BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN TỶ LỆ BIẾN DỊ CỦA CÂY DỨA CAYEN TRONG QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG IN-VITRO" doc

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN TỶ LỆ BIẾN DỊ
CỦA CÂY DỨA CAYEN TRONG QUÁ TRÌNH NHÂN
GIỐNG IN-VITRO

Hoàng Thị Kim Hoa, Nguyễn Văn Dân
Trung tâm Sinh học thực nghiệm-Viện nghiên cứu ứng
dụng công nghệ
Vũ Văn Vụ, Phạm Thị Lương Hằng
Khoa Sinh học- Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-
ĐHQG Hà Nội

I. MỞ ĐẦU

Dứa là cây ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, đồng thời là
mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Trong các sản phẩm rau quả
chế biến, xuất khẩu, dứa luôn chiếm vị trí hàng đầu (50%
tổng sản lượng). Dứa còn được sử dụng để phủ xanh đất
trống trên những vùng đất dốc vốn khó sử dụng cho những
cây nông nghiệp khác nhưng lại rất thích hợp cho dứa [3].
Hiện nay, giống dứa đang được trồng chủ yếu là dứa
Queen. Giống này tuy có phẩm chất tốt nhưng quả nhỏ
(0,5-0,7 kg) vỏ dầy, mắt sâu, năng suất thấp nên không đạt
tiêu chuẩn dứa xuất khẩu cùng với việc chế biến lát cắt từ
dứa này cũng gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, cần phải thay
dần giống dứa Queen bằng giống dứa Cayen quả to năng
suất cao, chất lượng phù hợp với việc chế biến các mặt
hàng xuất khẩu [4]. Tuy nhiên, giống dứa Cayen có hệ số
nhân tự nhiên rất thấp. Một số biện pháp nhân giống bằng
hom, nhân nách lá, thân cắt khoanh [1], đã được ứng dụng
nhưng vẫn không đáp ứng được nhu cầu cây giống cho sản

xuất lớn. Phương pháp nhân giống in-vittro được nghiên
cứu nhằm giải quyết nhu cầu cấp bách về giống dứa hiện
nay. Đặc điểm của phương pháp này là trong một thời gian
ngắn có thể nhân nhanh một số lượng lớn cây giống sạch
bệnh, đồng đều về phẩm chất. Tuy nhiên, trong quá trình
nhân giống, do ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi
cấy, xuất hiện một số dạng cây biến dị [2],[5]. Để góp phần
hoàn thiện quy trình nhân giống dứa in-vitro, tạo cây giống
dứa khoẻ, sạch bệnh, giảm tỷ lệ cây biến dị, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu: “Ảnh hưởng của điều kiện môi trường
nuôi cấy lên tỷ lệ biến dị của cây dứa Cayen trong quá
trình nhân giống in vitro”

II. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG
NGHIÊN CỨU

1. Vật liệu

Vật liệu thí nghiệm là giống dứa Cayen (Ananas comosus
L. ) được lấy từ trung tâm cây ăn quả Phú Hộ.

2. Phương pháp thí nghiệm

- Phương pháp khử trùng: Các mầm dứa được khử trùng
sơ bộ bằng cách bóc bỏ các lá bẩn và rửa dưới vòi nước
chảy. Dùng bông thấm cồn 70% lau sạch các mầm sau đó
bóc tất cả các lá và khử trùng bằng cồn 70% trong một
phút. Tiếp tục khử trùng bằng HgCl
2
1% trong năm phút,

sau đó tráng mẫu 3 lần bằng nước cất vô trùng và cấy vào
môi trường khởi động mầm. Sau 2 tháng khởi động mầm,
trên các mẫu đã xuất hiện cụm chồi và nguồn chồi này
được dùng làm Vật liệu trong các thí nghiệm.

- Điều kiện thí nghiệm: Thí nghiệm được nuôi cấy trong
điều kiện ánh sáng nhân tạo với cường độ 2000 lux và thời
gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, nhiệt độ phòng nuôi cấy là
28
0
C  1. Môi trường thí nghiệm là môi trường cơ bản MS
(Murashige-Skoog) có chứa 15% nước dừa, 30% đường
(MS I) bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng, aga vào môi
trường tuỳ thuộc mục đích của từng thí nghiệm.

