BÁO CÁO KHOA HỌC: "ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG VÀ TUỔI PHÔI ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CÂY TỪ PHÔI NON DÒNG NGÔ NHẬP NỘI HR8, HR9" pdf

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƯỜNG VÀ TUỔI PHÔI ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI
SINH CÂY TỪ PHÔI NON DÒNG NGÔ NHẬP NỘI
HR8, HR9

Phạm Thị Lý Thu, Phạm Minh Thợi, Lê Huy Hàm, Đỗ
Năng Vịnh
Viện Di truyền nông nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khả năng tái sinh của cây trồng nói chung phụ thuộc nhiều
vào kiểu gen của thực vật. Đối với cây ngô, vấn đề tái sinh
gặp rất nhiều khó khăn, ngoại trừ một số dòng có khả năng
tái sinh cao, được sử dụng làm vật liệu chuyển gen như:
A188, H99, HiII…hầu hết các dòng ngô khác có khả năng
tái sinh kém (1). Mặt khác, khả năng tái sinh còn phụ thuộc
vào môi trường nuôi cấy và một số yếu tố khác. Việc
nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy và
tái sinh ở cây ngô còn hạn chế.

Trong khuôn khổ bài báo này chúng tôi trình bày kết quả
nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và
tuổi phôi nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây
từ phôi non trên cơ sở các dòng ngô nhập nội có khả năng
tái sinh cao HR8 và HR9. Hai dòng ngô này có nguồn gốc
ôn đới, đã được trồng và xác định thời vụ sinh trưởng thích
hợp trong điều kiện Việt nam (10).

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Các dòng ngô được sử dụng trong nghiên cứu gồm: hai
dòng ngô nhập nội HR8 và HR9 là 2 dòng có khả năng tái
sinh cao, do Viện Công nghệ liên bang Thuỵ sỹ ETH cung
cấp
Cây ngô mẹ cho bắp thí nghiệm được trồng trong nhà lưới
từ tháng 10/2000 đến tháng 4/ 2003.

Phương pháp

Bắp non sau khi thụ phấn khoảng 18-24 ngày được thu để
tách phôi. Mẫu bắp thí nghiệm được giữ ở 40C thời gian từ
2-10 ngày trước khi tách phôi.

Khử trùng bề mặt ngoài của bắp bằng ethanol 70
0
, bóc bỏ
các lá bao ngoài và tách phôi trong điều kiện vô trùng.

Phôi non được cấy trong môi trường nuôi cấy với phần tế
bào vảy hướng lên trên, phần trụ phôi tiếp xúc với bề mặt
môi trường (Green and Phillips, 1975).

Các phôi có kích thước khác nhau (từ 0,5-3mm) được sử
dụng trong thí nghiệm. Mật độ cấy 15 phôi/đĩa Petri chứa
8mml môi trường. .Mỗi công thức thí nghiệm được làm với
12 đĩa, tương ứng với 180 phôi tách từ 3 bắp.

Môi trường nuôi cấy

Hai loại môi trường cơ bản được sử dụng:

- Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962)

- Môi trường N6 (Chu et al., 1975)

bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng và một số phụ gia
khác tuỳ từng giai đoạn nuôi cấy (theo Armstrong and
Green, 1985 có cải tiến):

• Môi trường tạo mô sẹo: gồm 2 môi trường khác nhau về
thành phần khoáng và vitamin

- Môi trường CMS: môi trường MS bổ sung 20 g/l sucrose,
2 mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline
và 10mg/l AgNO
3
.

- Môi trường CN6: môi trường N6 bổ sung 20 g/l sucrose,
2 mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline
và AgNO3 nồng độ từ 0-30mg/l.

• Môi trường tái sinh chồi (SM): môi trường N6 bổ sung 60
g/l sucrose, 2 g/l myo-inositol.

• Môi trường kéo dài chồi và tạo cây hoàn chỉnh (RM): môi
trường 1/2MS bổ sung 20 g/l sucrose, 1 g/l myo-inositol.

Tất cả các môi trường đều sử dụng chất giá thể là phytagel

0,2%, có pH=5,8.

