tên cho nhóm E. coli này. Tên gọi
Verotoxigenic E. coli (VTEC) được Konowalchuk và ctv (1977) đặt cho nhóm
này khi phát hiện việc sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào Vero. Tên gọi
Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) là do dòng này gây viêm kết tràng xuất
huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS) (Nataro và Kaper, 1989). Và thuật
ngữ Shiga toxin-producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga-like toxin-
produccing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sản sinh độc tố gây độc tế bào giống
như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1996).
Download» Agriviet.com

7
STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau, và cả hai đều chỉ ra

rằng nhóm E. coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào. Mặc dù
vậy không phải chỉ cần có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có
các yếu tố độc lực khác. Những dòng E. coli mang gen sinh độc tố cũng hiện diện
trong ruột gia súc khỏe mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu
một vài hay tất cả những yếu tố độc lực khác của STEC (Beutin và ctv, 1994). Do
đó không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.5.2 Shiga toxin và những yếu tố độc lực liên quan đến đặc tính gây
bệnh của STEC:
STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), còn gọi là Shiga
toxin (Stx) hay Verotoxin (VT). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản
ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất
thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e (Calderwood
và ctv, 1996), Stx2g (Leung và ctv, 2003). Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1,
Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2.
Cả hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vò B 7,7 kDa và
1 tiểu đơn vò A 32 kDa. Tiểu đơn vò A gồm peptide A
1
28 kDa và peptide A
2
4
kDa nối với nhau bằng cầu nối disulfur. Peptide A
1
có hoạt tính enzyme và
peptide A
2
có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vò A vào những tiểu đơn vò B. Những
tiểu đơn vò B giúp độc tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb
3

(globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặt của những tế bào eukaryote (Stx2e

có receptor là Gb
4
). Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểu đơn vò A đến
tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome. Peptide A
1
có hoạt tính
enzyme hoạt động như một N-glycosidase cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S của
ribosome, do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein. Do không tổng hợp được
protein, những tế bào bò Stx tác động (tế bào nội mô của thận, tế bào biểu mô
ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay bất cứ tế bào nào có receptor là Gb
3,
receptor
Gb
4
đối với Stx2e) sẽ chết. Hậu quả gây độc cho tế bào ruột do Stx và các yếu tố
Download» Agriviet.com

8
độc lực khác của STEC là gây sự hư hại những tế bào nhung mao ruột, gây tiêu
chảy và viêm kết tràng xuất huyết (Haemorrhagic colitis – HC). Sự hư hại những
tế bào thành mạch máu do Stx2e sẽ gây nên hiện tượng phù thủng ở heo. Những
tổn thương ở tế bào nội mô thận gây nên hội chứng huyết niệu (Haemolytic
uraemic syndrome - HUS) ở người.
Yếu tố bám dính của STEC/EHEC đã được chứng minh là đóng vai trò
quan trọng trong sự đònh vò vi khuẩn ở ruột. Đó chính là intimin, một protein
màng ngoài có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa. Intimin được mã hóa bởi gen
eae
(E. coli attaching and effacing). Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy
(attaching-and-effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu
mô (Donnerberg và ctv, 1993). Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC.

Gen eae gây kiểu tổn thương A/E là một trong số các gen nằm trên vùng gây
bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột – locus of enterocyte
effacement, LEE). Vùng LEE của STEC/EHEC chứa những gen mã hóa cho
intimin, mã hóa receptor của intimin Tir (translocated intimin receptor) và một số
gen khác. Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà còn là điều kiện đủ cho việc
hình thành tổn thương A/E. Tuy nhiên không phải tất cả STEC đều có gen eae,
nhưng tất cả EHEC đều có gen
eae
(Nataro và Kaper, 1998).
Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein màng ngoài của vi
khuẩn (intimin) và protein Tir. Protein Tir được tiết ra khỏi vi khuẩn, chuyển vò
vào màng của tế bào vật chủ (Paton và ctv, 1996).
Yếu tố khác có liên quan đến độc lực của STEC là việc tạo ra
enterohaemolysin (EHEC-Hly) và có thể cả độc tố ruột chòu nhiệt EAST1.
EHEC-Hly được mã hóa bởi gen trên plasmid 60 MDa (pO157) mà
plasmid này được tìm thấy ở gần như tất cả các dòng O157:H7 và cũng khá phổ
biến cả những dòng STEC non-O157 nữa (Nataro và Kaper, 1998). Trên plasmid
Download» Agriviet.com

