BÁO CÁO KHOA HỌC: "TẠO DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN GEN KHÁNG NGUYÊN LÕI CỦA VIRUT VIÊM GAN B (HBcAg) PHÂN LẬP TỪ KHỐI U CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN" pdf

TẠO DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN GEN
KHÁNG NGUYÊN LÕI CỦA VIRUT VIÊM GAN B
(HBcAg) PHÂN LẬP TỪ KHỐI U CỦA BỆNH NHÂN
UNG THƯ GAN

Đặng Trường Minh, Lê Thị Tâm, Bạch Như Quỳnh,
Đồng Văn Quyền, Đinh Duy Kháng
Viện Công nghệ sinh học

I. MỞ ĐẦU

Viêm gan do virus viêm gan B (HBV) hiện đang được xem
là một căn bệnh nguy hiểm và phổ biến nhất trên thế giới.
Trên cơ sở điều tra rộng rãi về kháng nguyên bề mặt của
virus viêm gan B (HBsAg) và kháng thể kháng kháng
nguyên này (anti-HBsAg) người ta đã có thể nhận định
HBV đã và đang lưu hành trên toàn thế giới. Bệnh này
thường để lại hậu quả nghiêm trọng là xơ gan và ung thư
gan với tỷ lệ tử vong cao. Do vậy viêm gan B hiện là một
vấn đề đang được chú trọng trong chương trình bảo vệ sức
khoẻ cộng đồng toàn cầu [1].
Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện nay
có khoảng 400 triệu người bị nhiễm HBV trên toàn cầu,
như vậy HBV có thể được xem như một trong những mầm
bệnh phổ biến nhất đối với con người. Số người chết liên
quan trực tiếp đến nhiễm HBV hàng năm lên tới khoảng 2
triệu người. Ở Việt Nam, theo báo cáo của bộ Y tế từ năm
1978 đến năm 1990, số mắc viêm gan B khoảng 20.000
người/năm và tỷ lệ tử vong là 0,7% - 0,8%. Hiện tại, Việt
nam vẫn đang được xếp vào một trong những quốc gia có
tỷ lệ người nhiễm HBV cao nhất trên thế giới [3]. Điều

quan trọng là cho đến nay chưa có một hoá trị liệu nào đặc
hiệu để điều trị viêm gan B. Phương pháp duy nhất để tránh
viêm gan B là dự phòng bằng vắc xin. Vì vậy có thể coi dự
phòng viêm gan B cũng là một biện pháp hữu hiệu để dự
phòng ung thư gan nguyên phát. Trước tình hình lây nhiễm
của HBV như hiện nay, thì việc đẩy mạnh sản xuất vắc xin
trong nước bằng việc nhập khẩu một dây chuyền công nghệ
hiện đại kết hợp với việc nghiên cứu tách dòng và biểu hiện
gen từ đối tượng gây bệnh phân lập trong nước là cần thiết.
Chúng tôi đã nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu
hiện gen mã hoá kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan
B với mục đích sản xuất được loại kháng nguyên này để tạo
ra bộ sinh phẩm chẩn đoán viêm gan B cũng như phát triển
vắc xin tái tổ hợp [4, 5, 7]. Tuy nhiên, để có thể đánh giá
một cách chính xác về mặt dịch tễ học của virus viêm gan
B thì việc phối hợp giữa phát hiện HBsAg, kháng thể
kháng HBsAg và kháng thể kháng HBcAg là cần thiết.
Kháng thể kháng HBcAg hình thành sớm và tồn tại gần
như suốt cả cuộc đời người đã bị nhiễm HBV, vì vậy khó
có thể bỏ sót các trường hợp hợp nhiễm HBV nếu phát hiện
kháng thể loại này.

Xuất phát từ mục tiêu trên, chúng tôi đã tiến hành tách
dòng và thiết kế vectơ để biểu hiện gen mã hóa kháng
nguyên lõi của virus viêm gan B (gen hbc) từ khối u của
bệnh nhân ung thư gan nhằm thu nhận kháng nguyên lõi tái
tổ hợp để phục vụ công tác chẩn đoán.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR: Cặp mồi dùng cho
phản ứng PCR được thiết kế nhờ chương trình phần mềm
PC/Gene dựa trên trình tự của đoạn ADN thuộc genôm của
virus viêm gan B chứa gen hbc đã được công bố trong
Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế [2]. Vị trí bám của mồi vào
vùng chứa gen hbc được nêu ở hình 1.

