Giáo trình -Vi hóa sinh kỹ thuật môi trường -chương 6 pptx

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


CHƯƠNG 6 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG TRONG
XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG

1. PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG BẰNG NHIỆT
Phương pháp khử trùng bằng nhiệt đã được biết và sử dụng tử năm 178. Như đã
trình bày ở các phần trên, mỗi vi sinh vật thích hợp với một nhiệt độ thích hợp nhất
định. Nếu nhiệt độ môi trường nằm dưới hoặc nằm trên nhiệt độ tối ưu thì tốc độ tăng
trưởng của vi sinh vật sẽ chậm lại. Nếu nhiệt độ n
ằm ngoài ngưỡng giới hạn thì vi sinh
vật sẽ chết hoặc tạo bào tử
Tốc độ khử trùng bằng nhiệt là một hàm số phụ thuộc vào thời gian và nhiệt độ.
Ví dụ Tuberclebacilli bị tiêu diệt trong 30 phút ở 58
0
C, nhưng chỉ mất 2 phút ở 65
0
C và
một vài giây ử 72
0
C. Mỗi VSV có một thời gian chết ở một nhiệt độ nhất định.
1.1 Khử trùng trực tiếp bằng ngọn lửa
Có thể nói đây là phương pháp khử trùng nhanh nhất, khử trùng trực tiếp bằng
ngọn lửa. Phương pháp này được sử dụng trong quá trình nuôi cấy và phân lập vi sinh
vật. Phương pháp này chỉ có thể áp dụng với những vật liệu chịu nhiệt độ cao. Trước
đây, cách khử trùng này được áp dụng để thiêu những xác người bị bệnh truyền nhiễm
để tránh lây lan. Hiện nay phương pháp này vẫn còn áp dụng với nhữmg thú nuôi mắc
bệnh lây lan như bệnh than.
1.2 Khử trùng bằng nhiệt khô
Dạng năng lượng này không thâm nhập dễ dàng vào một vật liệu cần khử trùng

do đó cần nhiệt độ khử trùng cao và thời gian khử trùng dài.
Ví dụ nhiệt độ khử trùng là 15
0
C, thời gian khử trùng là 2 giờ thì có thể phá vỡ
hoàn toàn bào tử của VSV. Tăng nhiệt độ cao hơn nữa không tốt cho giấy gói dụng cụ
khử trùng sẽ bị cháy ở 180
0
C.
Phương pháp khử trùng bằng nhiệt khô được áp dụng để khử trùng những nhiên
liệu khô như bột cũng như những dụng cụ thí nghiệm như: ống đong, pipet, phễu thủy
tinh, beker Nhiệt độ không làm mất hình dạng của dụng cụ khử trùng như trong trường
hợp hơi nước và không ăn mòn đáy của các vật liệu như beker.
1.3 Khử trùng bằng nước sôi
Khử trùng bằng cách nhấn chìm vật liệu trong nước sôi là một trong các phương
pháp khử trùng ẩm đã được sử dụng. Khử trùng bằng nhiệt ẩm hơi nóng ngấm vào vật
liệu khử trùng nhanh hơn nhiều so với khử trùng bằng nhiệt khô do nước dẫn nhiệt tốt
hơn nhiều so với không khí. Do đó nhiệt khử trùng và thời gian khử trùng thấp hơn so
với khử trùng bằng nhiệt khô. Nhiệt
ẩm giết VSV bằng cách làm biến tính protein của
chúng. Biến tính có nghĩa là làm thay đổi tính chất vật lí hay hóa học của protein bao
gồm thay đổi cấu trúc của protein do sự phá vỡ các liên kết hóa học giúp cho protein có
cấu trúc 3 chiều. Khi protein bị biến đổ thành cấu trúc 2 chiều chúng có thể kết tủa và
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 80

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


trở nên bất hoạt. Ví dụ protein của trứng khi bị luộc trong nước sôi. Việc kết tủa hay phá
vỡ cấu trúc protein cần ít năng lượng hơn quá trình oxy hóa do đó nhiệt sử dụng ít hơn.
Nước sôi không thể xem như là một nhân tố khử trùng triệt để vì nó không luôn

luôn có thể giết chết bào tử của vi khuẩn và những virut không hoạt động. Ở điều kiện
bình thường, với nồng độ VSV nh
ỏ hơn 1 triệu/ml. Hầu hết VSV có thể bị khử trong 10
phút. Tuy nhiên bào tử của nấm, Protozoa cần trên 30 phút. Bào tử của vi khuần cần 2
giờ hoặc hơn nữa. Do khả năng chịu nhiệt khác nhau của VSV, nước sôi không được sử
dụng trong mục đích khử trùng.
Nếu trong trường hợp phải khử trùng bằng nước sôi, vật liệu phải rữa thật sạch
các vết bẩn, v
ết máu. Thời gian khử trùng tối thiểu 30 phút, ngoại trừ những vùng có độ
cao lớn phải gia tăng thời gian khử trùng để bù đắp cho nhiệt độ sôi của nước thấp hơn.
Tất cả các vật liệu phải được gói kỹ, có thể thêm soda 2% để tăng hiệu quả của quá
trình.
1.4 Khử trùng bằng Autoclave áp suất, nhiệt độ
Phương pháp khử trùng bằng áp suất hơi là một trong các phương pháp khử
trùng linh động có khả năng khử tất cả các mầm sống bao gồm cả bào tử vi khuẩn.
Phương pháp này khử trùng bằng một thiết bị đặc biệt gọi là Autoclave. Hơn 100 năm
về trước, các nhà vi sinh vật học người Pháp và Đức đã sử dụng Autoclave như là một
thiết bị không thể thiếu trong phòng thí nghiệm của h
ọ.

Hình 6. 1: Autoclave
Một tính chất cơ bản trong hóa học khi áp suất của khí tăng thì nhiệt độ của
khí cũng tăng tỉ lệ. Do hơi nước là gia tăng áp suất trong hệ kín nên nhiệt độ của nó
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 81

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


cũng gia tăng. Khi đó phân tử hơi nước trở nên mạnh mẽ hơn, khả năng thấm gia tăng.
Nguyên tắc này giảm thời gian nấu bằng nồi áp suất và giảm thời gian khử trùng bằng

Autoclove. Lưu ý rằng tác nhân khử trùng là nhiệt ẩm chứ không phải là áp suất.
Autoclove khử trùng cho hầu hết các bào tử vi khuẩn ở 125
0
C và thời gian là
15 phút. Trong một vài trường hợp đặc biệt thì thời gian khử trùng là 30 phút.