9
này có sự hiện diện của một operon gồm 4 khung đọc mở (open reading frame -
ORF) là hlyCABD. Trong đó hlyA là gen cấu trúc khởi đầu cho haemolysin.
Độc tố ruột chòu nhiệt EAST1 (đầu tiên được mô tả ở nhóm EAEC là
EAEC heat-stable enterotoxin 1), cũng được tìm thấy ở nhiều dòng STEC. Tầm
quan trọng của EAST1 đối với khả năng gây bệnh của STEC vẫn chưa được biết,
nhưng nó có ở một vài trường hợp tiêu chảy không có máu mà thường thấy ở
những người nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998).
Hầu hết các ổ dòch của STEC/EHEC là do O157:H7, nên người ta cho rằng
có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác (Nataro
và Kaper, 1998). Tuy nhiên cũng có nhiều serotype khác ngoài O157:H7 có liên

quan đến HC và HUS trên người. Những serotype non-O157 phổ biến nhất liên
quan đến bệnh trên người thuộc O26, O91, O103, O111 (Paton, 1989). Hầu hết
tính chất sinh hóa của
E. coli
O157:H7 đều tương tự như những
E. coli
khác.
Điểm khác biệt về sinh hóa của dòng O157:H7 là không lên men đường sorbitol
và β-glucuronidase dương tính. 93% chủng E. coli thì lên men sorbitol trong 24
giờ, trong khi E. coli O157:H7 lại không. 93% chủng E. coli cho β-glucuronidase
dương tính trong khi E. coli O157:H7 thì không. Ngoài ra trong môi trường TSB,
O157:H7 phát triển nhanh ở 30 – 42
o
C, tăng trưởng khó khăn ở 43 – 44
o
C và
ngừng tăng trưởng ở 45
o
C (dẫn liệu bởi Trần Thanh Phong, 1998).
Liều gây nhiễm của E. coli O157:H7 là rất nhỏ, từ 10 – 100 vi khuẩn
(Griffin, 1994; Paton, 1996), nhưng cũng may mắn là E. coli O157 hiện diện trong
phân, thực phẩm với tần số thấp hơn nhiều so với nhóm non-O157 (Paton, 1998).
Đây cũng là trở ngại cho việc phát hiện E. coli O157:H7. Dựa vào những tính
chất riêng biệt của dòng
E. coli
này, nhiều môi trường tăng sinh và chọn lọc đã
được tạo ra để phát hiện O157:H7 trong thực phẩm. Người ta dùng môi trường
tăng sinh có bổ sung thêm kháng sinh cefixime, cefsulodin, vancomycin để hạn
chế sự tăng trưởng của những vi trùng Gram âm khác. Sau đó sử dụng môi trường
Download» Agriviet.com