Điều kiện nuôi cấy

Mẫu được nuôi ở nhiệt độ 26
0
C  2. Đối với giai đoạn tạo
mô sẹo và mô sẹo phôi hoá mẫu phôi non được nuôi cấy
trong tối thời gian từ 2-3 tuần. Để tái sinh chồi và tạo cây
hoàn chỉnh mô sẹo phôi hoá được nuôi cấy trong điều kiện
chiếu sáng thời gian 8-10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng
1200-1600 lux.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Ảnh hưởng của nitrat bạc lên khả năng tạo mô sẹo và tái
sinh cây dòng HR8

Bắp non dòng HR8 sau khi thụ phấn 18-20 ngày được thu
để tách phôi. Các phôi có kích thước khoảng 1-2 mm được
chọn và nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo CN6 có bổ
sung AgNO
3
nồng độ từ 0-30mg/l (các phôi có kích thước
lớn hoặc nhỏ hơn đều bị loại bỏ). Kết quả thu được trình
bày ở bảng 1 và hình 1.
Bảng 1. Ảnh hưởng của AgNO3 đến khả năng tạo mô sẹo
và tái sinh cây dòng HR8

Kết quả bảng 1 cho thấy phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh
cây dòng HR8 được cải thiện một cách rõ rệt khi bổ sung
AgNO
3
nồng độ 1-15mg/l vào môi trường nuôi cấy: tỷ lệ
tạo mô sẹo tăng từ 56,6% lên 85,5%, tỷ lệ tái sinh cây tăng
từ 18,6% lên 22,6% (trong môi trường không có và có
1mg/l AgNO
3
). Tần số tạo mô sẹo và tái sinh cây đạt giá trị
tương đối cao (từ 85.5% - 90.5% và 22.6% - 26.6%) và
thay đổi không đáng kể khi bổ sung 5-15 mg/l AgNO
3
vào
môi trường nuôi cấy. Song, ở nồng độ 10mg/l AgNO
3
thì
khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 đạt giá trị
lớn nhất (90.5% và 26.6%) và giảm dần khi tăng nồng độ
AgNO
3
từ 20mg/l lên 30mg/l.

Hình 1. Ảnh hưởng của AgNO
3
đến khả năng tạo mô sẹo
và tái sinh cây dòng HR8

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của AgNO
3
đến sự hình thành
mô sẹo từ phôi non dòng B73 (Songstad et al. 1991), từ hoa
non dòng HiII (Songstad et al. 1992) và từ phôi non dòng
A188 (Vain et al. 1989) các tác giả cũng có nhận xét tương
tự (7, 8, 11).

Từ kết quả thu được này chúng tôi chọn môi trường tạo mô
sẹo CN6 có bổ sung10mg/l AgNO
3
để nghiên cứu tiếp ảnh
hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy và nitrat bạc
đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8.

Ảnh hưởng của thành phần môi trường và nitrat bạc lên
khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8

Phôi non dòng HR8 có kích thước khoảng 1-2 mm được
chọn và nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo có thành phần
khoáng và vitamin khác nhau (MS hoặc N6) bổ sung
10mg/l AgNO
3
. Kết quả thu được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường và AgNO
3

đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh dòng HR8

Trong thí nghiệm này chúng tôi quan sát thấy mô sẹo bắt
đầu xuất hiện sau 1-2 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, chúng tôi
chưa quan sát được sự khác biệt về mặt hình thái giữa các
loại mô sẹo tạo thành ở giai đoạn này. Vì thế mẫu được cấy
chuyển sang môi trường mới và sự hình thành các dạng mô
sẹo khác nhau cũng như khả năng tạo mô sẹo đã được quan
sát rất rõ sau 1-2 tuần nuôi cấy tiếp theo (hình 4A, 4B, 4C).
Kết quả bảng 2 cho thấy có sự khác biệt không đáng kể về
khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 khi nuôi cấy
trong môi trường có thành phần khoáng và vitamin khác
nhau: a) Tỷ lệ tạo mô sẹo: đạt 69,4 % và 60,0%, b) Tỷ lệ tái
sinh cây: đạt 18,5 % và 20,8% trong môi trường MS và N6
không bổ sung AgNO
3
tương ứng. Tần số tạo mô sẹo và tái
sinh cây của phôi nuôi cấy trong môi trường MS và N6 có
bổ sung 10mg/l AgNO
3
cũng đạt kết quả tương tự.

