BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ THU NHẬN SILYMARIN VÀ TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM) TRỒNG Ở VIỆT NAM." pptx

NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CƠNG NGHỆ THU
NHẬN SILYMARIN VÀ TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO
TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM) TRỒNG Ở
VIỆT NAM.

Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Quốc Khang
Khoa Sinh học– Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Hà
nội
Lê Thị Lan Oanh, Nguyễn Thị Tố Nga, Nguyễn Thị
Ngọc Dao
Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội

I. ĐẶT VẤN ĐỀ.

Cây Cúc gai (Silybum marianum) thuộc họ Cúc Asteraceae,
là cây thảo 1-2 năm, ra hoa vào năm thứ 2, nguyên liệu
dùng sản xuất thuốc là hạt quả hoặc toàn cây. Cây phát
triển chủ yếu ở châu Âu, châu Phi, Nam Mỹ, Trung và
Đông Á .


Đây là một cây thuốc có giá trị cao, để điều trị các bệnh
hiểm nghèo về gan thận, hiện đang phổ biến ở nước ta. Do
đó việc khai thác phát triển sử dụng cây Cúc gai đã được di
thực trồng ở Việt Nam để sản xuất các chế phẩm thuốc
chữa bệnh gan thận trong nước tạo nguồn dược phẩm quí,
mới, phong phú và rẻ tiền phục vụ bảo vệ sức khoẻ cộng
đồng là một vấn đề đang được quan tâm và rất cấp thiết.

Cây cúc gai đã được du nhập vào trồng ở Việt Nam từ lâu,
hiện nay đang phát triển tốt tại các vùng cao có đất tốt và

khí hậu mát mẻ như: Tam Đảo, Sapa,…; lượng dược liệu
này nhu cầu ngày càng gia tăng. Do đó chúng tơi thực hiên
đề tài nêu trên, nhằm góp phần phát triển, mở rộng và làm
phong phú nguồn dược liệu của đất nước.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.1. Đối tượng:

- Hạt Cúc gai được dùng trong thí nghiệm có nguồn gốc từ
cây Cúc gai trồng ở Cộng hoà liên bang Đức (CHLB Đ) và


cây trồng ở Sapa Việt Nam. Hạt được sấy khô.

Lá, thân và quả Cúc gai thu được từ cây Cúc gai trồng thử
nghiệm tại Hà Nội vào tháng 4-5 khi quả bắt đầu chín và lá
đã ngả hơi vàng . Các bộ phận được thái lát, sấy ở nhiệt độ
dưới 60OC đến khô và nghiền nhỏ thành bột mịn.

- Các hố chất khác dùng dưới dạng sạch phân tích (pa.)
của các hãng Sigma và Merk.

Hình 1. Cây Cúc gai đang phát triển

Hình 2. Cây Cúc gai đang ra hoa


2.2. Phương pháp nghiên cứu:

- Nghiên cứu tỷ lệ nảy mầm hạt.Hạt Cúc gai được gieo trên
giấy lọc bão hoà nước trong hộp Petri. Mỗi công thức nhắc
lại 3 lần, mỗi lần gieo 100 hạt để trong tối hoàn toàn và ở
các nhiệt độ 15, 25 và 35OC. Tỷ lệ nảy mầm được theo dõi
qua các thời đIểm 3, 5 và 7 ngày.

- Định tính các nhóm chất hữu cơ trong các bộ phận cây
bằng các phương hố lý thơng thường và thuốc thử hoá học
đặc hiệu .

- Chiết rút phân đoạn flavonoit theo phương pháp Talli .

- Nghiên cứu thành phần hoá học bằng phương pháp sắc ký
lớp mỏng (SKLM), sắc ký lỏng cao áp (HPLC),…

Nuôi cấy mô rễ, thân và lá để tạo sinh khối.