10
tuyển lựa để phát hiện nhóm E. coli O157. Thường nhất là môi trường SMAC
hoặc SMAC có bổ sung cefixime và tellurite (CT-SMAC) (FDA, 2002).
2.1.5.3 Nguồn lây nhiễm:
STEC có thể được tìm thấy trong phân của
nhiều loài động vật như trâu bò, cừu, dê, heo, chó và mèo (Beutin, 1993; Beutin,
1995; Chapman, 1997) và ngựa (Chalmer, 1997). Loài động vật quan trọng nhất
trong việc gây nhiễm cho người là trâu bò. Đường gây nhiễm chủ yếu của STEC
vào thực phẩm là việc vấy nhiễm chứa vật đường tiêu hóa và phân vào thòt trong
quá trình giết mổ (Paton, 1998). STEC lây truyền qua người chủ yếu bằng con
đường thực phẩm, nước và từ người qua người. Hầu hết các trường hợp là do ăn
thực phẩm đã bò nhiễm, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc động vật, mà thòt bò
là nguyên nhân chủ yếu (Keskimaki, 2001).
2.1.6 Enteropathogenic E. coli (EPEC)
EPEC là nhóm E. coli gây tiêu chảy quan trọng có liên quan đến tiêu chảy
ở trẻ sơ sinh tại những nước đang phát triển.
Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E
(attaching-and-effacing, A/E), có thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ
những bệnh nhân hay thú bò nhiễm bệnh và trong nuôi cấy tế bào (dẫn liệu
Nataro và Kaper, 1998). Kiểu hình riêng biệt này được đặc trưng bởi sự hư hại
của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu mô.
Dạng tổn thương này khác với dạng tổn thương do dòng ETEC và Vibrio cholerae
(ETEC và V. cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung).
Mặc dù những nghiên cứu trước đây đã báo cáo về những tổn thương mô bệnh
học dạng này, nhưng cho đến khi Moon và ctv (1983) báo cáo rằng kiểu tổn
thương này có liên quan rộng rãi đến EPEC thì thuật ngữ “gắn kết và gây hư hại”
(“attaching and effacing” – A/E) mới được đưa ra. Gen cần thiết cho việc tạo ra
tổn thương A/E là gen eae mã hóa protein intimin. Protein này là yếu tố độc lực
cần thiết của EPEC (Donnerberg, 1993). Theo Nataro và Kaper (1998), gen eae

Download» Agriviet.com

11
hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia
alvei; nhưng không hiện diện ở những dòng E. coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột
thông thường.
Đáp ứng viêm tại chỗ và sự tăng tính thấm của ruột trong đáp ứng với
EPEC góp phần vào tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998). Điểm đáng lưu ý nhất về
mặt dòch tễ học của bệnh do EPEC về sự phân bố về lứa tuổi của người bệnh.
Bệnh chủ yếu xảy ra trên trẻ em dưới 2 tuổi. Bệnh thường biểu hiện cấp tính với
tiêu chảy nghiêm trọng. Lý do liên quan đến khả năng đề kháng được ở người
trưởng thành và trẻ em lớn còn chưa được biết rõ, nhưng có lẽ là do sự mất các
receptor đặc hiệu. Tuy nhiên EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ở người lớn nếu số
lượng vi khuẩn đủ lớn (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.7 Enterotoxigenic E. coli (ETEC)
2.1.7.1 Các yếu tố độc lực:
Nhóm ETEC có hai nhóm quyết đònh độc lực
chính là độc tố ruột (enterotoxin) và yếu tố đònh vò (colonization factor – CF).

Độc tố ruột enterotoxin
Nhóm ETEC gồm những E. coli tạo ra ít nhất một trong hai loại độc tố
đường ruột là ST và LT.
ETEC thường được xem là đại diện của cơ chế gây bệnh bằng cách vi
khuẩn bám vào bề mặt màng nhầy ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng
tình trạng tiết dòch. Nhóm ETEC gây tiêu chảy thông qua sự tiết độc tố đường
ruột LT và ST. E. coli nhóm này có thể chỉ tiết độc tố LT, hoặc chỉ tiết ST, hoặc
có thể tiết cả LT và ST.
(1) Độc tố không chòu nhiệt (Heat-labile toxin - LT): Độc tố LT của E.
coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố tả
(cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau nhiều đặc

tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về
receptor, hoạt tính enzym, và tác động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào. LT có
Download» Agriviet.com

12
2 serogroup chính là LT-I và LT-II. LT-I và LT-II không có phản ứng chéo về
mặt miễn dòch.
LT-I được tiết bởi những dòng
E. coli
gây bệnh trên người và thú. Còn LT-
II được tìm thấy chủ yếu ở E. coli trên thú và hiếm khi ở người. Về mặt khái
niệm, trừ khi đi kèm với chữ số la mã thì tên gọi LT dùng để chỉ LT-I (Nataro và
Kaper, 1998).
- LT-I: LT-I là một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu
đơn vò A 28 kDa và 5 tiểu đơn vò B 11,5 kDa. Tiểu đơn vò A chòu trách nhiệm
trong hoạt tính enzym của độc tố gồm peptide A
1
và peptide A
2
liên kết nhau bởi
cầu nối disulfur. Những tiểu đơn vò B sắp xếp thành vòng nhẫn, liên kết chắc
chắn với ganglioside GM
1
và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột
– chúng là các receptor của LT. Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và có thể phản
ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I) đầu tiên được phân lập từ heo và
LTh (LTh-I) được phân lập từ người. Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên
plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và/hoặc gen mã hóa
những kháng nguyên của yếu tố đònh vò (colonization factor antigen - CFA).
Sau khi độc tố đi vào nội bào, chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống

vận chuyển của Golgi (Golgi vận chuyển). Đích của LT trong tế bào là enzym
adenylate cyclase nằm ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột. Peptide A
1
có
hoạt tính ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến của
protein liên kết GTP (GTP-binding protein) là G
S
, gây hoạt hóa enzyme
adenylate cyclase, làm gia tăng AMP vòng (cAMP) trong tế bào. Vì vậy enzyme
cAMP-dependent protein kinase (A kinase) được họat hóa dẫn đến sự phosphoryl
hóa kênh chloride (Cl
-
) ở màng tế bào biểu mô vượt quá mức bình thường. Kết
quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl
-
và ngăn cản sự hấp thụ
NaCl bởi những tế bào có lông nhung. Hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng
Download» Agriviet.com

13
kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy
(Nataro và Kaper, 1998).
Mặc dù sự kích thích của Cl
-
do sự gia tăng lượng cAMP trong tế bào là
cách giải thích cổ điển về cơ chế gây tiêu chảy của LT và CT, ngày càng có
nhiều bằng chứng cho thấy rằng đáp ứng tăng tiết đối với những độc tố này có cơ
chế phức tạp hơn. Một cơ chế tác động khác của độc tố có liên quan đến những
prostaglandin E (PGE
1

và PGE
2
) và yếu tố hoạt hóa tiểu cầu. Sự tổng hợp và
phóng thích những chất chuyển hóa của acid arachidonic như prostaglandin và
leukotriene có thể kích thích sự vận chuyển các chất điện giải và kích thích nhu
động ruột. Cơ chế tác động khác thứ hai có liên quan đến hệ thần kinh ruột
(enteric nervous system – ENS) điều hòa nhu động và sự tiết ion ở ruột. Cơ chế
thứ ba là CT và LT gây đáp ứng viêm ruột dạng nhẹ.
- LT-II:
Nhóm LT-II giống với LT-I và CT khoảng 55 - 57% ở tiểu đơn vò
A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vò B. LT-II làm gia tăng cAMP
trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II sử dụng GD1 làm
receptor thay vì GM
1
. Như đã nói ở trên, LT-II không có liên quan đến bệnh trên
người và thú.
(2) Độc tố chòu nhiệt (Heat-stable toxin - ST): Ngược với LT, ST có
trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng
chòu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau
về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả 2 nhóm được tìm thấy chủ
yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon. STa
(hay còn gọi là ST-I) được tạo bởi ETEC và một vài vi khuẩn Gram âm khác gồm
Yersinia enterocolitica và V. cholerae không phải O1. ST giống 50% trình tự acid
amin với độc tố chòu nhiệt EAST1 của EAEC. Gần đây, còn có báo cáo cho rằng
một vài dòng của ETEC cũng có thể sản sinh độc tố EAST1 ngoài độc tố STa.
Còn STb chỉ được tìm thấy ở ETEC.
Download» Agriviet.com

14
- STa: STa là một peptide gồm 18 -19 amino acid với trọng lượng phân tử

khoảng 2 kDa. STa được chia thành 2 loại là STp (ST porcine hay STIa) phân lập
được đầu tiên trên heo và STh (ST human hay STIb) phân lập trên người. Cả 2
loại độc tố có thể được tìm thấy ở dòng ETEC người.
Receptor chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-
C) thuộc họ những enzyme receptor cyclase. Sự kết hợp của STa vào GC-C kích
thích hoạt tính GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào. Hoạt động này
cuối cùng dẫn đến sự kích thích tiết Cl
-
và/hoặc ngăn cản