3. Nội dung nghiên cứu

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ
nuôi cấy, thể tích dung dịch dinh dưỡng, nồng độ aga và
các chất diều tiết sinh trưởng lên tỷ lệ chồi biến dị và sự
sinh trưởng của chồi trong quá trình nuôi cấy nhân nhanh
dứa Cayen.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Ảnh hưởng của mật độ nuôi cấy lên tỷ lệ phát sinh
chồi biến dị

Để nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ nuôi cấy lên sự sinh
trưởng và phát sinh chồi biến dị, chúng tôi cấy các chồi dứa

vào môi trường lỏng MS I (có bổ sung 1mg/l BAP + 0,02
mg/l IBA) với số lượng chồi cấy ban đầu là: 5;10;20;40
chồi /bình. Kết quả về chỉ tiêu sinh trưởng của chồi sau 30
ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Ảnh hưởng của mật độ nuôi cấy lên sinh trưởng và
tỷ lệ biến dị của chồi



Kết quả ở bảng 1 cho thấy: Trong điều kiện nuôi cấy với
mật độ cao (40 chồi /bình) các chồi phải phát triển trong
điều kiện cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian, điều
này ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng bình thường của
chồi dẫn đến kích thước của chồi giảm và tỷ lệ chồi biến dị
cao.

Từ kết quả trên chúng tôi cũng thấy được sự tương quan rõ
nét giữa mật độ cấy, hệ số nhân và tỷ lệ phát sinh chồi biến
dị. Mật độ cấy cao thì hệ số nhân thấp, khả năng phát sinh
chồi biến dị lớn. Ở công thức 4 với mật độ cấy 40 chồi
/bình, tỷ lệ chồi biến dị lên tới 6,1%, hệ số nhân chồi chỉ
đạt 1.65 lần. Trong khi đó ở công thức 1 với mật độ cấy 5
chồi/bình chỉ có 2,3% số lượng chồi bị biến dị và hệ số
nhân chồi đạt 6,21 lần. Như vậy, từ kết qủa trình bày ở
bảng 1 cho thấy mật độ cấy ban đầu tốt nhất là 5-10
chồi/bình (hình 1). Trong điều kiện này, các chồi phát triển
tốt vừa đảm bảo hệ số nhân vừa hạn chế mức thấp nhất sự
phát sinh các chồi biến dị.

Hình 1. Ảnh hưởng của mật độ nuôi cấy lên sinh trưởng và
tỷ lệ biến dị của chồi


2. Ảnh hưởng của thể tích môi trường dinh dưỡng lên sự
sinh trưởng của chồi và tỷ lệ chồi biến dị

Thể tích môi trường dinh dưỡng cũng như sự bổ sung các
chất điều tiết sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy có vai
trò quan trọng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển
của chồi dứa. Để tìm hiểu vấn đề này chúng tôi đã đưa các
chồi dứa vào môi trường lỏng MS I theo 4 công thức sau:

1. MS I 30ml/bình
2. MS I 60ml/bình
3. MS I 30ml/bình bổ sung 0,02mg/l IBA + 1,0 mg/l
BAP
4. MS I 60ml/bình bổ sung 0,02mg/l IBA + 1,0 mg/l
BAP

Mật độ cấy trung bình là 10 chồi/bình với kích thước chồi
từ 1-1,5 cm.
Thời gian thí nghiệm là 30 ngày, kết quả thí nghiệm được
trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Ảnh hưởng của thể tích và thành phần môi trường
dinh dưỡng lên sự sinh trưởng
của chồi và tỷ lệ chồi biến dị

Qua kết quả trình bày ở bảng 2 cho thấy, ở công thức 1 và 2
các chồi dứa được cấy trên môi trường không có kích thích
sinh trưởng hệ số nhân thấp (1,5 lần) nhưng chồi sinh
trưởng tốt. Các chỉ tiêu về sinh trưởng như kích thước,
trọng lượng, số lá và dài lá của chồi đều tăng. Chẳng hạn, ở
công thức 1: số lá, dài lá và trọng lượng tương ứng là 7,4;
6,92 và 0,98.
Ở công thức 2 thể tích môi trường/bình là 60ml, chồi sinh
trưởng tốt: trọng lượng chồi, số lá và chiều dài lá đều tăng
lên so với công thức 1. Tỷ lệ biến dị đều rất thấp 1,26% (ở
công thức 1) và 1,54% (ở công thức 2), khi không bổ sung
kích thích sinh trưởng. Khi bổ sung vào môi trường nưôi
cấy 0,1 mg/l IBA+1mg/l BAP, hệ số nhân ở công thức 3 và
4 đều tăng lên 2-3 lần so với công thức 1 và 2. Đặc biệt ở
công thức 4 với thể tích môi trường dinh dưỡng là 60
ml/bình thì hệ số nhân đạt 4,85 lần. Tuy nhiên, tỷ lệ chồi
biến dị cũng tăng vọt từ 1,26% và 1,54% ở công thức 1 và
2 lên 3,15% và đặc biệt ở công thức 3 môi trường có bổ
sung kích thích sinh trưởng và thể tích môi trường ít (30
ml/bình) đã làm tỷ lệ biến dị lên tới 6,5%.

