BÁO CÁO KHOA HỌC: "ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG AZOTOBACTER" pot

ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG
AZOTOBACTER

Ngô Tự Thành , Vũ Thị Minh Đức
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội
Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Quyên
Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Việt Nam

Hiệu quả tốt của việc xử lý hạt bằng huyền dịch
Azotobacter trước khi gieo trồng đã được ghi nhận từ lâu
[8]. Sở dĩ như vậy là do Azotobacter có khả năng cố định
nitơ, tiết vào môi trường các vitamin, axit amin cũng như
các chất kích thích sinh trưởng thực vật (axit indol axetic,
gibberelic) [5, 8].

Gần đây một số tác giả [4, 6] đã phân lập, tinh chế và mô tả
một số đặc tính của enzym từ Azotobacter sp. GD1 có khả
năng phân giải 2,4, 6 – trichlorophenol (một hợp chất độc,
gây kích thích, tác nhân gây ung thư, nguy hiểm đối với
môi trường sống). Nghiên cứu này nhằm vào các đặc tính
sinh học của một số chủng Azotobacter mới phân lập, có so
sánh với A. chroococcum AT19 nhập nội.

I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vi sinh vật: Azotobacter chroococcum AT19 nhập nội được
sử dụng làm chủng đối chứng. Các chủng Azotobacter được
phân lập từ đất của các vùng chuyên canh rau màu, trên
môi trường Burk. Việc phân lập được tiến hành với hai lô
đất: lô được giữ nguyên độ ẩm ban đầu và lô được hong
khô ở nhiệt độ phòng rồi nghiền mịn.

Xác định khả năng cố định nitơ

Khả năng này được xác định bằng cách đo hoạt tính
nitrogenza theo phương pháp khử axetylen, trên máy sắc ký
khí PYE UNICAM series 204 chromatograp (Anh).

Xác định axit indol-3- axetic (IAA)

Tiến hành theo chỉ dẫn của [7]. Chủng được cấy vào bình
nón chứa 50 ml môi trường Burk có chứa tryptophan 0,1%,
nuôi trên máy lắc 200 vòng/phút ở 300C trong 5 ngày. Li
tâm loại bỏ tế bào. Lấy 2 ml dịch trong thêm vào ống
nghiệm chứa sẵn 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến, lắc đều.
Để ở nhiệt độ phòng 30 phút. So mầu ở bước sóng 530 nm.
Hàm lượng IAA được tính toán dựa theo đồ thị chuẩn.

Xác định khả năng phân giải 2,4 dichlorophenoxyacetate
(2,4D)

Trước khi cấy vi khuẩn, 200 mg 2,4D được thêm vào 1 lít
môi trường vô trùng có hàm lượng glucoza ở các mức 0, 5,
10, 15, 20 g/lít. Nuôi lắc 200 vòng/phút trong 5 ngày. Li
tâm lạnh 6500 vòng/phút trong 15 phút. Dịch trong được
lọc qua phiến lọc khuẩn 0,2 m vô trùng để loại hết tế bào
còn sót lại. Đo phổ hấp phụ trên thiết bị tử ngoại – khả biến
– hồng ngoại gần ( UV – VIS – NIR – Scanning
spectrophotometer UV 3101 PC) (Shimadzu – Jp). Đối
chứng là dịch nuôi vi khuẩn nhưng không bổ sung 2,4D và
dịch môi trường có bổ sung 2,4D nhưng không cấy vi

khuẩn. Hàm lượng 2,4D được tính theo đồ thị chuẩn đã xác
định trên máy ở bước sóng 283 nm [1].

Xác định ảnh hưởng của dịch nuôi Azotobacter spp. tới
sự nảy mầm ở hạt ngô

Hạt giống ngô tẻ P.11 và ngô lai ĐK.888 được khử trùng
bằng HgCl
2
0,1% trong 4 phút. Rửa lại bằng nước cất vô
trùng nhiều lần. Ngâm hạt trong nước cất vô trùng từ 3 đến
4 giờ. Sau đó ủ hạt với dịch vi sinh vật đã li tâm loại bỏ tế
bào (pha loãng tỷ lệ 5%) ở 30
0
C trong 2 ngày.