sự hấp thụ NaCl, gây
ra sự tiết chất lỏng trong ruột.
- STb: STb chủ yếu có liên quan đến dòng ETEC phân lập từ heo mặc dù
cũng có báo cáo về vài chủng ETEC người cũng sản sinh STb. Không như STa,
STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế
bào nhung mao của biểu mô ruột và teo nhung mao một phần. Receptor của STb
chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố có thể kết hợp không
đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào trong tế bào. Không tạo ra sự tiết Cl
-

như STa, STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO
3
-
). STb không làm tăng
cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại
bào. STb cũng kích thích phóng thích PGE
2
và serotonin, từ đó người ta cho rằng
ENS có thể cũng có liên quan đến đáp ứng tiết gây ra bởi độc tố này
(Hitotsubashi, 1992).


Yếu tố đònh vò (colonization factor – CF): Cơ chế mà ETEC kết dính và
cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC
đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi
khuẩn, gọi là yếu tố đònh vò (CF).
CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại chính
gồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm có dạng bó, lông có cấu trúc
mảnh mềm. Gen của CFA thường được mã hóa trên plasmid, cũng là nơi mã hóa
Download» Agriviet.com

15
cho độc tố ST và/hoặc LT. Tiểu đơn vò cấu trúc lông thường tạo miễn dòch vượt
trội và do đó tiểu đơn vò có tính kháng nguyên mạnh nhất.
2.1.7.2 Dòch tễ
Dòng ETEC liên quan đến 2 hội chứng lâm sàng chính: tiêu chảy trên trẻ
em thôi bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở du khách. Dòch tễ của
bệnh do ETEC được quyết đònh bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dòch tại màng nhầy
đối với sự nhiễm ETEC khác nhau ở từng cá thể, (2) những người nhiễm không
có biểu hiện triệu chứng vẫn bài thải một lượng lớn vi khuẩn qua phân, và (3)
việc nhiễm chỉ đạt được khi liều gây nhiễm khá cao. Ba đặc tính này tạo nên tình
trạng ô nhiễm ETEC trong môi trường ở những vùng có dòch và hầu hết trẻ em
trong vùng này sẽ đương đầu với ETEC ở thời kỳ thôi bú. Trẻ em đã ở tuổi đến
trường và người lớn có nguy cơ tiêu chảy do ETEC rất thấp. Dòng ETEC sản sinh
ST là nguyên nhân của hầu hết các trường hợp dòch bệnh.
Các nghiên cứu dòch tễ học cho thấy rằng thức ăn và nước bò ô nhiễm là
những phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black, 1981). Sự nhiễm ETEC ở
những vùng dòch thường tập trung chủ yếu vào những tháng ấm và ẩm, khi đó thì
sự nhân lên của ETEC trong thực phẩm và nước là lý tưởng nhất.
Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người
trưởng thành chưa có miễn dòch cũng có thể nhiễm. Thực vậy ETEC là nguyên

nhân chính gây tiêu chảy trên du khách trưởng thành từ những nước đã phát triển
đến thăm những vùng nhiễm dòch ETEC. Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số
du khách này có triệu chứng tiêu chảy và 20 - 40% các trường hợp là do ETEC.
Việc tiêu chảy trên du khách thường xảy ra ở những du khách lần đầu tiên đến
thăm những nước đang phát triển. Tiêu chảy trên du khách thường là do thức ăn
và nước uống bò ô nhiễm.
Download» Agriviet.com

16
2.1.7.3 Khía cạnh lâm sàng
Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14
– 50 giờ). Bệnh nhân tiêu chảy như nước, thường không có máu; một vài bệnh
nhân có hiện tượng sốt và ói mữa. Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và tự bớt
dần nhưng cũng có thể gây ra tiêu chảy xổ nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio
cholerae.
Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ra trên
trẻ em thôi bú ở những nước đang phát triển. Mặc dù việc sử dụng kháng sinh
nhạy cảm cũng làm giảm thời gian và mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trò có
hiệu quả thì không sẵn có ở những vùng nguy cơ cao; ngoài ra sự đề kháng kháng
sinh của dòng ETEC cũng là vấn đề đáng quan tâm. Do đó cần phải lưu ý rằng cơ
sở của việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nước trong cơ
thể nếu có triệu chứng tiêu chảy.
2.1.8 Enteroaggregative
E. coli
(EAEC hay EAggEC)
EAEC hay EaggEC là nhóm E. coli không sinh enterotoxin và bám dính
vào tế bào Hep-2 theo kiểu bám dính kết tập (aggregative adhesion – A/A).
Nhóm EAEC gồm cả dòng
E. coli
gây bệnh và không gây bệnh. Tất cả các

