BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI GANODERMA BẰNG MỒI PCR ĐẶC HIỆU CHO GEN SUPEROXIDE DISMUTASE" pot

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI GANODERMA BẰNG
MỒI PCR ĐẶC HIỆU CHO GEN SUPEROXIDE
DISMUTASE

Nguyễn Hoài Giang
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
Nguyễn Xuân Hùng, Lê Đình Lương
Trung tâm Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà nội

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong tự nhiên chi Ganoderma rất đa dạng và không phải
tất cả các loài này đều sản sinh ra các hợp chất sinh học có
tác dụng như nhau, nên việc phân loại chính xác chúng
không phảI chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang tính thực
tiễn. Sự phân loại Ganoderma được thực hiện đầu tiên dựa
trên màu sắc và hình thái, tiếp theo là phân loại bằng các
isozym, và gần đây là ở mức độ ADN (2, 3, 4). Trong
nghiên cứu trước chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật RAPD và
PCR với mồi đặc hiệu cho gen laccase để phân loại một số
chi Ganoderma ở Việt nam (4). Từ những kết quả thu được,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu các chỉ thị phân tử mới
nhằm phân loại Ganoderma chính xác và cụ thể hơn.

Enzym superoxide dismutase (SODs) có vai trò quan trọng
trong cơ chế bảo vệ của tế bào. Gốc O
2
- gây độc cho tế bào
và SODs xúc tác quá trình chuyển O
2
- thành O

2
và chuyển
O
2
- và H - thành H
2
O
2
. SODs được phát hiện có tồn tại
trong các tế bào từ vi khuẩn đến thực vật và động vật bậc
cao (5). Đến nay người ta đã biết có 4 loại SODs, sự phân
chia này dựa trên các nguyên tố kim loại có ở vị trí hoạt
động của enzym này: Mn SOD, Fe SOD, Cu, Zn SOD và
Ni SOD. Enzym Mn SOD giống nhau đến 65% giữa các
loài thực vật và chúng có độ tương đồng cao với vi khuẩn.
Mỗi phân tử Mn SOD mang một nguyên tử mangan và
enzym này không hoạt động được nếu không có nguyên tử
mangan ở vị trí hoạt động. So sánh trình tự axít amin của
các SODs cho thấy Mn SOD và Fe SOD có nguồn gốc cổ
hơn so với các loại SODs còn lại, và có nhiều khả năng
chúng tiến hoá từ một loại enzym ban đầu. Ngược lại, Cu-
Zn SODs lại không có trình tự tương tự với Mn SOD và Fe
SOD và có thể chúng tiến hoá riêng biệt trong quá trình
phát triển của các tế bào nhân chuẩn (5, 6).

Trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu phương pháp sử
dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen Mn SOD
để phân loại và xếp nhóm cho Ganoderma ở Việt nam.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Vật liệu

Các mẫu nấm Ganoderma lucidum với các dưới loài khác
nhau được ký hiệu là Gl 1 và Gl 2; Ganoderma australe
sensulato với các dưới loài khác nhau được ký hiệu là Ga 1
và Ga 2; Ganoderma applanatum sensulato với các dưới
loài khác nhau được ký hiệu là Gb 1 và Gb 2; Ganoderma
tortnatum sensulato với các dưới loài khác nhau được ký
hiệu là Gc 1 và Gc 2; Ganoderma australe được ký hiệu là
Gau, do GS. Trịnh Tam Kiệt, phòng Giống nấm gốc, Trung
tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà nội cung
cấp.


2. Phương pháp nghiên cứu


• ADN được tách chiết từ các mẫu Ganoderma theo
Nguyễn Thị Kim Dung và Lê Đình Lương, có cải tiến, để
tăng số lượng ADN thu được (7).

• PCR với mồi đặc hiệu cho gen Mn SOD của
Ganoderma australe là FGau 1 và RGau 1.