Hình 3: ẢNh hưởng của thành phần môi trường và AgNO
3

đến khả năng tái sinh dòng HR8


Sự có mặt của AgNO
3
trong môi trường nuôi cấy đã cải

thiện rõ rệt khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng ngô
HR8. Tỷ lệ tạo mô sẹo tăng từ 69,4% lên 88,8% (môi
trường MS) và 60,0% lên 90,5% (môi trường N6) khi nuôi
cấy trong môi trường không có và có bổ sung AgNO
3

tương ứng (hình 3). Tần số tái sinh đạt giá trị cao nhất khi
nuôi cấy trong môi trường CN6 có bổ sung 10mg/lAgNO
3
.
Điều này có thể được giải thích là do AgNO
3
kích thích quá
trình tạo mô sẹo bằng cách ngăn cản sự hình thành ethylen
nội sinh (tạo ra bởi sự tổn thương của các mẫu nuôi cấy và
quá trình nuôi cấy in vitro) (Songstad et al, 1992).

Ảnh hưởng của tuổi phôi (kích thước phôi) lên khả năng
tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8

Phôi non ở các độ tuổi khác nhau 16, 18, 20, 22 và 24 ngày
(phôi có kích thước từ 0,5-5mm tương ứng) được cấy trên
môi trường tạo mô sẹo CN6 bổ sung 10 mg/l AgNO
3
. Sau
2-3 tuần nuôi cấy chúng tôi đã quan sát thấy sự sinh trưởng
và hình thái của khối tế bào mô sẹo tạo thành từ các phôi có
kích thước khác nhau rất khác nhau. Kết quả được trình bày
ở bảng 3 và hình 4.
Bảng 3. Ảnh hưởng của tuổi phôi (kích thước phôi nuôi

cấy) lên khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8



Hình 4. A. Phôi nuôi cấy; B, C. Mô sẹo và mô sẹo phôi hoá
tạo thành từ phôi non; D. Cây tái sinh; E, F, G. Mô sẹo tạo
thành từ phôi nuôi cấy có kích thước 0,5; 1-2 và 3 mm
tương ứng;


Đối với các phôi nuôi cấy ở độ tuổi 16 ngày sau thụ phấn
(có kích thước 0,5mm) khối tế bào mô sẹo tạo thành rất
nhỏ, sinh trưởng chậm và có dạng nhầy (hình 4E). Khi tái
sinh chúng tạo thành cụm chồi với các chồi không hữu
hiệu, sức sống kém và ít rễ. Tỷ lệ tạo mô sẹo và tái sinh cây
thấp đạt 29,4% và 11,3%.

Bên cạnh đó thì khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ các
phôi non ở độ tuổi 18-20 ngày (có kích thước khoảng 1-
2mm) là tương đối tốt. Sau 7-10 ngày trên bề mặt của mẫu
nuôi cấy đã xuất hiện các khối mô sẹo dạng hạt nhỏ, xốp,
có màu trắng ngà (hình 4F). Khối tế bào này sinh trưởng rất
nhanh, sau vài lần cấy chuyển đã phát triển thành các phôi
dạng hình cầu (hình 4C). Các tế bào phôi này được tách ra
một cách dễ dàng, phát triển thành cây hoàn chỉnh (hình
4D). Tỷ lệ tạo mô sẹo và tái sinh cây đạt 54,4-83,3% và
17,7-26,6%.
Ngược lại, với các phôi nuôi cấy ban đầu ở độ tuổi trên 20
ngày (có kích thước 3mm) thì khả năng tạo mô sẹo rất
kém, tế bào phôi nuôi cấy phồng to lên, rễ xuất hiện (hình

4G). Một số mẫu nuôi cấy xuất hiện khối tế bào mô sẹo ở
dạng màu trắng, cứng, chỉ rất ít trong số các khối mô sẹo
này có khả năng tái sinh thành cây, tỷ lệ tạo cây rất thấp
(5,5%). Với các phôi nuôi cấy có kích thước lớn (5mm) thì
không có khả năng ạo mô sẹo và tái sinh cây.

Từ các kết quả trên cho phép chúng tôi đi đến kết luận rằng
phôi có độ tuổi 18-20 ngày (kích thước khoảng 1,0-2,0 mm
tương ứng) được nuôi cấy trên môi trường CN6 bổ sung
10mg/l AgNO3 sẽ cho hiệu quả tái sinh tốt hơn cả. Nhận
xét này cũng tương tự như nghiên cứu trước đây của một số
tác giả (Todorova và CS, 1998).

KẾT LUẬN

Trên cơ sở các kết quả thu được chúng tôi rút ra một số kết
luận sau:

1. Việc bổ sung 1-20 mg/l AgNO
3
vào môi trường tạo mô
sẹo có tác dụng kích thích phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh
cây dòng nhập nội HR8. Tần số tạo mô sẹo và tái sinh cây
đạt giá trị cao nhất ở nồng độ 10mg/l AgNO
3
(90.5% và
26.6%).