EAEC đều có plasmid 60 MDa chứa gen tạo tổn thương dạng A/A và gen mã hóa
cho độc tố ruột chòu nhiệt EAST1 (EAEC heat-stable enterotoxin 1). Vai trò của
EAST1 trong tiêu chảy chưa rõ ràng, nhưng gen mã hóa A/A trên plasmid là cần
thiết cho quá trình gây bệnh (Baudry 1990). Ngoài ra EAEC còn có những yếu tố
độc lực khác như haemolysin, các độc tố và các yếu tố có liên quan đến quá trình
bám dính như lông và những protein màng ngoài.
EAEC gây tiêu chảy kéo dài (trên 14 ngày). Trong hầu hết các báo cáo
đều mô tả EAEC ở các ca tiêu chảy lẻ tẻ, nhưng EAEC cũng có thể là tác nhân
gây thành ổ dòch (dẫn liệu Keskimaki, 2001).
Download» Agriviet.com

17
2.1.9 Enteroinvasive E. coli (EIEC)
Những E. coli dòng EIEC thường không điển hình về các đặc tính sinh hóa
và khó xác đònh. EIEC rất giống với Shigella về mặt kháng nguyên, sinh hóa và
đặc tính gây bệnh. Triệu chứng lâm sàng của bệnh bao gồm sốt, đau bụng quặn,
khó chòu, nhiễm trùng máu và tiêu chảy như nước hay bệnh lỵ điển hình với máu,
dòch nhầy và nhiều bạch cầu trong phân. Cả Shigella spp và EIEC đều có khả
năng xâm nhập vào tế bào biểu mô kết tràng và chúng đều tiết một hay nhiều
độc tố ruột liên quan đến tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998). EIEC cũng có thể
gây tiêu chảy ở khách du lòch và liên quan đến những vụ ngộ độc thực phẩm do
ăn phải thức ăn bò ô nhiễm.
Tóm lại, một số gen độc lực quan trọng của những nhóm E. coli gồm:
STT Gen độc lực Nhóm E. coli
1
eae
EPEC, STEC
2
hly
STEC

3
stx1
STEC
4
stx2
STEC
5
stx2e
STEC
6
sta
ETEC
7
stb
ETEC
8
lt-I
ETEC
Việc phát hiện các gen độc lực của
E. coli
thường được thực hiện dựa trên
những kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR.
2.2 Kỹ thuật PCR
2.2.1 Nguyên tắc
PCR (polymerase chain reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Đây là kỹ thuật in
vitro cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong thời gian
ngắn (tạo dòng in vitro, không cần hiện diện của tế bào).
Download» Agriviet.com

18
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới
từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những
đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và
DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Các mồi này gồm có
mồi “xuôi” (forward primer: mồi tác động lên sợi 3’→ 5’) và mồi “ngược”
(reverse primer: mồi tác động lên sợi 5’→ 3’).
2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3
bước:
Bước 1 (giai đoạn biến tính - denaturation): hai mạch của phân tử DNA
tách rời nhau thành hai mạch đơn. Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao
hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở 94 – 95
0
C trong vòng 30
giây đến 1 phút.
Bước 2
(giai đoạn ủ bắt cặp – anealing): Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn
Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt
độ này dao động trong khoảng 40 – 60
0
C tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và
kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
Bước 3 (giai đoạn kéo dài – elongation hay extension): nhiệt độ ở giai
đoạn này được tăng lên 72
0
C giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt
nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn DNA nằm
giữa hai mồi được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA.
Mỗi chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại

làm tăng gấp đôi lượng DNA mẫu của lần trước. Tổng DNA khuếch đại được tính
theo công thức:
Tổng DNA khuyếch đại = m * 2
n
Với n là số chu kỳ, m là số bản sao của chuỗi mã hóa.
Download» Agriviet.com