Kết quả bảng 2 cho thấy, việc bổ sung chất kích thích sinh
trưởng (BAP- thuộc nhóm cytokinin) vào môi trường nuôi
cấy đã đóng vai trò quan trọng trọng trong việc phát sinh
nhiều chồi mới. Tuy nhiên, đây cũng là nguyên nhân tăng
số lượng chồi biến dị ở dứa nuôi cấy in-vitro. Bên cạnh đó,
hàm lượng môi trường dinh dưỡng ít cũng góp phần rất lớn
làm tăng chồi biến dị.

Từ những kết quả trên chúng tôi rút ra nhận xét như sau:

Trong điều kiện cần tăng hệ số nhân để nhân nhanh các
chồi dứa cần bổ sung các chất kích thích sinh trưởng (BAP
nồng độ 1mg/l) kết luận đồng thời cần phải tăng thể tích
dung dịch môi trường nuôi cấy dể hạn chế thấp nhất tỷ lệ
cây biến dị và đảm bảo chất lượng chồi dứa.

3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP lên sinh trưởng và phát
sinh chồi biến dị

Để tìm hiểu thêm ảnh hưởng của chất kích thích sinh
trưởng BAP lên tỷ lệ phát sinh biến dị của chồi dứa trong
quá trình nuôi cấy, chúng tôi đã tiếp tục tiến hành thí
nghiệm như sau:
Các chồi dứa có kích thước 1-1,5 cm được cấy trên môi
trường MS I có bổ sung BAP từ 0-3 mg/l tuỳ theo từng
công thức thí nghiệm với thể tích môi trường là 60 ml/bình.
Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3. Theo dõi ảnh hưởng của nồng độ BAP lên sinh
trưởng và phát sinh chồi biến dị


Từ những kết quả trên chúng tôi nhận thấy:

Những chồi dứa cấy trên môi trường MS I không bổ sung
chất kích thích sinh trưởng (0 mg/l BAP) chồi to khoẻ,
trọng lượng của chồi cao (1,73 g/chồi) và hầu như không
phát sinh chồi mới. Tỷ lệ phát sinh biến dị rất thấp 1,2%.
Khi bổ sung BAP vào môi trường hệ số nhân chồi tăng từ
1,3 lần (ở công thức đối chứng) lên 3,7 lần ở công thức có
bổ sung BAP 3 mg/l. Kết quả ở bảng 3 cho thấy, nồng độ

BAP trong môi trường cấy càng cao, số lượng chồi thu
càng lớn thì kích thước và trọng lượng càng giảm (trọng
lượng từ 1,73 g/chồi giảm xuống còn 0,58 g/chồi; chiều cao
chồi giảm từ 6,7 cm xuống còn 1,9 cm). Tỷ lệ chồi biến dị
cũng tăng tỷ lệ thuận với việc tăng nồng độ BAP: từ 1,2%
(ở công thức đối chứng) tăng lên 3,5% (ở công thức môi
trường có bổ sung 3 mg/l BAP).



Hình 2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP lên sinh trưởng và
phát sinh chồi biến dị


Qua các kết quả thu được ở bảng 4 có thể rút ra nhận xét
như sau: BAP có tác dụng kích thích quá trình nhân nhanh
chồi nhưng đồng thời cũng là nguyên nhân làm tăng biến dị
của chồi (minh họa ở hình2).

4. Ảnh hưởng của hàm lượng aga lên sinh trưởng và
phát sinh chồi biến dị

Các chồi dứa cấy vào 2 công thức môi trường như sau:

1. MS I không có kích thích sinh trưởng và bổ sung aga
ở các nồng độ khác nhau: 0;2;4;6;8 g/l.

2. MS I có kích thích sinh trưởng và bổ sung aga ở các
nồng độ khác nhau: 0;2;4;6;8 g/l.
Các thí nghiệm được lặp lại nhiều lần. Thời gian nuôi cấy

là 30 ngày. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.