Thí nghiệm ở quy mô chậu vại với rau cải trắng

Thí nghiệm được tiến hành trong 2 vụ đông xuân và hè thu.
Mỗi chậu chứa 7kg đất. Nền phân bón 40 N: 80 P
2
O
4
: 40
K
2
Ô. Công thức thí nghiệm được bón thêm 107 tế bào
Azotobacter /chậu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau 45
ngày trồng, thu hoạch và đánh giá theo các chỉ tiêu: số
lá/chậu, khối lượng tươi thân lá, chiều cao cây, % vật chất

khô. Hàm lượng vitamin C, đường tổng số và hàm lượng
NO
3
-
được xác định tại Trung tâm kiểm tra và tiêu chuẩn
hoá chất lượng nông sản thuộc Viện sau thu hoạch.

II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Phân lập Azotobacter spp. từ các mẫu đất

Từ 13/38 mẫu đất hong khô và 6/12 mẫu đất giữ nguyên độ
ẩm đã phát hiện sự có mặt của Azotobacter. Tuy nhiên các
chủng thu nhận từ đất khô tồn tại tốt trong điều kiện nuôi
cấy nhân tạo. Các chủng phân lập từ đất ẩm dễ bị chết sau
một thời gian dài bảo quản trong ống nghiệm và dễ bị nhầm
lẫn với Azomonas (loại vi khuẩn cố định nitơ hình dạng
giống Azotobacter nhưng không hình thành bào nang). Để
tăng tính chọn lọc, việc hong khô đất ở nhiệt độ phòng
trước khi phân lập Azotobacter là cần thiết.

Việc phân tích pH cho thấy Azotobacter thường có mặt ở
các mẫu có độ pH 5,15 - 7,75, chứ không ở các mẫu có pH
thấp hơn. Theo một nghiên cứu trước đây [9] thì
Azotobacter thường tồn tại trong đất có pH axit yếu đến
kiềm.

2. Phản ứng khử axetylen – etylen (acetylene reduction
assay – ARA)

Trong số các chủng phân lập được, chúng tôi đã phát hiện 3
chủng có hoạt tính ARA cao hơn so với chủng đối chứng là
A.chroococcum AT 19 từ 17,0 - 56,78 nM C
2
H
4
/ml/h,
tương ứng với 13,7 – 45,49%. Kết quả được trình bầy ở
bảng 1.

3. Khả năng tổng hợp axit indol – 3 – axetic (IAA)

IAA là một hocmôn sinh trưởng thực vật thuộc nhóm
auxin. Nguồn nguyên liệu giàu IAA là các phần non và hạt
của cây. Một số vi khuẩn cũng có khả năng tổng hợp loại
auxin này. Chúng tôi phát hiện 3 chủng có hoạt tính ARA
cao nói trên cũng có khả năng tổng hợp IAA. Đối chứng là
chủng A. chroococcum AT. 19. Kết quả được trình bầy ở
bảng 1.
Bảng 1. Hoạt tính ARA và khả năng tổng hợp IAA của 3
chủng phân lập

4. Sự phân giải 2,4 dichlorophenoxyaxetat (2,4D)

2,4D là một trong các chất trừ cỏ dại có cơ chế tác dụng
gần giống hoạt động của auxin, như IAA. Dưới tác động
của 2,4D, thực vật phát triển với tốc độ nhanh bất thường
và bị chết. Lợi dụng đặc tính kích thích sinh trưởng thực
vật, nhiều người trồng rau đã phun 2,4D với liều lượng thấp
khiến rau trở lên xanh non hấp dẫn người tiêu dùng. Tuy

nhiên, cũng như các chất chlorophenoxy khác, 2,4D là chất
độc đối với mắt (nhóm độc 1), độc qua đường ruột và ở
dạng sữa (nhóm độc 3). Thêm vào đó thời gian tự phân huỷ
của 2,4D kéo dài tới 3 tháng [2, 3, 10].

Tìm hiểu khả năng phân giải 2,4D thương phẩm của chủng
Azotobacter sp. 86.2, chúng tôi nhận thấy với 2,4D
(200mg/l) là nguồn cacbon duy nhất, chủng sinh trưởng rất
yếu. Việc bổ sung 5, 10, 15, 20g/l glucoza tạo điều kiện tốt
cho tế bào phát triển và lượng 2,4D còn sót lại tương ứng
với lượng glucoza được bổ sung nói trên là: 179,5; 127,7;
145,8; 156,9mg/l. Như vậy chủng 86.2 có khả năng phân
giải yếu 2,4D, và khi có bổ sung glucoza vào môi trường
thì khả năng này tăng lên, đạt cực đại ở nồng độ glucoza
10g/l, sau đó giảm ở các lượng glucoza cao hơn. Phổ hấp
phụ của 2,4D trong các mẫu nuôi cấy được quét trên thiết
bị tử ngoại – khả biến – hồng ngoại gần được trình bầy ở
hình 1.