Hình 6. 2
: Autoclave công nghiệp

Autoclove được sử dụng trong bệnh viện cũng như phòng thí nghiệm. Nó dùng
để khử trùng ga trải giường, mền, thiết bị… Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm sử dụng
nó để khử trùng môi trường nuôi cấy VSV, diệt những VSV gây bệnh.
Autoclove cũng gặp một số vấn đề hạn chế ví dụ một số vật liệu bằng nhựa có
thể bị chảy ở nhiệt
độ cao, hình dạng của thiết bị có thể bị biến dạng. Hơn nửa nhiều
hóa chất bị biến tính trong quá trình khử trùng và những cơ chất dầu không được xử lý
khi chúng không hòa trộn trong nước. Thời gian khử trùng phải được phân biệt ở các
vật liệu khử trùng và từng dạng vật liệu khử trùng khác nhau nên khử trùng riêng lẻ.
Gần đây đã xây dựng một số dạng Autoclove mới gọ
i là prevacuum
Autoclove. Thiết bị này hút khí ra khỏi buồng khử trùng ngay khi khởi động, dòng hơi
nước bảo hòa trong buồng khử trùng được giữ ở nhiệt độ 132 - 134
0
C ở áp suất 28 -
30lb/in Thời gian khử trùng giảm xuống còn 4 phút. Sau khi việc khử trùng hoàn tất,
khởi động cột bơm hút nước ra khỏi buồng khử trùng và làm khô vật khử trùng. Tiện
lợi của thiết bị mới này là tiết kiệm thời gian khử trùng và giảm thời gian hoàn tất toàn
bộ quá trình (thời gian để thiết bị giảm áp suất, nhiêt độ…).
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 82

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


1.5 Phương pháp khử trùng Fraction
Trước khi có phát minh về Autoclove, người ta khử trùng những thiết bị và
dụng cụ khác bằng hơi nước ở 100
0
C và 30 phút trong 3 ngày liên tiếp. Phương pháp
này gọi là Fractional sterilization. Ở ngày đầu tiên của quá trình khử trùng bằng
phương pháp Fraction, các VSV sẽ bị giết chết ngoại trừ các bào tử. Sau một ngày ở
nhiệt độ thích hợp các bào tử sẽ phát triển thành VSV và sẽ bị khử ở ngày thứ hai.
Một lần nữa vật liệu khử trùng sẽ được làm sạch và một vài bào tử còn sót lại sẽ bị
giết chết vào ngày thứ Phương pháp này cũ
ng cho hiệu quả khử trùng tuy nhiên một
số bào tử mọc chậm không nảy mầm trong một vài ngày nên hiệu quả khử trùng sẽ
không đạt. Phương pháp này đòi hỏi bào tử phải được phát triển trên môi trường thích
hợp, ví dụ môi trường broth.
1.6 Phương pháp khử trùng Pasteur
Khử trùng Pasteur không có nghĩa chính xác là khử trùng vì mục đích của
phương pháp này là làm giảm số lượng của VSV trong dung dịch. Bào tử không bị
khử bằng phương pháp này. Phương pháp này được áp dụng để khử trùng các dung
dịch nhạy cảm với nhiệt độ, ví dụ sữa.
Một dạng khử trùng của Pasteur được gọi là holding method có điều kiện khử
trùng là 62,9
0
C trong 30 phút. Cho dù phương pháp này không thể giết vi khuẩn
thermophylic (chỉ có khả năng giết mesophylic và spychrophylic) nhưng loại vi khuẩn
này không có khả năng sống ở nhiệt độ cơ thể.
Dạng khử trùng Pasteur thứ hai là Flash Pasteurization ở 71,6
0

C trong 15 giây
và Ultrapasteurization ở 82
0
C trong 30 giây. Hai dạng này dùng để khử trùng thực
phẩm.
1.7 Khử trùng bằng dầu nóng
Một số nha sĩ và nhà vật lý sử dụng dầu nóng ở 160
0
C trong khoảng một giờ
để khử trùng thiết bị .
Phương pháp này có ưu điểm là dầu không làm rỉ kim loại do đó giảm khả
năng ăn mòn. Tuy nhiên sau khi khử trùng thiết bị phải được lau sạch và sấy khô hai
bước này có khả năng tái nhiễm VSV. Silicone đôi khi được thay thế dầu.
2. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG VẬT LÝ
2.1 Phương pháp lọc (Filtration)
Phương pháp lọc đã được sử dụng từ những năm 1890. Ban đầu được sử dụng
để hấp thu những VSV trong không khí và khử trùng môi trường nuôi cấy nhưng ngày
nay phương pháp dược sử dụng chủ yếu để tách virut ra khỏi những VSV khác.
Lọc là một kỹ thuật để tách vi khuẩn khỏi dung dịch. Dung dịch đi ngang qua
lớp vật liệu lọc, VSV sẽ được giữ lại trên lớp vậ
t liệu lọc, dung dịch nước đi qua vật liệu
sẽ được khử trùng hoặc giảm ô nhiễm.
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 83

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


Có nhiều phương pháp lọc được ứng dụng trong công nghệ vi sinh. Lọc vô cơ sành sứ
(thiết bị lọc nước uống), thủy tinh. Lọc hữu cơ có ưu điểm là những phân tử hữu cơ của
vật liệu lọc lôi cuốn (attach) những thành phần hữu cơ của VSV. Ví dụ lọc Berkefeld sử

dụng vật liệu lọc chế tạo từ tảo biển có tên gọ
i là tảo cát (Diatom). Tảo cát là tảo đơn
bào có rất nhiều ở biển là một thành phần quan trọng trong chuỗi thực phẩm.

Hình 6. 3:
Máy lọc
Lọc menbrane là phương pháp sử dụng rất rộng rãi. Được cấu tạo từ những chất
hữu cơ như cellose acetate, pholycarbonate. Phương pháp này có giá trị cao vì ta có thể
xác định được số lượng VSV trong dung dịch do vật liệu sau lọc có thể đặt trên môi
trường nuôi cấy, VSV sẽ phát triển thành những khuẩn lạc trên lớp vật liệu lọc và ta có
thể đếm được. Nếu lọc 100ml mẫu và thu được 59 khuẩ
n lạc, ta có thể kết luận là số
lượng VSV = 59/100ml.
Không khí cũng có thể được lọc sạch vi khuẩn nhờ phương pháp này.
2.2 Khử trùng bằng tia cực tím (Ultraviolet Light)
Ánh sáng thấy được là dạng radian năng lượng được phát hiện nhờ những tế bào
nhạy cảm của mắt. Chiều dài sóng của dạng năng lượng này là 400 - 800nm. Các dạng
radian khác có chiều dài sống dài hơn hoặc ngắn hơn khoảng thấy được do đó chúng
không được cảm nhận bằng mắt.