III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Nghiên cứu công nghệ nhân giống nguyên liệu ở các
vùng sinh thái khác nhau và công nghệ tạo sinh khối tế
bào Cúc gai:

Để thực hiện các vấn đề đặt ra, cần nghiên cứu Cúc gai một
cách hệ thống từ việc tạo giống và nguyên liệu bằng qui
trình nhân giống trồng đại trà ở các vùng sinh thái thích
hợp và ni cấy tạo sinh khối đến nghiên cứu thành phần
hoá học Cúc gai trồng tại Việt Nam, qui trình cơng nghệ
chiết rút các chất có hoạt tính và sản xuất các chế phẩm

thuốc để thử nghiệm. Qua nhiều thăm dị, thử nghiệm,
chúng tơi đã thành cơng qui trình cơng nghệ, tóm tắt như
sau:

3.1.1. Sự nảy mầm hạt Cúc gai.

Bước đầu chúng tôi tiến hành khảo sát sự nảy mầm của hạt
Cúc gai từ cây trồng ở Việt nam (VN) và ở Cộng hoà liên
bang Đức (Đức).


Hạt cúc gai được sấy khô đạt độ ẩm 9-10% và tiến hành thí
nghiệm. Hạt được gieo trên giấy lọc thấm nước cất trong
hộp petri, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần gieo 100
hạt, để trong tối và ở các nhiệt độ 15, 25 và 35OC . Số hạt
nảy mầm được theo dõi sau 3, 5 và 7 ngày. Kết quả trình
bầy trong bảng 1.
Bảng 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian nảy mầm
của hạt Cúc gai

Nhiệt độ tối ưu khoảng 25OC, hạt Cúc gai Đức nảy mầm
sau 7 ngày, như vậy nhiệt độ đóng vai trị quan trọng trong
q trình nảy mầm hạt Cúc gai. Các hạt Cúc gai sau nẩy
mầm được nhân trong các chậu thí nghiệm và phát triển
bình thường như đã trình bày ở hình 3 dưới đây:


Hình 3. Cây Cúc gai từ hạt Cúc gai Đức (1) và hạt Cúc gai
VN (2)

3.1.2. Thử nghiệm trồng Cúc gai.

Cúc gai đẫ được trồng tại Sapa trong nhiều năm qua do khí
hậu thích hợp với lồi cây ơn đới này và cho hàm lượng
hoạt chất không kém Cúc gai của (CHLB Đ).

Chúng tôi thử nghiệm trồng Cúc gai trong điều kiện đồng
bằng tại Hà Nôi, ở ngoại thành Hà Nội trên diện tích vườn
50m2 và tại Trung Tâm Giống cây thuốc thuộc Viện Dược
liệu, cũng đã thử nghiệm trồng Cúc gai tại An Khánh,
Thường Tín cho thấy Cúc gai có thể trồng trong điều kiện
khí hậu ở Hà Nội, cho hoa và quả trong năm thứ 1. Tuy


nhiên cần xác định thời vụ trồng thích hợp là từ tháng 10
năm trước đến tháng 5 năm sau vào vụ Thu Đơng , cần
phân tích đánh giá sản lượng, hàm lượng và chất lượng
thuốc của hạt Cúc gai trồng trong những điều kiện trên
trong năm 2002. Hiện nay chúng tôi đã cho trồng thử
nghiệm lại đồng thời tại Sapa và tại Trung tâm Cây thuốc,
cây Cúc gai đã được gần 3 tháng tuổi. cây sinh trưởng
tốt.(hình 1 và 2).

3.2. Thử nghiệm nuôi cấy mô tế bào.

Với độ nảy mầm tốt chúng tôi tiến hành nuôi cấy mô rễ
Cúc gai tạo sinh khối tế bào trong phịng thí nghiệm. . Hiện
nay mới bắt đầu thực hiện nội dung trên, đã thử nghiệm cho
hạt cúc gai nảy mầm trong điều kiện vô trùng và thử nuôi
cấy mô lá, thân và rễ. Bước đầu đẫ tìm được mơi trường

thích hợp và đã tạo được mô sẹo của các khối mô trên cho
2 giống Cúc gai của Đức và Việt Nam. Quá trình tạo mô
sẹo diễn ra qua các bước sau:

3.2.1. Các bước khử trùng hạt và nẩy mầm:


Kết quả của bước này trải qua các công đoạn sau:

- Ngâm hạt và rửa nước cất 3 lần

- Lắc trong ethanol 70% trong thời gian 1 phút, sau đó lắc
trong nước gia ven 50% trong thời gian 20 phút

- Rửa lại nước cất nóng ấm 3 lần

- Cuối cùng cấy hạt vào trong bình có chứa mơi trường cho
hạt nảy mầm.