5. Ảnh hưởng của dịch nuôi tới sự nẩy mầm của hạt ngô

Sau khi ngâm ủ với dịch nuôi cấy pha loãng 5%, chúng tôi
nhận thấy dịch nuôi các chủng 86.2; 76.6; 20.2 đều kích
thích sự nảy mầm của hạt ngô (bảng 2). Với ngô lai
ĐK.888 tỷ lệ nảy mầm tăng từ 8,57 – 14,29% so với đối
chứng ngâm ủ bằng nước. Tỷ lệ nảy mầm ở ngô tẻ P.11
tăng 5,71%. Đặc biệt chủng 86.2 làm tăng sự nảy mầm của
hạt ngô lai ĐK. 888 lên 2,86% so với chủng A.
chroococcum AT. 19 (chủng đối chứng). Kết quả được
trình bầy ở bảng 2.

Hình 1. Lượng 2,4D còn lại trong các mẫu nuôi cấy

A. Mẫu đối chứng C. Mẫu bổ sung
glucoza 10g/l
B. Mẫu bổ sung glucoza 5g/l D. Mẫu bổ sung
glucoza 20g/l
Bảng 2. Ảnh hưởng của dịch nuôi Azotobacter spp. đến sự
nảy mầm của hạt ngô



6. Năng suất và chất lượng rau cải trắng được bón
Azotobacter sp.

Thí nghiệm được tiến hành ở quy mô chậu vại. Ngoài nền
phân NPK, mỗi chậu được bón thêm 107 tế bào
Azotobacter sp. Sau 45 ngày, năng suất cũng như chất
lượng rau cải trắng được kiểm tra. Kết quả trình bầy ở bảng
3 và 4 dưới đây.
Bảng 3. Năng suất rau cải trắng khi được bón thêm
Azotobacter sp.


Kết quả trên cho thấy, ở công thức bón chủng 86.2, 76.6,
20.2, ở cả 2 vụ (xuân và hè thu) đều cho năng suất rau cao
hơn công thức đối chứng (không bón vi sinh vật) và tương
đương với công thức bón chủng AT.19 (chủng đối chứng).
Chất lượng rau cải trắng được bón thêm Azotobacter sp.
được trình bầy ở bảng 4.

Bảng 4. Chất lượng rau cải trắng khi được bón thêm
Azotobacter sp.



Theo kết quả phân tích trên đây của Trung tâm kiểm tra và
tiêu chuẩn hoá chất lượng nông sản, Viện sau thu hoạch,
chất lượng rau ở các công thức bón 86.2, 76.6, 20.2 đều rất
tốt. Đặc biệt hàm lượng nitrat thấp hơn so với ở rau đối
chứng.

III. KẾT LUẬN

1. Từ 19/50 mẫu đất đã phát hiện thấy sự có mặt của
Azotobacter. Phần lớn chúng có mặt ở các mẫu đất có pH
5,15 – 7,75.

2. Đã tuyển chọn được 3 chủng Azotobacter sp. 86.2, 76.6,
20.2 sinh trưởng ổn định, có hoạt tính ARA và tổng hợp
IAA cao hơn chủng nhập nội A. chroococcum AT. 19.