Hình 6. 4
: Máy sản xuất tia cực tím
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 84

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


Một dạng radian năng lượng là tia cực tím, tia cực tím được sử dụng khử trùng
một cách hữu hiệu. Tia cực tím có chiều dài sóng 100 - 400nm, với năng lượng bước
sóng khoảng 265nm khử hầu hết vi khuẩn .

Tia cực tím được sử dụng để làm giảm số lượng VSV ở những nguồn gây ô
nhiễm: bệnh viện, toilet, nhà ăn…Tia cực tím từ ánh sáng mặt trời là một nhân tố quan
trọng kiểm soát VSV trong không khí và trong lớ
p đất mặt nhưng không có khả năng
loại trừ bào tử. Bất lợi của tia cực tím là không có khả năng thâm nhập vào chất lỏng
hay chất rắn và chúng cũng là nguyên nhân gây bệnh về da của con người.
2.3 Các dạng tia khử trùng khác (Other Type of Radiaton)
Tia X và gamma là hai loại tia khử trùng. Cả hai đều có độ dài bước sóng ngắn
hơn tia cực tím. Các tia này khi chiếu vào VSV sẽ phá hủy protein và acid nucleic như
AND. Những vi khuẩn gram dương nhạy cảm hơn với các tia ion hóa này so với vi
khuẩn gram âm. Tia ion hóa được sử dụng để khử trùng các dược liệu nhạy cảm với
nhiệt như vitamin, hormon, các chất kháng sinh (antibiotic) cũng như plastic và chỉ
khâu vết thương.
Một dạng tia năng lượng khác là vi sóng (microwave) có bước sóng dài hơn tia
c
ực tím. Trong lò vi sóng, các vi sóng được hấp thu bởi phân tử nước. Các phân tử này
được thiết lập ở một tốc độ va chạm cao và nhiệt ma sát được đưa vào trong thực phẩm
làm thực phẩm nóng lên nhanh chóng.
Một dạng khử trùng nữa là tia ánh sáng gọi là tia lazer. Gần đây một số thực
nghiệm cho thấy rằng tia lazer có khả năng khử trùng thiết bị và không khí trong phòng
mổ cũng như VSV trên các vết thương. VSV có thể bị khử trong vài giây tuy nhiên để

đạt hiệu quả tia lazer phải chiếu lên toàn bộ vật liệu khử trùng.
2.4 Sóng siêu âm Ultrasonic Vibbration (U.V)
Ultrasonic Vibbration là một dạng sóng siêu âm có tần số cao hơn giới hạn nghe
được của con người. Khi sóng siêu âm chiếu thẳng xuống bề mặt của môi trường thì
chúng tạo ra một ít ảnh hưởng do tác động lên không khí và làm chúng võng xuống và
làm phân tán các rung động. Tuy nhiên khi chúng truyền trong chất lỏng, tia sóng là các
nguyên nhân tạo nên các bong bóng cực nhỏ làm cho nước có trạng thái sôi. Một số nhà
quan sát gọi hiện tựong này là “sôi lạnh”. Các bong bóng này nhanh chóng bị vỡ và tạo

nên dạng sóng va chạm mạnh. VSV tồn tại trong dung dịch bị
ảnh hưởng bởi áp suất
bên ngoài từ sự va chạm này.
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 85

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG



Hình 6. 5: Máy phát sóng siêu âm
Sóng siêu âm được sử dụng để phá vỡ mô tế bào và giữ một vai trò trong nghiên
cứu. Sóng siêu âm không được sử dụng nhiều để khử trùng vì chúng chỉ có khả năng
khử trùng chất lỏng. Tuy nhiên bệnh viện sử dụng sóng siêu âm để khử trùng máy móc
thiết bị.
3. CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN
Một số phương pháp vật lý khác không có mục đích khử trùng nhưng có mục
đích kiểm soát số lượng VSV trong thực phẩm.
3.1 Phương pháp làm khô
Sử dụng trong chế biến cá, thịt, thực phẩm…Như ta đã biết, nước là một nhân tố
quan trọng trong đời sống của VSV, nơi nào không có nước thì nơi đó không có sự
sống. Dựa vào nguyên tắc này để kiểm soát số lượng VSV bằng cách sấy khô thực
phẩm.
Bảo quản nhờ muối dựa trên nguyên tắc thẩm thấu. Khi thực phẩm được ướp
muối. Nước từ
trong tế bào VSV sẽ đi ra ngoài. Quá trình này gọi là quá trình thẩm
thấu. VSV sẽ chết khô không trao đổi chất được. Nguyên tắc này cũng thích hợp cho
môi trường chứa nồng độ đường cao.
3.2 Phương pháp hạ nhiệt độ
Giảm nhiệt độ như trong tủ lạnh, tủ đá có mục đích làm giảm tốc độ trao đổi
chất của VSV nghĩa là giảm tốc độ tăng trưởng của VSV. Tuy nhiên một số VSV vẫn có

thể tồn tại ở nhiệt độ thấp thậm chí ở điểm đóng băng. Những VSV này sẽ phát triển
nhanh chóng khi thực phẩm rã đông, do đó các thực phẩm này phả
i được nấu ngay sau
khi rã đông.

Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 86

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


Bảng 6. 1: Tóm tắt các tác nhân vật lý được sử dụng để kiểm soát VSV

Phương
pháp vật lý
Điều kiện Thiết bị
Mục đích
kiểm soát
Vật liệu khử
trùng
Lưu ý
Sử dụng ngọn
lửa trực tiết
1 vài giây Lửa
Tất cả
VSV
Dụng cụ phòng
thí nghiệp
Vật khử trùng phải
bền với nhiệt
Khí nóng

160
0
C trong 2
giờ
Lò nướng Bào tử VK
Dụng cụ thủy
tinh, bột
Không sử dụng cho
vật liệu lỏng
Nước sôi
100
0
C trong 10
phút hoặc
100
0
C trong 2
giờ

VSV trong
rau quả,
bào tử VK
Nhiều loại
Phải ngâm toàn bộ
vật khử trùng trong
nước sôi. Cần phải
làm sạch vật khử
trùng trước khi luộc
Áp suất hơi
121

0
C,15 phút
ở 15lb/in
2
Autolave Bào tử VK
Thiết bị, dung dịch,
môi trường nuôi
cẩytong ngành kỹ
thuật VSV
Khử trùng
fraction
30 phút/ngày
trong 3 ngày
Thiết bị
Arnold
Bào tử VK
Vật liệu không
khử trùng bằng
pp khác
Thời gian dài
Pasteur
62,9
0
C trong
30 phút 71,6
0
c
trong 15 giây
P_asteurizer
VSV gây

bệnh
Sản phẩm bơ
sữa
Khử trùng không
hoàn toàn
Dầu nóng
160
0
C trong 1
giờ
Bào tử VK Dụng cụ Cần rữa sạch dầu
Lọc
VSV không
qua được lổ lọc
Màng lọc
Berkefeld
và
membranc
Tất cả
VSV
Dung dịch Nhiều thao tác
Tia cực tím 265nm Đèn cực tím
Một số
VSV
Phòng nước
(mỏng)
Không có khả năng
thâm nhập vào chất
lỏng và rắn
4. CÁC NHÂN TỐ HÓA HỌC KHỬ TRÙNG QUAN TRỌNG

Các nhân tố hóa học dùng để khử trùng rất đa dạng, biến đổi từ một chất đơn
giản như ion halogen đến những chất phức tạp như chất tẩy rữa tổng hợp. Có nhiều chất
đã được sử dụng rộng rãi nhưng một số chất chỉ được sử dụng gần đây. Trong mục này
chúng tôi trình bày nhiều nhóm hóa chất và trình bày cách thức ứng dụng chúng trong
kiểm soát VSV.