Thành công là::

+ Hạt nảy mầm đạt kết quả 100%

+ Môi trường cho hạt nảy chồi tốt ký hiệu là T/2

3.2.2. Tạo mô sẹo từ lá và rễ của cây cúc gai


Có thể tóm tắt như sau:

- Sau khi hạt nảy mầm thành cây con hồn chỉnh, chúng tơi
tiếp tục cắt mảnh lá và mảnh rễ để đưa vào môi trường tạo
mơ sẹo.

- Sau thời gian 1 tháng bắt đầu hình thành mơ sẹo

- Đối với lá mơi trường thích hợp cho việc tạo mơ sẹo có
ký hiệu là: TM1, đối với rễ là mơi trường có ký hiệu TMS

- Sau khi mơ sẹo đã được hình thành, sau nhiều thăm dị và
thử nghiệm trên các mơi trường khác nhau điển hình thì
mơi trường phù hợp cho việc ni cấy mơ sẹo là 141 và
MSD2.

Những kết quả này được phản ảnh rõ nét qua các ảnh chụp
sau.


Hình 4. Tạo mơ sẹo từ thân cây Cúc gai

Hình 5. Mô sẹo từ lá cây Cúc gai trên môi trường 141

Hình 6. Mơ sẹo từ rễ cây Cúc gai trên môi trường 141


Hình 7. Tạo mơ sẹo từ lá Cúc gai trên mơi trường MT1

Hình 8. Ni mơ sẹo từ lá Cúc gai trên mơi trường MT1

3.3. Xây dựng qui trình thu nhận Silymarin qui mơ phịng

thí nghiệm:

Qui trình thu nhận silymarin từ hạt cây Cúc gai có thể trình
bầy tổng qt trong sơ đồ sau:

-Đã chọn được hệ dung mơi thích hợp và ít độc để chiết rút
thu nhận Silymarin làm thuốc qui mơ phịng thí nghiệm.
Hiệu suất thu nhận chế phẩm này so với phương pháp phân
tích định lượng. Qui trình này với quy mơ Pilot 20 lit- có
hàm lượng 2,12% trọng lượng khơ. Như vậy hiệu suất thu
được Silymarin của quy trình là 87% so với phân tích định


lượng.

Kết quả đã thu được 20 gam Silymarin tinh khiết. Kết quả
phân tích trên SKLM cho 4 vết đậm trên sắc ký đồ có Rf
(0,40; 0,46; 0,55 và 0,58) gần giống với giá trị Rf của 4
thành phần Silymarin của Bungary làm chất chuẩn.

Chế phẩm Carsil và hai chế phẩm VN1 và VN2 tách chiết
bằng 2 hệ dung môi khác nhau được phân tích thành phần
trên máy HPLC.
Bảng 4. Kết quả phân tích trên máy HPLC .

Mẫu Silymarin của Bungary có 6 peak đặc trưng và chiếm
tới 88,7% tổng số chế phẩm đưa vào phân tích, mẫu
Silymarin thu được (từ hạt Cúc gai VN1 và VN 2) của

chúng tôi cũng có 6 peak tương tự và chiếm tới 93,3 81,2% tổng số mẫu đưa vào phân tích. Như vậy các thành


phần chính của Silymarin thu được từ các mẫu của chúng
tôi đều giống thành phần Silymarin dùng làm thuốc của
Bungary.

Tuy nhiên tỷ lệ các peak trong 3 mẫu có khác nhau. Thành
phần peak 4 của Silymarin Bungary có hàm lượng cao nhất
chiếm tới 29,9%, trong khi đó peak này ở chế phẩm
Silymarin VN 1 thu được chiếm có 7,8%, nhưng peak 2
chiếm tới 44,9%, còn peak2 của Silymarin Bungary chỉ
chiếm 11,6% và của chế phẩm Silymarin VN2 là 17,4 và
38,0% .

Thành phần Silymarin Cúc gai VN 1 và VN 2 có thành
phần tương đương nhau, như vậy có thể dùng cả 2 loại
dung mơi được thí nghiệm để thu nhận Silymarin. Chúng
tôi đang tiến hành để tách từng peak và phân tích thành
phần hố học và tính chất của chúng, trong các cơng trình
tiếp sau.