3. Ba chủng này đều kích thích sự nảy mầm của hạt ngô lai
ĐK.888 và ngô tẻ P.11 cũng như tăng năng suất và cải
thiện chất lượng rau cải trắng. Đặc biệt chủng 86.2 có khả
năng phân giải 2,4D, khả năng này được tăng cường khi
chủng được nuôi trên glucoza ở nồng độ 10g/l, so với ở các
nồng độ khác.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Cason R. and Reed L.W., 1977: Chemistry of two clay
systems and three phenoxy herbicides. Proc. Okla. Acad.
Sci., 57: 116 - 118.
2. Casarett and Doull's toxicology, 1999: The basic science
of poisons, fifth edition, companion handbook. Klaasen C.
D. and Watkins III J.B. (ed) McGraw - Hill: 561- 564.
3. Donnelly P.K., Entry J.A. and Crawford D.L, 1993:
Degradation of Atrazine and 2,4-Dichlorophenoxyacetic
acid by Mycorrhizal Fungi at Three Nitrogen
Concentrations In Vitro, Appl. Environ. Microbiol., 59:
2642 – 2647.
4. Latus M., Seitz H.J, Eberspacher J.V Lingen R.,
1995:Purification and Characterization of Hydroxyquinol
1,2 - Dioxygenase from Azotobacter sp. Strain GP1 Appl.
Environ. Microbiol., 61: 2453 – 2460.
5. Lee M., Breckenridge C. & Knowles R., 1970: Effect of
some culture conditions on the production of indole-3-
acetic acid and a gibberellin-like substance by Azotobacter
vinelandii, Can.J. Microbiol.,16: 1225 – 1330.
6. Li D. Y., Eberspacher J., Wagner B., Kuntzer J. &
Lingens F., 1991: Degradation of 2,4,6- trichlorophenol by
Azotobacter sp.strain GP1. Appl. Environ. Microbiol. 57:
1920 - 1928.
7. Misra S. & Kaushik B.D., 1989: Proc. Indian natn. Sci.
Acad., 55: 449 – 504.
8. Subba Rao N.S., 1980: Azotobacter inoculant. in:
Biofertilizers in Agricultures, 2nd edition, Oxford & IBH.
9. Tchan Y.T. & Peter D., 1984: Genus Azotobacter. in:
Bergey's manual of Systematic Bacteriology.1. Krieg N.R.
& Holt H.G (ed), Williams & Wilkins: 220 - 231.

10. Trần Quang Hùng, 1991: Thuốc trừ dịch hại bảo vệ cây
trồng. Cục trồng trọt và bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp
và CNTP: 142 - 128.


SUMMARY

Biological properties of some Azotobacter strains

Ngo Tu Thanh, Vu Thi Minh Duc
Hanoi University of Science
Nguyen Ngoc Quyen, Nguyen Thu Ha
Vietnam Agricultural Science Institute

From 50 soil samples, 18 Azotobacter strains were isolated.
All of them were isolated from soil samples having pH
values from 5.15 to 7.75. In the soils having lower pH,
Azotobacter was not found. Drying soil samples seemed to
be a good improvement of the isolation: perhaps the
selectivity of the soil was increased, a beneficial result to
Azotobacter, while Azotomonas was killed because of
lacking in cysts.

Among the isolated strains, 3 strains ( N˚ 86.2, 76.6 and
20.2) were selected because of their good properties:
having activity of acetylene reduction assay(ARA) and
activity of producing indole-3-acetic acid (IAA) – a plant
hormone of auxin group. The first activity of these 3 strains
was of 181.58, 141.90 and 167.55 nM C
2

H
4
/ml/h,
respectively. The second one was of 7.57, 9.50 and 5.73
mg/ml, respectively. Both activities ARA and IAA of these
3 strains were greater than those of Azotobacter
chroococcum AT 19 – a imported strain used in microbial
inoculant production.

The strain 86.2 was able to decompose the herbicide 2,4
dichlorophenoxy acetate (2,4D). It is interesting, although
its activity was not very high.

The bio-assay showed that the culture supernatant liquor of
all three isolated strains stimulated the germination of
maize grains. The grain germination proportion of the
maize race P11 was increased by 5.71%, and of the maize
hybrid race DK888 (difficult to be germinated ) – by 8.57
to 14.11% in comparison with the control (grains incubated
with water).

On pot-scale, in both harvests (spring and summer), in all
the soil formulae for inoculation with three above strains,
the Chinese cabbage (Brassica chinensis) productivity was
higher than that of control without inoculation. The quality
of this vegetable was clearly improved: the contents of total
sugar and vitamin C were higher than those of control,
while the NO3- amount was decreased.

With the above properties, all the 3 selected strains were

considered suitable for the production of microbial
inoculant. It is necessary to evaluate the effectiveness of the
strains on vegetable yield on field-scale.

Người thẩm định nội dung khoa học: GS.TS. Nguyễn Đình
Quyến.