• PCR với mồi đặc hiệu cho gen Mn SOD của
Ganoderma lucidum và Ganoderma australe là FGau 1 và
RGau 2.

• Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid 6% và
nhuộm bạc (8).



KẾT QUẢ, THẢO LUẬN

1. Thiết kế các cặp mồi của gen Mn SOD để phân loại
Ganoderma

Trong nghiên cứu trước (4) sử dụng kỹ thuật PCR với mồi
ngẫu nhiên (OPU1: 5'- ACGGACGTCA -3') và cặp mồi
đặc hiệu laccase (LA1: 5'- CAT TGG CAC GGA TTC
TTC -3’ và LA2: 5'- ATG GCT GTG GTA CCA GAA -3'),
các mẫu Ganoderma nghiên cứu đã được phân ra thành các
nhóm: (i) Ganoderma lucidum với sản phẩm PCR 217 bp
hoặc 144 bp của gen laccase, (ii) Ganoderma australe và
Ganoderma tortnatum sensulato với sản phẩm PCR 144 bp
của gen laccase và (iii) Ganoderma applanatum sensulato
và Ganoderma australe sensulato không tạo sản phẩm PCR
với cặp mồi LA 1 và LA 2.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi dùng gen mã hoá enzym
Mn SOD để phân loại cụ thể hơn các mẫu Ganoderma nêu
trên. Khai thác dữ liệu từ Ngân hàng gen quốc tế
(Genbank) và kết quả sử dụng phần mềm chuyên dụng
Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov) để so sánh trình tự gen Mn
SOD của Ganoderma lucidum (số hiệu U56134, Genbank)
với trình tự gen Mn SOD của Ganoderma australe (số hiệu
U56112, Genbank) cho thấy gen Mn SOD của hai loài này

có độ tương đồng khá cao (các nucleotid giống hệt nhau
được thể hiện bằng các dấu *, Hình 1). Tuy nhiên, trong
gen Mn SOD của Ganoderma lucidum và Ganoderma
australe cũng có những đoạn trình tự khác biệt đặc trưng
riêng cho từng loài (thể hiện bằng các khoảng trống hoặc
dấu -, Hình 1). Sử dụng các đoạn có trình tự giống hệt nhau
của hai loài Ganoderma này, chúng tôi thiết kế mồi xuôi
(FGau 1) và mồi ngược (RGau 2) để nhân các đoạn trong
gen Mn SOD. Ngoài ra, sử dụng đoạn trình tự khác biệt đặc
hiệu của Ganoderma australe, chúng tôi đã thiết kế một
mồi ngược dành riêng cho loại Ganoderma này với ký hiệu
RGau 1.


Trình tự các mồi như sau:

FGau 1: 5’-GAA GCA CCA CCA GAC CTA CGT G-3’

RGau 1: 5’-ATC GAG AGA GGC CGA AGC ACC-3’

RGau 2: 5’-AGA CGT CGA CGC CGA TGA TGG-3’


Theo cách thiết kế các mồi nêu trên, khi tiến hành phản ứng
PCR với cặp mồi FGau 1và RGau 1 thì Ganoderma
australe dự kiến sẽ cho 1 băng ADN với kích thước khoảng
461 bp; và sẽ không có sản phẩm PCR với Ganoderma
lucidum. Ngược lại khi tiến hành phản ứng PCR với cặp
mồi FGau 1và RGau 2 thì Ganoderma australe dự kiến sẽ
cho 1 băng ADN với kích thước khoảng 755 bp, còn với

Ganoderma lucidum dự kiến sẽ cho 1 băng ADN với kích
thước khoảng 693 bp.




Hình 1. So sánh trình tự gen Mn SOD của Ganoderma
lucidum và Ganoderma australe.