IV. KẾT LUẬN


1. Đã nghiên cứu sự nẩy mầm hạt Cúc gai từ hạt đã sấy khơ
dưới 60OC, cịn 9-10% ẩm độ. Sau đó khử trùng và đưa vào
mơi trường nẩy mầm thích hợp ( T/2 ). Kết quả hạt nẩy
mầm đạt 63,34 – 78,93% ở 25OC, sau 7 ngày.

2. Đã thành cơng qui trình tạo mơ sẹo từ lá, thân và rễ Cúc
gai trong các môi trường khác nhau là:lá và thân trong mơi
trường thích hợp là TM1 và cho rễ là môi trường là TMS
Đồng thời cũng đã lựa chọn được mơi trường thích hợp để
ni mơ sẹo phát triển thành cây là 141 và MSD2.

3. Tiến hành qui trình sản xuất cây Cúc gai thành công trên
thực địa trong điều kiện mơi trường có nhiệt độ cao ở Hà
nội

4. Xây dựng qui trình thu nhận Silymarin từ cây Cúc gai
qua các bước:Bột nguyên liệu  Loại chất béo  Chiết rút
bằng etylacetat  Đuổi dung môi  Tinh chế lại  Chế
phẩm Silymarin. Chế phẩm thu được có hiệu xuất khai thác
cao và chất lượng tốt tương tự Silymarin của Bungary,
được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký


lỏng cao áp (HPLC).

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1.

Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Quốc Khang, Đào Kim

Nhung (1977)- Thực tập Sinh hoá, Đại học Tổng hợp Hà
nội.
2.

Đào Kim Nhung (1996)- Luận án PTS. Khoa Sinh

học, ĐHTH Hà nội.
3.

Võ Văn Chi (2000)- Từ điển cây thuốc Việt nam.

NXB Y-học Hà nội, tr. 339
4.

Carsil, a product with confirmed effectivenes in toxic,

metabolic and degenerative diseases of the hepatic
parenchyma, 2000, Sopharma, Bungary.
5.

Flora K., Hahn M. Rosen H, Benner K. (1999)- Milk

thistle (S. marianum) for the therapy of liver diseases. Am.
J. Gastroenterol. 94 (2), 545 – 546.
6.

Amirghofran Z., Azadbakht M., Karimii MH (2000).-

Evaluation of the immunomodulatory effects of five herbal
plants. J. Ethnopharmacol 72 (1-2), 167-172.
7.

Luper S. (1998)- A review of plants used in the

treatment of liver disease. Altern Med. Rev 3 (6), 410-421.
8.

Syed AH. Et al. (2002). Contemporary role and future

propects of medicinal plants. TelMedPak.
9.

Alikaridis F. (2000)- Hairy root’s Silybum marianum

biosynthesis. Fitoterapia, 379 –384.

SUMMARY:

Study on extraction procedure of flavolignans silymarin
and production of biomass from milk thistle sylibum
marianum grown in viet nam.
Germination process of the dryed under 60oC seeds from
milk thistle (Silybum marianum) growing in Vietnam was
investigated. The results showed that 63,34 – 78,93% of the
seeds were germinated at 25OC after 7 days.

The procedure of callus culture of leaves, stem and roots in
different mediums was completted. The suitable medium
for leaves and stem callus formation was TM1, and for root
callus formation was TMS. The mediums 141 and MSD2


were suitable for plant formation from callus.

The production of milk thistle in field was carried out. Milk
thistle could grow in higher temperature condition of
Hanoi.

The 20 litre volume extraction procedure of flavolignans
Silymarin from the plant was done with two solvent
systems (VN1 and VN2) with following steps: Material
powder  lipid removal  etylacetat extraction  solvent
evaporation  refinement  Silymarin preparation.

The obtained bioactive preparation had good quantity with
2,12% per dry weight and quality as Silymarin drug of
Bulgaria (Carsil) analyzed by High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) and Think Layer
Chromatography (TLC) techniques.

The components Silymarin from VN1 and VN2 are similar,
so both solvents can be used to obtain Silymarin.


The obtained preparation Silymarin should be a promising
component of a drug using for treatment of liver diseases.

Người thẩm định nội dung khoa học: PGS. Trịnh Đình Đạt.