Từ những kết quả thu được ở bảng 4 chúng tôi thấy rằng:
hàm lượng aga trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất
lớn đến tỷ lệ biến dị của chồi, vì nó có liên quan mật thiết
đến sự hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường của các
chồi. Hàm lượng aga càng càng cao thì tỷ lệ biến dị càng
tăng, trọng lượng của chồi càng giảm (Ở môi trường lỏng
không bổ sung aga, không có cây biến dị. Khi tăng hàm
lượng aga lên 8% tỷ lệ biến dị tăng lên 7,6% đồng thời
trọng lượng của chồi giảm xuống còn 0,64 g). Từ đó, chúng
tôi rút ra kết luận: chỉ bổ sung aga vào môi trường nuôi cấy
ở một cố giai đoạn cần thiết (khởi động mầm, tạo rễ) và với
nồng độ < 0,8%. Môi trường không có aga và chất điều tiết
sinh trưởng (công thức 1) có thể dùng làm môi trường nuôi
chồi trước khi chuyển sang môi trường ra rễ.

VI. KẾT LUẬN

1. Mật độ chồi cấy trong một bình ảnh hưởng rất lớn đến
việc phát sinh chồi biến dị và sinh trưởng của chồi dứa. Số
lượng chồi nuôi cấy thích hợp vào khoảng 5 đến 10
chồi/bình.

2. Thể tích dung dịch trong bình nuôi cấy phù hợp sẽ tạo
điều kiện cho các chồi sinh trưởng tốt, hạn chế sự phát sinh
chồi biến dị. Lượng môi trường đủ để chồi phát triển tốt là
60 ml/bình với thời gian cấy chuyển là 30 ngày.

3. Tỷ lệ chồi biến tỷ lệ thuận với nồng độ cytokinin

(BAP) trong môi trường. Nồng độ cytokinin càng cao, hệ
số nhân càng lớn, tỷ lệ biến dị càng tăng kích thước chồi
càng bé.

4. Hàm lượng aga càng cao thì khả năng xuất hiện chồi
biến dị thường biến càng lớn và khả năng sinh trưởng của
chồi càng giảm. Sự ảnh hưởng của hàm lượng aga cao càng
thể hiện rõ trong môi trường có bổ sung các chất điều tiết
sinh trưởng.

5. Môi trường MS không có các chất điều tiết sinh
trưởng thuận lợi cho quá trình nuôi chồi trước khi chuyển
sang môi trường ra rễ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1. Lê Đình Danh, Võ Thị Tuyết, 1994.
Nhân giống dứa cayen bằng một số biện pháp kỹ thuật. Kết
quả nghiên cứu khoa học Viện rau quả (1990 – 1994)
2. Đặng Xuyến Như, Hoàng Thị Kim Hoa và cộng sự
(1997)
Nghiên cứu nhân nhanh giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào
(Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp bộ)
3. Phan Gia Tân, 1984
Cây dứa và kỹ thuật trồng dứa ở Việt Nam
Nhà xuất bản thành phố Hồ Chí Minh
4. Trần Thế Tục, Vũ Mạnh Hải, Chu Văn Chuông, 1996
So sánh tuyển chọn giống dứa cayen phục vụ chế biến đồ
hộp ở miền Bắc Việt Nam

5. Singh (R) and Iyer (C.P.A),1994.
Chemical mutagenesis in pineaple (Ananas comosus L
merr).


SUMARY
Impact of some medium elements on variation
percentage in invitro propagation of Cayen pineapple (
Ananas comosus L.)

Hoang Thi Kim Hoa, Nguyen Van Dan
Centre of experimental biology – Nacentech
Vu Van Vu, Pham Thi Luong Hang
Faculty of biology – The university of National Science

Cayen pineapple has been gradually replacing Queen
pineapple because of its good characteristics. Propagation
of Cayen has effectively been proceeded by in vitro
culturing. However, this process is affacted by some
elements in medium, such as: shoot density, nutrient
medium volume, concentration of growth regulator and
agar These elements at a non-suitable level could cause
variation of shoots.

The number of cultured shoots was between five and ten in
order to reduce the competition for nutrient and space. The
nutrient medium volume was about 60 ml in a flask and
subculture every 30 days. Shoots were grown strongly in
this medium and variation percentage was reduced.

BAP is a growth regulator of cytokine stimulating rapidly
the generation of shoots. But the higher concentration of
cytokine in medium, the higher variation percentage the
shoots were. Moreover, most of all shoots were reduced in
length. Agar had the same effect on the growth of shoot as
cytokine.

Therefore, liquid medium without growth regulator was
used for elongation of shoots before subculturing in rooting
medium.

Người thẩm định nội dung khoa học: PGS.TS. Lê Duy
Thành