2. Khả năng tái sinh cây dòng HR8 thay đổi không đáng kể
khi nuôi cấy phôi non trên môi trường tạo mô sẹo có thành

phần khoáng và vitamin khác nhau (MS và N6) có bổ sung
20 g/l sucrose, 2 mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25
mM L-proline và 10 mg/l AgNO
3
. Sự có mặt của 10mg/l
AgNO
3
trong môi trường N6 đã có tác dụng kích thích khả
năng tạo mô sẹo cũng như tái sinh chồi.

3. Phôi non sau thụ phấn 18-20 ngày (có kích thước tương
ứng khoảng 1-2mm) có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây
tốt nhất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Armstrong CL., and Green CE. (1985)
Establishment and maintenance of friable, embryogenic
maize callus and the involvement of L-proline. Planta 164:
207-214
2. Chu CC., Wang CC., Sun CS., Hsu C.,Yin KC., Chu
CY., Bi FY. (1975)
Establishment of an efficient medium for anther culture of
rice through comparative experiments on the nitrogen
source. Sci Sin 18: 659-668.
3. Do Nang Vinh (1989)
Factors affecting the formation and differentiation of
embryogenic callus in cultured in vitro of immature maize
embryos. Genetics and breeding, vol. 22, No. 1, Sofia.
4. Green CE., and Phillips RL. (1975)

Plant regeneration from tissue culture of maize. Crop
Science 15:417-421
5. Lowe K., Taylor DB., Rayan P., Paterdon KE. (1985)
Plant regeneration via organogenesis and embryogenesis in
the maize inbred line B73. Plant Science 41.2: 125-132.
6. Murashige, T. & Skoog, F.C. (1962)
A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobaco tissue culture. Physiologia Plantarum 15:473-497.
7. Songstad DD., Armstrong CL., and Petersen WL.
(1991)
Silver nitrate increases type II callus production from
immature embryos of maize inbred B73 and its derivatives.
Plant Cell Reports 9: 699-702.
8. Songstad DD., Petersen WL. and Armstrong CL.
(1992)
Establishment of friable embryogenic (type II) callus from
immature tassels of Zea mays (Poaceae). American Journal
of Botany 79 (7): 761-764.
9. Todorova L., Kruleva M., Krapchev B., Nedev T.
(1998)
Maize immature embryo culture. Maize Newsletter 72: 76
10. Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh
(2003)
Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và tái sinh cây từ
phôi non hai dòng ngô nhập nội HR8, HR9 trong điều kiện
Việt nam. Tạp chí Nông nghiệp &PTNT, số 9, tr. 726-729.
11. Vain P., Flament P., and Soudain P. (1989)
Role of ethylene in embryogenic callus initiation and
regeneration in Zea mays L. Jour. of Plant Physiology 135:
537-540.

12. Vain P., Yean H., and Flament P. (1989)
Enhancement of production and regeneration of
embryogenic type II callus in Zea mays L. by AgNO3.
Plant Cell Tissue and Organ Culture 18: 143-151.




SUMMARY

The affect of medium component and embryo age on
callus induction and plant regeneration from immature
embryos of HR8 maize inbred line

Pham Thi Ly Thu, Pham Minh Thoi, Le Huy Ham, Do
Nang Vinh
Institute of Agricultural Genetics

The effective regeneration system plays important role in
plant transformation. In general, maize (Zea mays L.) is
recalcitral plant in regeneration, except some high
regenerable lines as A188, H99, HiII… which have been
used for transformation. Besides, plant regeneration
capacity depends on genotype. It was also affected by
medium component and the other factors.

HR8 and HR9 are high regenerable lines were used in this
study. There was no significant difference among callus
induction rates for immature embryos cultured on MS or
N6 medium containing 20 g/l sucrose, 2 mg/l 2,4-D, 100

mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline, 10 mg/l AgNO
3

and 0.2% phytagel.

Incorporating 10 mg/l AgNO
3
into phytagel solidified N6
medium supplemented 20 g/l sucrose, 2 mg/l 2,4-D, 100
mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline promoted callus
production from cultured immature embryos of HR8 line.
Under these conditions, approximately 90.5% of the
xplants produced calli after 2 to 3 weeks incubation in the
dark at 28
0
C and plant regeneration frequency was 26.6%.
The optimum embryo age for scutellar callus initiation was
18-20 days post-pollination (approximately 1-2 mm size
respective).

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đoàn Duy Thanh.