19
* Số chu kỳ của phản ứng PCR
Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong một phản ứng, vì phản ứng
PCR diễn ra qua hai giai đoạn:
Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng
mẫu ban đầu.
Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:
+ Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
+ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng.
+ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp với
nhau.
Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu. Số bản mẫu 10
5

thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, số bản mẫu 10
2
– 10
3
thì số chu kỳ phải là 35 – 40.
2.2.3 Các thành phần của một phản ứng PCR
- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.
- Mồi (primer): Mồi là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự
bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp

DNA. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết đònh của phản ứng PCR. Các mồi được
chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình
tự lặp lại trên gen, không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược và
cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một mồi.
Chiều dài các mồi tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide
(thường là 18 – 24 nucleotide). Trình tự nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngược”
không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1Kb.
- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chòu nhiệt,
được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq DNA
polymerase không bò phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến
Download» Agriviet.com

20
cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg
2+
. Taq DNA polymerase tổng
hợp DNA theo hướng 5’
→
3’ và hoạt động tốt nhất ở 70 - 72
0
C.
- Các nucleotide (dNTP- deoxyribonucleotide triphosphate): Là hỗn hợp 4
loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.
- Dung dòch đệm: Thành phần dung dòch đệm có thể thay đổi tuỳ loại
enzyme được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg
2+
. Nó hình thành một phứp hợp
hoà tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho emzyme
polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ
Mg

2+
(thường được sử dụng ở dạng MgCl
2
) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến
hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Ngoài ra nồng độ MgCl
2
có thể ảnh
hưởng đến quá trình bắt cặp của mồi, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn,
hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Nồng độ Mg
2+
phải được xác
đònh cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Nồng độ MgCl
2
trong hổn hợp
phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).
Download» Agriviet.com

21










5’ 3’

3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
A
B
C
AND KHUÔN MẪU
Lặp lại
n vòng
Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR
A : Biến tính – tách rời 2 mạch của phân tử DNA
B : Ủ bắt cặp
– cặp mồi chuyên biệt bắt cặp với khuôn
C : Kéo dài
– DNA polymerase tổng hợp mạch mới kể từ mồi đã bắt cặp
dưới sự hiện diện của 4 loại dNTP và chất đệm thích hợp
Thời gian
(phút)

Nhiệt độ (
0
C)
40
50
60
70

90
100
80
1
2
3
4
56
Lặp lại n lần
1 chu kỳ
A
B
C
94 – 95
0
C
4
0 – 60
0
C
72
0
C
Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR
Download» Agriviet.com

22
2.2.4 Phân tích kết quả PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát
hiện bằng phương pháp điện di.

Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các
DNA. DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi
chòu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện
trường. Sự di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện
trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử (tức là số nucleotide) và nồng độ các
chất cấu thành gel, điện thế.
Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng. Các DNA trong
gel agarose được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide, chất
này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang
dưới tác dụng của tia UV (bước sóng λ = 300 nm) thành vạch màu đỏ da cam.
Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một
“yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker – MWM) là
một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder).
2.3 Multiplex – PCR
Multiplex - PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân
lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dùng đồng thời nhiều
cặp mồi trong một phản ứng. Multiplex - PCR đầu tiên được mô tả bởi
Chamberlain năm 1988 và kể từ đó multiplex - PCR được ứng dụng rất nhiều
trong các lónh vực kiểm tra DNA (Protocol online).


Download» Agriviet.com

23
Chương 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và đòa điểm thực hiện

Thời gian

Đề tài được thực hiện từ ngày 01/03/2004 đến ngày 30/11/2004.