Hình 6. 6
: Phun hóa chất khử trùng
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 87

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


4.1 Halogen
Halogen là một nhóm bao gồm các nguyên tố có hoạt tính cao, chúng có 7 điện
tích ở lớp ngoài cùng. Có 2 halogen là chlorine và iodine thường được sử dụng để khử
trùng .
Chlorine tồn tại dưới dạng khí hoặc tồn tại trong các hợp chất hữu cơ, vô cơ. Nó
được sử dụng rộng rãi trong xử lý nước cấp để giữ cho số lượng VSV ở một mức giới
hạn. Chlorine phản ứng với rất nhiều ion trong nước do
đó khi cho chlorene vào trong
nước phải đủ lượng để sau khi phản ứng với các ion trong nước, lượng chlorine còn lại
đủ để dảm bảo khử trùng. Lượng chlorine còn dư sau khi khử trùng khoảng 0,2-1ppm.
Chlorine cũng tồn tại dưới dạng sodium hypochlorine - NaOCl hay calcium
hypochlorine Ca(OCl). Sau này Semmelweis sử dụng chlorinated lime. Hợp chất
hypochlorite giải phóng chlorine trong dung dịch. Sodium hypochlorite 0,5% được sử
dụng để khử trùng vết thương trong chiến tranh thế giới lần hai. Hợp chất này vẫn được
sử
dụng rộng rải ở Châu Âu để khử trùng vết thương của vận động viên.
Sodium hypochlorite được sử dụng làm chất tẩy trắng trong công nghiệp Dệt. Để

khử trùng nước cấp, trung tâm bảo vệ và phòng tránh bệnh dịch đã khuyến khích sử
dụng nữa muỗng café sodium hypochlorite trong 2 gallon nước trong 30 phút trước khi
sử dụng. Hypochlorite cũng rất hữu hiệu ở nồng độ pha loãng để khử trùng các hồ bơi.
Và các thiết bị vệ sinh trong nhà máy.
Chloramine như chloramine-T là chất hữu cơ chứa chlorine. Hợp chất này giải
phóng Chlorine chậm hơn so với dung dịch chlorite nhưng ổn định hơn. Chúng được sử
dụng khử trùng vết thương và trị bệnh.
Chlorine tác động đến rất nhiều VSV bao gồm hầu hết các vi khuẩn gram âm và
gram dương và nhiều virut, nấm, Protozoa. Tuy nhiên không khử được bào tử. Đối với
VSV, halogen là nguyên nhân giải phóng nguyên tử oxy, oxy này kết h
ợp và làm bất
hoạt cytoplasma của protein trong enzyme. Một giả thuyết khác cho rằng chlorinelamf
thay đổi cấu trúc của màng membrane của tế bào.
Nguyên tố iod có tác động mạnh hơn một chút so với chlorine, chúng có hoạt
tính và sức diệt trùng cao hơn. Chúng có mặt rộng rãi trong tự nhiên, ví dụ các thực vật
ở biển như rong biển, trong các thực vật này chúng tồn tại trong các hợp chất hóa học.
Hợp chất iod hoạt động bằng cách halogen hóa phần tyrosine của phân tử protein.
Cồn thuốc iod được sử dụng để khử trùng vết thương bao gồm 2% iodine và
sidium iodine hòa tan trong ethyl alcohol. Để khử trùng nước cấp, dung dịch khử trùng
nước cấp gồm 5 giọt cồn iodine trong 1 lít Anh (141) nước, trong 30 phút trước khi sử
dụng. Hợp chất iod tồn tại dưới nhiều dạng dùng để khử trùng đồ dùng nhà bếp các
khách sạn và khử trùng dụng cụ thiết bị.
Iodphor là hợp chất tẩy rữa iodine chúng giả
i phóng iodine trong thời gian dài,
chúng có ưu điểm là không làm biến màu giấy và các công trình xây dựng. Hợp chất tẩy
rữa này có khả năng tách sinh vật ra khỏi bề mặt dính bám và sau đó halogen tiêu diệt
chúng. Một số dạng iodphor là Wescodyne dùng để lau da trước khi mổ. Ioprep để khử
dụng cụ mổ. Iosan để khử trùng hàng ngày và Betadine khử trùng vết thương. Iodphor
có thể kết hợp với phân tử không phải chất tẩy rữa. Dạng chất mang được sử
dụng nhiều

là providone giúp ổn định iod và giải phóng iod từ từ. Tuy nhiên chính vật mang này lại
không ổn định. Năm 1989, có 4 trường hợp bệnh do vi khuẩn ở màng bụng
Pseudomonas cepasia gây ra do sự tích tụ của providone – iodine.
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 88

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


4.2 Phenol và các hợp chất phenol
Phenol và các hợp chất của phenol giữ vai trò quan trọng trong lĩnh vực tẩy uế
từ những năm 1860 do Joseph Lister phát minh. Phenol là chất khử trùng chuẩn để so
sánh để so sánh với các chất khử trùng khác bằng hệ số phenol. Chúng tác động đến vi
khuẩn gram dương nhưng hoạt tính của chúng giảm khi có mặt của chất hữu cơ. Các
nhà sinh hóa cho rằng phenol làm kết tủa protein đặc biệt là màng tế bào.
Phenol đặc, có mùi hăng cay và ăn da do đó vai trò là chất kháng sinh củ
a
phenol bị hạn chế. Tuy dẫn xuất của nó là cresol có hoạt tính cao hơn và ít độc hơn các
hợp chất ban đầu của chúng. Hổn hợp ortho-, mata-, và para-cresol được dùng trong
thương mại gỗ cho các đường ray xe lửa, trụ hàng rào và các cột điện thoại.
Bisphenol là sự kết hợp của hai phần tử phenol dùng để khử trùng và tẩy uế.
Ortholphenylphenol dùng trong Lysol, Osyl, Staphene và Amphyl. Một dạng Bisphenol
khác là hexachlorophene được sử dụng rộng rãi vào những năm 1950 và 1960 trong sản
ph
ẩm kem đánh răng, chất khử mùi hôi nách và xà bông tắm. Một sản phẩm pHisoHex
kết hợp với hexachlorophene ở pH trung tính là kem giặt. Bác sĩ nhi dùng nó để ngăn
chặn sự phát triển của cầu khuẩn trên da đầu của trẻ sơ sinh. Tuy nhiên vào những năm
cuối của thập niên 1960 một số nghiên cứu đã cho thấy rằng với lượng thừa chất này có
thể hấp tụ vào da và làm phá hủy hệ thần kinh ở
chuột và do đó hexachlorophene đã bị
loại bỏ ra khỏi sản phẩm liên quan. pHisoHex vẫn tồn tại nhưng chỉ có trong đơn thuốc.