Hình 1: Vị trí của cặp mồi HBCP1, HBCM1 trong một
vùng ADN genôm của virus viêm gan B, chứa toàn bộ gen
kháng nguyên lõi của virus viêm gan B với chiều dài 552
cặp bazơ (phần in đậm). Theo lý thuyết, cặp mồi HBCP1,
HBCM1 tạo ra sản phẩm PCR với chiều dài là 619 cặp
bazơ.


Kỹ thuật PCR: Kỹ thuật PCR được tiến hành với 100 ng
ADN tách từ khối u làm sợi khuôn và cặp mồi đặc hiệu
HBCP1 và HBCM1, có trình tự như sau:

HBCP: 5'-TGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3'
HBCM1:5'-TCCCACCTTATGAGTCCAAGGG-3'

Sử dụng 1 đơn vị Taq Polymeraza của công ty Perkin
Elmer cho mỗi ống phản ứng. PCR được tiến hành nhờ
máy chu kỳ nhiệt MJ PTC-100 (Mỹ) với chương trình như
sau: Biến tính ADN trong 3 phút rồi chạy 30 chu kỳ (95
0
C
50 giây, 55
0

C 50 giây, 72
0
C 1 phút 25 giây). Sau khi kết
thúc chu kỳ, giữ ở nhiệt độ 72
0
C 8 phút sau đó giữ ở 4
0
C.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza
1%.

Tách dòng gen được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản
phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCRTM với bộ Kit của
hãng Invitrogen. Gen hbc tái tổ hợp với vectơ tách dòng
trước hết được kiểm tra bằng cắt với enzym giới hạn EcoR
I, sau đó được giải trình tự với máy xác định trình tự ADN
tự động (ALFExpress) với bộ Kit của hãng Amersham-
Pharmacia Biotech.

Sau khi giải trình tự, gen được dịch mã sang protein và so
sánh với trình tự axit amin kháng nguyên HBcAg của các
tác giả khác bằng chương trình phần mềm PC/gene.
Vectơ pMAL-c2 được sử dụng để thiết kế vectơ biểu hiện
gen hbc ở E. coli. Cặp mồi treo hai vị trí giới hạn EcoR I và
Hind III có trình tự:

HBcR1: GGAATTCATGGACATTGACCC
EcoR I
HBcH3: AAGCTTCTAACATTGAGATTCC
Hind III

Tiến hành PCR với cặp mồi HBCR1 và HBCH3, sau đó
gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR 2.1 để tạo
dòng phụ. Gen hbc được cắt ra khỏi vector tách dòng pCR
2.1 bằng EcoR I và Hind III, sau đó gắn vào vectơ pMAL-
c2 để thu nhận vectơ tái tổ hợp. Vectơ mang gen hbc được
biến nạp vào E. coli chủng BL21 và cho biểu hiện để thu
protein tái tổ hợp.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Để nhân bản gen mã hoá cho kháng nguyên lõi của virut
viêm gan B, chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR với cặp
mồi HBCP1, HBCM1 và khuôn là 100 ng ADN tách từ
khối u của bệnh nhân ung thư gan. Với cặp mồi này, sản
phẩm PCR thu được có chiều dài tính theo lý thuyết là 619
cặp bazơ. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên
gel agarose 1% kết quả được chỉ ra ở hình 2.

Hình 2: Điện di trên gel agaroza 1% kiểm tra sản phẩm
PCR được tiến hành với khuôn là ADN tách chiết từ khối u
của bệnh nhân ung thư gan với cặp mồi HBCP1, HBCM1.
Kênh M: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng Hind III và
EcoR I). Kênh 1, 2, 3, 4, 5: Sản phẩm PCR.

Sản phẩm PCR được gắn vào vectơ PCRTM và biến nạp
vào vi khuẩn E. coli chủng DH-5. ADN plasmid được
tách từ các khuẩn lạc riêng rẽ màu trắng bằng phương pháp
miniprep sau đó được tuyển chọn để thu nhận các plasmid
có khả năng mang gen hbc bằng cách điện di trên gel

agarose 1%. Chọn các plasmid có kích thước lớn hơn
plasmid gốc để kiểm tra trước hết bằng cắt với enzyme giới
hạn EcoRI (hình 4).