Đòa điểm
- Mẫu khảo sát được lấy từ các chợ lẻ, lò mổ, hộ - trại chăn nuôi ở TP. Hồ
Chí Minh và Long An.
- Việc nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại Phòng thực hành
Kiểm nghiệm thú sản và môi trường, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học
Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
- Việc xác đònh các gen độc lực của E. coli được thực hiện tại Trung tâm
Phân tích thí nghiệm Hóa sinh, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí
Minh.
3.2 Nội dung
- Phân lập vi khuẩn E. coli trong phân và thòt bò, heo bằng phương pháp
đònh lượng. Từ đó đánh giá mức độ vệ sinh thực phẩm bằng cách so sánh với tiêu
chuẩn Việt Nam về số lượng E. coli trên thòt tươi (TCVN 7046 - 2002). Sử dụng
kỹ thuật multiplex - PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn E. coli phân
lập được bằng qui trình đònh lượng.
- Phân lập đònh tính vi khuẩn E. coli trong phân bê tiêu chảy, phân heo
con tiêu chảy, thòt bò và thòt heo. Phát hiện các gen độc lực của
E. coli
đã phân
lập đònh tính bằng kỹ thuật multiplex - PCR.
Download» Agriviet.com

24
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập vi khuẩn
E. coli



Đối tượng lấy mẫu
- Thòt bò, heo được lấy từ các chợ lẻ (dùng cho qui trình đònh lượng).
- Bề mặt quày thòt bò, thòt heo được lấy trong lò mổ (dùng cho qui trình
phân lập đònh tính).
- Phân bê và phân heo con tiêu chảy được lấy từ một số trại và hộ chăn
nuôi.
- Phân bò và phân heo bình thường được lấy từ một số trại và hộ chăn
nuôi.

Cách lấy và bảo quản mẫu
- Mẫu thòt: Chọn ngẫu nhiên miếng thòt để lấy mẫu. Khối lượng mẫu là 50
g thòt.
- Mẫu bề mặt quày thòt: Chọn ngẫu nhiên quày thòt ở giữa ca giết mổ.
Dùng gạc vô trùng lau bề mặt quày thòt với tổng diện tích khoảng 200 cm
2
.
- Mẫu phân bình thường: Dùng muỗng múc khoảng 25 g ở phần giữa cục
phân gia súc mới thải.
- Mẫu phân tiêu chảy: Phân được lấy từ trực tràng bằng tăm bông (± 0,1 g)
rồi cho vào môi trường vận chuyển Carry Blair.
Tất cả các loại mẫu sau khi lấy đều được đựng trong dụng cụ vô trùng và
giữ lạnh ở 4 – 8
0
C cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu được giữ tối đa 24 giờ).

Số lượng mẫu
Số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập được vi khuẩn E.
coli từ các mẫu đã lấy.
Download» Agriviet.com

25

Số lượng mẫu khảo sát
STT Đối tượng mẫu
Phân lập
đònh tính
Phân lập qua
đònh lượng
1 Thòt heo 49 23
2 Thòt bò 34 8
Bình thường 25 10
3 Phân heo
Tiêu chảy 22 -
Bình thường 21 10
4 Phân bò
Tiêu chảy 10 -
Tổng cộng 161 51


Qui trình phân lập vi khuẩn E. coli
- Từ mẫu thòt và mẫu phân bình thường, vi khuẩn
E. coli
được phân lập,
đònh lượng theo qui trình FAO (1992).
- Mẫu phân bê và heo con tiêu chảy được cấy ria trực tiếp trên môi trường
EMB hoặc MAC, ủ ở 37
o
C trong 24 giờ. Khuẩn lạc E. coli điển hình trên môi
trường EMB sẽ dẹp, có màu tím ánh kim với tâm sậm màu, và trên môi trường
MAC có màu hồng, tròn, lồi.

- Mẫu bề mặt quày thòt (200 cm
2
) được làm đồng đều trong 180 ml pepton
đệm phosphate và dập mẫu trong 60 giây. Bổ sung kháng sinh cefixime với nồng
độ 0,0125 mg/l (FDA, 2002). Ủ ở 37
o
C trong 24 giờ. Pha loãng canh tăng sinh 10
lần với nước sinh lý vô trùng. Hút 100 μl canh tăng sinh ở nồng độ 10
-1
dàn đều
lên bề mặt đóa thạch CT-SMAC. Ủ ở 37
o
C trong 24 giờ. Vi khuẩn
E. coli

O157:H7 điển hình thường phát triển trên môi trường CT-SMAC tạo khuẩn lạc
không màu hoặc màu xám với tâm đục.