Mata bisphenol quan trọng là chlorhexidine. Hợp chất này được tổng hợp vào
năm 1976 bởi Bộ quản lí thực phẩm và dược phẩm dùng làm chất khử trùng da và rữa
tay. Dung dịch chlorhexidine 4% trong alcohol trong thương mại có tên gọi Hibiclens.
Hóa chất này tác động lên màng tế bào vi khuẩn (VK) gram dương và gram âm.
Chlohexidine 0,2% được sử dụng rộng rãi giúp chố
ng viêm lợi và viêm nướu răng. Tuy
nhiên có một số dấu hiệu cho thấy VK có thể phát triển trong đó.
Một dạng phenol khác là hexylresorcinol dùng làm chất súc miệng, chất khử
trùng. Dạng này có ưu điểm là làm giảm sức căng bề mặt do đó vi khuẩn bị tách ra khỏi
mô và giúp cho chất sát trùng dễ dàng thấm sâu vào.
4.3 Kim loại nặng
Thuật ngữ oligodynamic có nghĩa là năng lực nhỏ dùng để giải thích về hoạt tính
của kim loại nặng như mercury, silver và copper lên VSV. Những nguyên tố này gọi là
kim loại nặng vì khối lượng nguyên tử của chúng lớn và cấu hình điện tử phức tạp.
Thủy ngân là một loại chất khử trùng cổ truyền tồn tại dưới dạng mercury
chloride (HgCl
2
) được sử dụng bởi người Hy Lạp và La Mã để chữa bệnh về da. Tuy
nhiên thủy ngân rất độc đối với kí chủ và hoạt tính của mercury giảm khi có sự hiện
diện của chất hữu cơ. Một số sản phẩm như Mercurochrome, Merthiolate, Methphen là
do mercury kết hợp với vật liệu mang, những hợp chất này ít độc khi khử trùng da đặc
biệt sau khi mổ. Merthiolate được sử dụng như
chất bảo quản vaccin.
Đồng tác động lên những vi sinh vật chứa chlorophyll và đặc biệt ảnh hưởng đến
tảo. Copper sulphate (CuSO
4
) dùng để khử nước trong hồ bơi và trong nước cấp.
CuSO
4
kết hợp với vôi (CaCO

3
) để tạo thành bluish - white Bordeux mixture, hợp chất
này được sử dụng từ năm 1882 dùng để khử nấm.
Bạc tồn tại dưới dạng nitrate bạc (AgNO
3
) dùng làm chất khử trùng và diệt
khuẩn. Ví dụ nhỏ một giọt nitrate bạc 1% vào mắt trẻ sơ sinh để tránh bị nhiểm bệnh do
Neissria gonorrhoeae gây ra. Vi khuẩn gram âm Diplococcus có thể là nguyên nhân gây
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 89

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


bệnh mù mắt cho trẻ sơ sinh trong giai đoạn khi đi ngang qua cổ tử cung. Năm 1884,
Karl S.F Crede sử dụng nitrate bạc để phòng tránh những bệnh về mắt. Với mục đích
khử trùng , hợp chất bạc được sử dụng với mục đích khử trùng vết khâu khi mổ. Kim
loại nặng rất nhạy với protein đặc biệt là nhóm sulfhydryl (-SH) và chúng làm kết dính
các phần tử protein bằng các cầu nối . Do protein là những enzyme do
đó quá trình
chuyển hóa cellose bị bất hoạt và làm cho VSV chết. Tuy nhiên kim loại nặng không
ảnh hưởng đến bào tử.
4.4 Alcohol (rượu)
Rượu khử trùng da và có thể tẩy uế một số thiết bị y tế. Trong thực tế thường sử
dụng ethyl alcohol. Ethy alcohol tác động lên các tế bào sinh trưởng của vi khuẩn gồm
cả Tuber Bacilus nhưng không tác động đến bào tử. Nó làm biến tính protein và hòa tan
lipid, tác động này có thể dẩn đến hiện tượng các tế bào của màng membrane không liên
kết với nhau. Ethyialcohol cũng là một tác nhân khử nước mạnh.
Do ethyl alcohol phản ứng ngay với bất kì ch
ất hữu cơ nào do đó những thiết bị y tế hay
những thiết bị đo nhiệt phải được làm sạch trước khi làm sạch bằng rượu. Người ta

thường sử dụng dung dịch cồn 50 -80% để tránh bay hơi và đủ thời gian để thấm vào
mô. Với dung dịch cồn 70% trong 10 phút đủ để khử trùng thiết bị.
Cồn được sử dụng để bảo quản mỹ phẩ
m khử trùng da trước khi tiêm. Chúng có
chức năng là tẩy vi khuẩn ra khỏi da và hòa tan lipid làm sạch da. Isopropyl alcoholcos
hoạt tính cao ở 99%. Methyl alcohollaf chất độc cho mô tế bào nên ít được sử dụng.
5. CÁC NHÂN TỐ HÓA HỌC KHÁC
5.1 Formaldehyde
Formaldehyde tồn tại ở dạng khí ở nhiệt độ cao và dưới dạng rắn ở nhiệt độ
thấp. Hòa tan 37 gram formaldehyde trong 100ml nước ta được dung dich formalin.
Qua nhiều thế kỹ formal dehyde được sử dụng bảo quản các mẫu xét nghiệm, tẩm liệm
cũng như mục đích khử trùng. Đối với nghành VSV học, formaldehyde dùng để bất
hoạt virus trong vaccine.
Dưới dạng khí, formaldehyde được thổi vào các ngăn kín để khử trùng dụng cụ

mổ, áo blue và thiết bị y khoa. Tuy nhiên do thấm không tốt nên thời gian khử trùng
phải kéo dài 12 giờ để đảm bảo hiệu quả. Thiết bị có thể khử trùng bằng cách nhúng vào
dung dịch formaldehyde 20% và alcohol 70% trong 18 giờ. Tuy nhiên formaldehyde
còn dính lại trên thiết bị do đó cần phải làm khô trước khi sử dụng. Tiếp xúc với hợp
chất này dể bị dị ứng.
Formaldehyde là một ankal nó phản ứng với nhóm amino hay nhóm hydrocid
của nhóm acid nucleic và protein với nhóm carbonxyl và sulfhydryl của protein bằng
cách g
ắn thêm vào một sườn nhỏ carbon (nhóm ankyl) và hình thành một cầu nối giữa
các nhóm. Sự thay đổi cấu trúc ảnh hưởng đến tính chất hóa học của chất hữu cơ do đó
làm cho vi sinh vật chết.
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 90