Kết quả ở hình 4 cho thấy chỉ có plasmid tách từ clôn số 15
mang gen hbc. Theo tính toán thì đoạn ADN được nhân
bản chứa gen hbc có chiều dài 619 cặp bazơ. Sau khi xử lý
với EcoR I, chỉ có plasmid tách từ clôn số 15 có đoạn ADN
được tách ra khỏi vector tái tổ hợp có chiều dài nằm trong
vùng dự tính. Để có thể khẳng định chắc chắn, chúng tôi đã
tiến hành xác định trình tự gen hbc với máy xác định trình
tự ADN tự động. Trình tự gen hbc phân lập ở Việt Nam đã
được đăng ký trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế với số
đăng ký AJ298864. Gen hbc cũng đã được dịch mã sang
protein và so sánh trình tự axit amin với trình tự axit amin
của kháng nguyên lõi của virus viêm gan B đã được các tác
giả Nhật Bản công bố. Kết quả cho thấy độ tương đồng đạt
tới 93,4 % (hình 5).

Hình 4: Điện di trên gel agaroza 1% để tuyển chọn các
plasmid tái tổ hợp mang gen hbc sau khi cắt bằng EcoRI.
Kênh M: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng Hind III và
EcoR I). Kênh 1: Plasmid tách từ clôn 15; kênh 2: Plasmid
tách từ clôn 12.


Hình 5: So sánh trình tự axit amin giữa HBcAg Viet Nam
(HBCVN) và HBcAg của Nhật Bản (HBCNB) và nhận
được sự tương đồng cao (93,4%).

Biểu hiện gen hbc trong E. coli được thực hiện với vectơ
pMAL-c2. Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại có độ dài
566 cặp bazơ. Sau khi xử lý với EcoR I và Hind III được
gắn vào vectơ pMAL-c2 rồi biến nạp vào E. coli chủng
DH5. Plasmit tái tổ hợp được kiểm tra bằng cắt với EcoR
I và Hind III.
Kết quả kiểm tra được nêu ở hình 6. Sau khi đã kiểm tra
một cách chắc chắn, plasmit tái tổ hợp được biến nạp vào
E. coli chủng BL21 (DE3) và cho biểu hiện để thu nhận
protein tái tổ hợp. Biểu hiện gen hbc tái tổ hợp được cảm
ứng bằng IPTG với nồng độ cuối cùng là 1mM. Protein tái
tổ hợp là loại protein liên kết với protein có ái lực với
maltoza (MBP). Kết quả kiểm tra protein tái tổ hợp bằng
điện di gel polyacrylamit 12,5 % được nêu ở hình 7.

Hình 6: Điện di trên gel agaroza 1% để tuyển chọn vectơ
pMAL-c2 tái tổ hợp mang gen hbc sau khi cắt bằng EcoRI
và Hind III. Kênh M: Chỉ thị phân tử (ADN  cắt bằng
Hind III và EcoR I). Kênh 1, 2, 3, 4, 5: Plasmid tách từ các
clôn khác nhau. Sau khi cắt bằng EcoRI và Hind III, gen
hbc sẽ được tách khỏi vectơ.


Hình 7: Điện di trên gel polyacrylamide 12,5% để kiểm tra
protein HBcAg tái tổ hợp. Kênh M: Chỉ thị phân tử (từ cao
xuống thấp: 93, 67, 43, 30, 20,1 và 14,4 kDa). Kênh 1: mẫu
trước cảm ứng. Kênh 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Mẫu sau cảm ứng
0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 và 4,0 giờ.

IV. KẾT LUẬN

Gen mã hóa cho kháng nguyên lõi của virus viêm gan B đã
được nhân bản từ ADN tách từ khối u của bệnh nhân ung
thư gan, sau đó được tạo dòng, xác định trình tự và dịch mã
sang protein. Gen này có chiều dài 552 cặp bazơ và mã hóa
cho một protein dài 183 axit amin. So sánh trình tự axit
amin của HBcAg của Việt Nam và HBcAg được các tác giả
Nhật Bản công bố trong ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế
thấy có sự tương đồng cao (93,4%) [2].
Vectơ pMAL-c2 được sử dụng để biểu hiện gen hbc ở E.
coli. Sau khi xử lý sản phẩm PCR và vectơ đồng thời với 2
enzyme giới hạn là EcoR I và Hind III, gen hbc được gắn
vào vectơ nhờ ligaza và biến nạp vào E. coli chủng BL21
(DE3). Cảm ứng được tiến hành với 1mM IPTG trong
khoảng thời gian 0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 và 4,0 giờ.
Protein tái tổ hợp đươc kiểm tra bằng điện di trên gel
polyacrylamide 12,5 %. Kết quả cho thấy, sau khi cảm ứng
bằng IPTG, protein tái tổ hợp tăng dần theo thời gian từ 30
phút đến 4 giờ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tạp chí:

1. Blumberg, B. S., 1997.
Hepatitis B virus, the vaccine, and the control of primary
cancer of the liver. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7121-
7125.