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

5.2 Ethylene Oxyde (EtO)
Sử dụng vật liệu bằng plastic trong thí nghiêm vi sinh cần phải chuẩn bị một
phương pháp khử trùng thích hợp đối với những vật liệu nhạy cảm với nhiệt. Vào những
năm 1950 các nhà khoa học đã phát hiện ra chất khử trùng ethylen oxyde (EtO) mà có
thể sử dụng đĩa petry và ống tiêm plastic.
Ethylen oxyde là một phân tử nhỏ có khả năng thấm tốt và có thể khử bào tử.
Tuy nhiên, nó độc và dễ nổ. Khả
năng nổ của nó sẽ giảm nếu trộn chung với frezon
trong cryoxyde hoặc carbon dioxyde trong carboncide tuy nhiên nó vẫn độc đối với
những người làm việc với nó. Khi được đưa vào buồng khử trùng kín và ở đó chúng di
chuyển tuần hoàn trong 4 giờ với sự kiểm soát chặt chẽ ẩm độ. Sau đó buồng khử trùng
phải được bơm khí trơ từ 8 - 12 giờ nhằm đuổi hoàn toàn EtO, nếu không nguyên tố này
có th
ể làm cháy da người ta gọi là cháy “lạnh”.
Ethylrn Oxyde được sử dụng để khử trùng giấy, da, len, kim loại, cao su và
plastic. Trong bệnh viện Ethylen oxyde được khử trùng ống thông đường tiểu, van tim
nhân tạo, thiết bị quang học. Cơ quan không gian NASA sử dụng khí này đầu mang khí
cụ khoa học. Buồng khử trùng bằng ethylen oxyde trở thành bản sao của Autoclave.
Thường được gọi là Autoclave khí.
Một dạng liên quan là Beta – Propiolactone (BPL) ít gây nổ so với ethylen
oxyde tuy nhiên khả năng thấm hạn chế. Dướ
i dạng lỏng chúng dùng để khử trùng
vaccine, chai serume và chỉ khâu khi mổ. Tuy nhiên các nhà khoa học đã cho thấy rằng
đây là một chất gây ung thư do đó nó chỉ được sử dụng trong một số trường hợp nhất
định.
5.3 Glutaraldehyde
Glutaraldehyde là một trong những chất lỏng có hiệu quả khử trùng cao nhất.
Phân tử nhỏ này giết chết tế bào sinh dưỡng trong 10 – 30 phút và bào tử trong 10 giờ.
Glutaraldehyde là một ankyl thường dùng dưới dạng dung dịch 2%. Nó dùng để khử

trùng vật liệu được tiền làm sạch, ngâm vật liệu vào dung dịch 10 phút, rữa lại bằng
nước vô trùng làm khô trong buồng làm khô bằng khí vô trùng và trữ trong buồng vô
trùng để đảm bảo vật liệu được vô trùng. Nếu các bước thao tác này đượ
c thực hiện liên
hoàn vật liệu có thể được tẩy uế chứ chưa có nghĩa là khử trùng.
Do hoạt tính của Glutaraldehyde không bị giảm khi có sự hiện diện của chất hữu
cơ. Hóa chất này thường được dùng khử thiết bị mổ nơi thường có sự hiện diện của
máu. Hơn nữa Glutaraldehyde không phá vỡ những vật liệu mỏng do đó được dùng để
khử trùng nhữ
ng thiết bị quang học. Tuy nhiên Glutaraldehyde bốc khói khó chụi và
phải rữa lại vật khử trùng bằng nước tiệt trùng. Ở pH = 7,5 Glutaraldehyde giết S.aureus
trong 5 phút và M.tuberculois trong 10 phút.
5.4 Hydrogen Peroxyde (H
2
O
2
)
Hydrogen Peroxyde dùng để rữa vết thương, vết xước hoặc trầy da. Vùng nổi
bọt và sùi bong bóng trong vết thương do Hydrogen Peroxyde bị bẻ gảy thành oxygen
và nước. Dạng oxygen mới hình thành này rất độc với vi sinh vật. Vi khuẩn kỵ khí rất
nhạy cảm với H
2
O
2
vì oxygen ức chế sự phát triển của chúng.
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 91

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

Một dạng H
2
O
2
mới là Super Hydrogen Peroxyde, dạng này nó ổn định hơn do đó nó
không tự ý phân hủy. Nhưng nguyên tố vô sinh như tròng mắt contact lenses, đồ dùng
nhà bếp, những dụng cụ nhựa nhạy cảm với nhiệt và dụng cụ chế biến thực phẩm có thể
được khử trùng trong 30 phút. Sự khử trùng cũng đạt yêu cầu trong 6 giờ với dung dịch
pha loãng 6%. Các nhà vi sinh vật học dùng H
2
O
2
để khử trùng VSV trong sữa và các
sản phẩm sữa
5.5 Xà bông và chất tẩy rữa
Xà bông là hợp chất hóa học gồm các acid béo, kết hợp với potassium hoặc
sodium hydroxyde. pH của hợp chất này khoảng 8 và sự phá vỡ cấu trúc của VSV là do
tính kiềm được thiết lập trên da. Tuy nhiên hoạt động chính của xà phòng là tách vi
khuẩn ra khỏi da như là một chất khủ trùng.
Xà phòng là một nhân tố ướt, chúng chuyển thành dạng sữa và chúng hòa tan
những hạt dính chắc trên da làm giảm sức căng bề mặt và làm tăng hoạt tính làm sạch.
Chất t
ẩy rữa là một hóa chất tẩy rữa tổng hợp có hoạt tính cao. Và là nhân tố làm
giảm sức căng bề mặt. Chúng hoạt động và bám lên nhóm phosphate của màng
membrane.
Chất tẩy rữa amonic tạo ra ion âm trong dung dịch. Chúng tác động lên vi khuẩn
gram dương nhưng những vi khuẩn gram âm gây ảnh hưởng khả năng của chúng.
Các chất tẩy rữa khác là cationic tạo ion dương. Các dẫn xuất của amonium
chloride này chứa 4 gốc hữu cơ thay vì hydro và ít nhất mộ
t gốc là nhóm mạch dài