2. Horikita M., Itoh S., Yamamoto K., Shibayama T.,
Tsuda F., Okamoto H., 1994.
Differences in the entire nucleotide sequence between
hepatitis B virus genomes from carriers positive for
antibody to hepatitis B e antigen with and without active
disease. J. Med. Virol. 44:96-10.
3. Trịnh Quân Huấn. 2000:
Virus viêm gan B. NXB Y học, 2000.
4. Đinh Duy Kháng, Chu Hoàng Hà, Phạm Thúy Hồng,
Nguyễn Thanh Thủy, Nông Văn Hải, Đái Duy Ban, 1996.
Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen kháng nguyên
bề mặt của virut viêm gan B từ khối u của bệnh nhân ung
thư gan. Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học, 1996: 20-25.
5. Đinh Duy Kháng, Chu Hoàng Hà, Phạm Thúy Hồng,
Nguyễn Thanh Thủy, Nông Văn Hải, Đái Duy Ban, 1998.
Trình tự gen kháng nguyên bề mặt của virut viêm gan B
phân lập từ khối u của bệnh nhân ung thư gan. EMBL gene
bank số HBV012481.
6. Đinh Duy kháng, Nguyễn Văn Vũ, Đái Thị Hằng Nga,
Nguyễn Thị Nga, Đái Duy Ban, 1999.
Ứng dụng kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR) để phát hiện
ADN của virut viêm gan B trong khối U của bệnh nhân ung
thư gan. Báo cáo khoa học Hội nghị CNSH toàn quốc,
1151-1156.
7. Đồng Văn Quyền, Bạch Như Quỳnh, Đái Duy Ban, Đinh
Duy Kháng. 1999.
Nghiên cứu biểu hiện gen kháng nguyên bề mặt của virut
viêm gan B (HBsAg) ở trực khuẩn Escherichia coli. Kỷ yếu
Viện Công nghệ Sinh học. 239-244.
8. Dong Van Q., Bach Nhu Q., Le Thi T., Dinh Duy K.

2000.
Cloning of gene encoding hepatitis B virus core antigen
(HBcAg). AC # AJ298864.


SUMMARY

Cloning and expression of the gene encoding hepatitis B
core antigen
from human liver tumor biopsies
Dang Truong Minh, Le Thi Tam, Bach Nhu Quynh,
Dong Van Quyen, Dinh Duy Khang
Institute of Biotechnology

The gene encoding hepatitis B core antigen has been cloned
from human liver tumor biopsies. This gene is 549 bp long
and codes for the 183 amino acid long protein. The amino
acid sequence of the hepatitis B core antigen that isolated
by us had high identity (93,4%) when the alignment with
the HBcAg sequence of Japanese authors was carried out
[2].
The pMAL-c2 vector was used for hbc gene expression in
E. coli. After purification, the PCR product was treated
with EcoR I and Hind III then ligated into pMALC2
expression vector with the same restriction sites using T4
ligase. The ligate was transformed competent cells E. coli
DH5, then we selected the recombinant plasmids that
ware able to carry hbc gene. Plasmids were extracted from
randomly picked up colonies and checked with agarose gel
electrophoresis using original pMALC2 vector as standard.

We colected only the plasmids with larger size for checking
with restriction enzyme EcoR I and Hind III. Result of
digestion with restriction enzyme confirmed that, the hbc
gene was already inserted into pMALC2 vector to be
available for E. coli transformation. Recombinant vectors
were used to transforme E. coli strain BL21 (DE3) for
expression. The expected fusion protein with molecular
mass about 61 kDa would be expressed after 3 hours
induction with 1 mM IPTG. The fusion protein included
maltose binding protein (MBP) with molecular mass 41
kDa and recombonant HBcAg with predicted molecular
mass 20 kDa were checked with polyacrylamide gel
electrophoresis.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đinh Duy Kháng