alkyl. Nhóm amonium dương tính được cân bằng bởi các ion âm chloride. Các hợp chất
này được gọi là hợp chất ammonium bậc.
Những hợp chất tẩy rữa dương tính có tên dài và phức tạp như Benzalkonium
Chloride trong Zephiran và Cetylpyridinium Chloride trong Ceepryn. Các chất tẩy rữa
khác được sử dụng trong Phemerol và Diaparene. Chất tẩy rữa dương tính là chất kháng
khuẩn trong phạm vi rộng, đặc biệt đối với vi khuẩ
n gram dương. Chúng được sử dụng
như tác nhân khử trùng thiết bị công nghiệp và đồ dùng chế biến thực phẩm, khử trùng
da, nước xúc miệng và dung dịch bảo quản Contact Lenses và khử trùng tường và sàn
bệnh viện. Tuy nhiên, khi trộn với xà phòng nó bị giảm hoạt tính và một số loại vi
khuẩn gram âm như Pseudomonas Aeruginosa có thể phát triển được.
5.6 Thuốc nhuộm
Thuốc nhuộm được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh như một tác nhân nhuộm
màu khi phân lập vi khuẩn từ một hổn hợp vi khuẩn. Nhóm thuốc Triphenylmethan
cũng được sử dụng như một nhân tố kháng Bacillus và Staphylococcus. Nhóm này gồm:
Malachite Green và Crystal Violet.
Nhóm thuốc nhuộm Acridine gồm Acriflavine và Proflavine. Cả hai đều được
xem như là chất kháng sinh được sử dụng để khử trùng vết thương. Chúng tác
động trực
tiếp đến ADN làm ngăn chặn sự tổng hợp ARN.
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 92

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


5.7 Acid
Acid cũng được sử dụng như một chất khử trùng. Các loại phổ biến là: benzolic,
salicylicvà undecylenic.
Acid hữu cơ được sử dụng trong bảo quản thực phẩm ví dụ bảo quản những thực
phẩm lên men như phômai, sốt mayonaire và những sản phẩm chua như dưa chua. Acid

propionic được cho vào các sản phẩm bánh mì để giữ cho số lượng vi sinh vật ở mức
thấp.
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 93

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


BÀI THỰC HÀNH
VI SINH MÔI TRƯỜNG 2

1. Tổng số sinh viên:___; được chia thành __ nhóm; mỗi nhóm chia thành __ nhóm
nhỏ; mỗi nhóm nhỏ có ___ sinh viên.
2.
Thời gian thực tập:
3.
Giáo viên hướng dẫn:
Thiết Bị
¾
1 Autoclave
¾ 2 tủ ấm
¾ 1 tủ sấy
¾ 1 phễu lọc
¾ 5 kính hiển vi
¾ 4 bếp điện + 4 ca nhôm chưng cất cách thuỷ
¾ 1 cân phân tích
Dụng Cụ Mỗi Nhóm
¾ 2 đèn cồn
¾ 1 viết aceton
¾ 1 khăn lao
¾ 1 chai nước cất

¾ 1 giá đựng ống nghiệm
¾ 1 giá treo pipet
¾ 1 bóp cao su
¾ 2 que cấy vi khuẩn
¾ 1 kẹp giấy (dùng để gắp giấp lọc, quấn nút gòn)
¾ Giấy gói dụng cụ, gòn và thun, cồn, ống duham
¾ Nhắc sinh viên mang theo giấy vẽ (A
4
) và bút chì.







Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 94

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


BÀI 1: GIỚI THIỆU

1. Mục đích
- Quan sát các loại bùn xử lý nước thải
-
Pha chế môi trường nuôi cấy Vi sinh vật
2. Ý nghĩa:
¾
Nhận biết các loại bùn xử lý nước thải

¾ Nhận biết phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
3. Quan sát các loại bùn xử lý nước thải
¾ Bùn septic
¾ Bùn hạt
¾ Sử dụng mắt thường, kính hiển vi quan sát thô, kính hiển vi quan sát bùn nghiền
với nước cất.
4. Pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật
¾
Pha chế môi trường PCA
9 300 ml
9 Berker 500 ml: 2
9 Ống đong 500 ml
9 Đũa thủy tinh: 2
9 Ống nghiệm: 30
9 Bông gòn, thun, giấy gói.
9 Thao tác
• Cân bột agar PCA:___g
•
Đong nước cất: 300 ml
•
Khuấy cho bột tan đều
•
Đặt berker lên bếp điện, khuấy đều tay cho đến khi dung dịch trong suốt.
•
Bắt berker khỏi bếp điện, để 10 phút
•
Chế môi trường vào các ống nghiệm: 10 ml
•
Đậy nút gòn, gói giấy.
•

Hấp khử trùng ở 121
0
C, 1 atm, trong 15 phút
¾ Pha chế môi trường BGBL
9 300 ml
9 Berker 500 ml: 2
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 95

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


9 Ống đong 500 ml
9 Đũa thủy tinh: 2
9 Ống nghiệm: 30
9 Bông gòn, thun, giấy gói.
9 Thao tác
• Cân bột agar PCA:___g
•
Đong nước cất: 300 ml
•
Khuấy cho bột tan đều
•
Đặt berker lên bếp điện, khuấy đều tay cho đến khi dung dịch trong suốt.
•
Bắt berker khỏi bếp điện, để 10 phút
•
Chế môi trường vào các ống nghiệm: 10 ml
•
Đậy nút gòn, gói giấy.
•

Hấp khử trùng ở 121
0
C, 1 atm, trong 15 phút
¾ Pha chế môi trường Les Endo Agar
9
300 ml
9 Berker 500 ml: 2
9 Ống đong 500 ml
9 Đũa thủy tinh: 2
9 Ống nghiệm: 30
9 Bông gòn, thun, giấy gói.
9 Thao tác
• Cân bột agar PCA:___g
•
Đong nước cất: 300 ml
•
Khuấy cho bột tan đều
•
Đặt berker lên bếp điện, khuấy đều tay cho đến khi dung dịch trong suốt.
•
Bắt berker khỏi bếp điện, để 10 phút
•
Chế môi trường vào các ống nghiệm: 10 ml
•
Đậy nút gòn, gói giấy.
•
Không hấp khử trùng.
5. Bài thu hoạch
¾
Nhận xét các loại bùn xử lý nước thải

¾ Nhận xét phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật.


Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 96

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


BÀI 2: KIỂM TRA TỔNG SỐ VI KHUẨN

1. Mục Đích
Xác định tổng số vi khuẩn trong mẫu nước sông
Xác định tổng số
coliform trong nước thải nhà máy
Quan sát, vẽ hình và phân loại nguyên sinh động vật trong nước rửa rau xà lách.
2. Ý Nghĩa
Biết được các phương pháp nuôi cấy
Nhận xét các loại mẫu thí nghiệm: loại mẫu, mức ô nhiễm dự đoán suy ra từ cảm
quan và từ vị trí lấy mẫu…
3.
Kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mẫu nước sông.
¾ Sử dụng phương pháp đếm đĩa
¾ Môi trường PCA: Plate Count Agar
¾ Dụng cụ và vật liệu (cho từng nhóm nhỏ):
9 Ống nghiệm pha loãng mẫu: 5
9 Pipet: 10 ml: 1 & 1 ml: 5
9 Đĩa petri lớn: 2 x 4 = 8
¾ Thao tác
9 Pha loãng mẫu: 10
-1

, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
, 10
-5

9 Hút bằng pipet (10 ml) 9 ml nước cất cho vào mỗi (5) ống nghiệm.
9 Hút 1 ml mẫu nước cống cho vào ống nghiệm thứ nhất ta được mẫu pha
loãng 10
-1

9 Lắc đều ống nghiệm 10
-1
, hút 1 ml cho vào ống nghiệm 10
-2

9 Tiếp tục như vậy ta được các mẫu pha loãng với tỉ lệ cần thiết.
¾ Đun cách thuỷ các ống nghiệm đựng môi trường đến khi môi trường chảy lỏng.
¾ Để nguội môi trường đến 45
0
C: độ nóng có thể chấp nhận được khi dùng tay
nắm pipet
¾ Hút 1 ml mẫu và nhỏ vào pipet, đặt nghiêng pipet 1 góc 45
0
so với phương
ngang của pipet
¾ Đổ ống nghiệm chứa môi trường đã nguội ở 45

0
C vào pipet
¾ Đóng nắp pipet, đặt xuống mặt bàn và xoay ngược và xuôi chiều kim đồng hồ: 5
vòng
¾ Chờ cho môi trường nguội và đông đặc
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 97

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


¾ Lật ngược petri, ghi chú thích: loại mẫu, pha loãng, ngày nuôi cấy, người nuôi
cấy.
¾ Ủ trong 24 – 28 -72 giờ.
4. Kiểm tra tổng số Coliform trong mẫu nước thải nhà máy.
¾ Phương pháp MPN
9
Môi trường BGBL
9 Mỗi nhóm 18 ống môi trường
9 Ống nghiệm pha loãng: 5
9 Pipet: 10 ml:1 & 1 ml: 5
9 Thao tác
• Thao tác pha loãng như trên
•
Môi trường gồm 9 ống nghiệm chứa BGBL (chứa ống duham)
•
Chia 9 ống môi trường thành 3 nhóm với kí hiệu 10
-1
, 10
-2
, 10

-3

•
Ở nhóm 10
-1
, hút 1 ml mẫu pha loãng 10
-1
cho vào mỗi (3) ống nghiệm.
Tương tự nhóm 10
-2
, 10
-3

•
Đậy nắp gòn, gói giấy mỗi 9 ống và đem vào tủ ấm.
•
Với nuôi cấy Coliorm: nhiệt độ là 37
0
C
•
Với nuôi cấy Coliorm phân: nhiệt độ là 44 – 45
0
C
•
Ủ trong 24 – 48 – 75 giờ.
¾ Phương pháp lọc
9 Giấy lọc: 4 miếng
9 Môi trường nuôi cấy Les Endo Agar: 4 ống nghiệm
9 Petri nhỏ: 4
9 Pipet sử dụng chung với bài PP.MPN

9 Mẫu pha loãng: sử dụng chung với bài PP.MPN
9 Thao tác:
• Chưng cách thuỷ môi trường thạch Les Endo Agar
•
Để nguội 45
0
C và đổ vào đĩa petri
•
Chờ cho môi trường nguội và đông đặc
•
Dùng giấy lọc đặt trên phuễ lọc, bề sạc hướng lên trên, bật máy bơm hút
•
Hút 1 ml mẫu, nhiễu từng giọt, đều, lên trên bề mặt của giấy lọc
•
Chờ cho giấy lọc khô
•
Dùng kẹp gắp tờ giấy lọc đặt lên trên mặt thạch, bề sọc hướng lên trên
•
Ghi chú lên trên đĩa petri
Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 98

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


• Gói đĩa và đem đĩa vào tủ ấm ở nhiệt độ 37 – 45
0
C
•
Ủ trong 24 – 48 – 72 giờ
5. Quan sát, vẽ hình và phân loại nguyên sinh động vật trong nước rửa rau xà

lách
¾
Kính hiển vi
¾ Lam, lammen
¾ Nước rửa rau xà lách
¾ Giấy vẽ (A
4
), bút chì
¾ Thao tác:
9 Dùng đũa thuỷ tinh lấy một giọt nước rau xà lách cho lên lam, đậy lammen
lên trên giọt nước.
9 Xem mẫu dưới kính hiển vi, vật kính 10x
9 Nhận dạng và quan sát tất cả các dạng nguyên sinh động vật có trong mẫu
nước
9 Vẽ hình và tra bảng xác định chủng loại nguyên sinh động vật
6. Bài thu hoạch
¾ Trình bày thao tác tiến hành các phương pháp nuôi cấy.
¾ Nêu nhận xét các loại mẫu thí nghiệm: loại mẫu, mức ô nhiễm dự đoán suy ra từ
cảm quan và từ vị trí lấy mẫu…
¾ Trình bày các hiện tượng đã xảy ra trong quá trình phân tích để có thể giải thích
kết quả. VD: ống BGBL có bọt hoặc ống duham có bọt, quên đóng nắp petri,
bông gòn để xuống mặt bàn, quên ghi hiệu pipet, thao tác quá xa đèn cồn, cháy
bông gòn…
Vẽ hình và phân loại nguyên sinh động vật trong nước rửa rau xà lách.

Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 99

TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Ross E Mckinney.1962 Microbiology for Sanitary Engineers.McGraw –
Hill book company. Inc.
Giáo trình.1994.Các quá trình vi sinh vật trong các công trình cấp thoát nước.
Trường đại học xây dựng.
Odum.1976.Vi sinh vật học. Nhà xuất bản giáo dục.
Anthony F Guady, Jr.1980.Microbiology for environmental scientists and
engineer. McGraw – Hill book company, Inc.
Hans G Schlegel.1997. General Microbilogy. Cambridge University Press.
Nguyến Lâm Dũng .2002. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản giáo dục.
Christopher K mathews et all.2000.Biochemistry. Addison – Wesley Publishing
Company.


Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 100