Gl : Ganoderma lucidum

aut: Ganoderma australe

>: Chiều và vị trí các mồi


2. Sử dụng gen Mn SOD để phân loại Ganoderma

Để sử dụng được gen Mn SOD trong phân loại
Ganoderma, đầu tiên chúng tôi tiến hành tối ưu hoá điều
kiện PCR theo nhiệt độ gắn mồi tính toán được từ các mồi
(FGau 1, RGau1 và RGau 2) và kích thước sản phẩm PCR
dự đoán sẽ tạo ra. Điều kiện PCR sau khi tối ưu hoá với cặp
mồi FGau 1và RGau 1 là 94
o
C 3 phút/ 35 chu kỳ với 94
o
C
20 giây, 65
o

C 30 giây, 72
o
C 40 giây/ 72
o
C 3 phút. Kết quả
điện di và nhuộm bạc trên gel polyacrylamid 6% cho thấy,
đúng như dự đoán của chúng tôi, cặp mồi FGau 1và RGau
1 cho phép khuyếch đại 1 phần của gen Mn SOD ở
Ganoderma australe (Gau) với kích thước khoảng 461 bp
(Giếng 7, Hình 2). Trong khi đó các mẫu Ganoderma
lucidum (Gl 1 và Gl 2), Ganoderma tortnatum sensulato
(Gc 1 và Gc 2), Ganoderma australe sensulato (Ga 1 và Ga
2) và Ganoderma applanatum sensulato (Gb 1 và Gb 2)
đều không tạo ra sản phẩm PCR với cặp mồi này (Hình 2).




Hình 2. Khuyếch đại PCR đoạn gen Mn SOD bằng cặp mồi
đặc hiệu của Ganoderma australe (FGau 1 và RGau 1)


Giếng 1 và 2: Ganoderma australe sensulato (Ga 1 và Ga
2).

Giếng 3 và 4: Ganoderma applanatum sensulato (Gb 1 và
Gb 2).

Giếng 5 và 6: Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc
2).

Giếng 7: Ganoderma australe (Gau).

Giếng 8 và 9: Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2).

Mr: Thang ADN chuẩn (25/100 ladder - Bioneer)


Tương tự với thí nghiệm trên, điều kiện PCR sau khi tối ưu
hoá với cặp mồi FGau 1 và RGau 2 là 94
o
C 3 phút/ 35 chu
kỳ với 94
o
C 20 giây, 68
o
C 30 giây, 72
o
C 50 giây/ 72
o
C 5
phút. Kết quả điện di cho thấy, cặp mồi FGau 1và RGau 2
cho phép khuyếch đại 1 đoạn của gen Mn SOD ở
Ganoderma australe (Gau) với kích thước khoảng 755 bp;
cặp mồi này cũng cho phép khuyếch đại 1 đoạn của gen Mn
SOD ở Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2) với kích thước
khoảng 693 bp. Trong khi đó các mẫu Ganoderma
tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc 2), Ganoderma australe
sensulato (Ga 1 và Ga 2) và Ganoderma applanatum
sensulato (Gb 1 và Gb 2) đều không tạo ra sản phẩm PCR

với cặp mồi này (Hình 3). Một điểm cần lưu ý là tất cả các
mẫu Ganoderma đem tiến hành nghiên cứu với các mồi
FGau 1, RGau1 và RGau 2 đều đã cho kết quả PCR dương
tính với mồi ngẫu nhiên OPU 1 (4), nghĩa là ADN của tất
cả các mẫu này đều được tách chiết tốt. Như vậy, nguyên
nhân của việc không tạo ra sản phẩm PCR ở đây là do trình
tự gen Mn SOD các loài Ganoderma khác nhau là không
giống nhau.

Trong nghiên cứu trước (4) kết quả khuyếch đại gen
laccase với cặp mồi (LA 1 và LA 2) của Ganoderma
australe và Ganoderma australe sensulato cho thấy chỉ tạo
ra sản phẩm PCR (144 bp) với Ganoderma australe mà
không tạo ra sản phẩm với Ganoderma australe sensulato.
Kết hợp kết quả đó với kết quả khuyếch đại gen Mn SOD
cho thấy Ganoderma australe và Ganoderma australe
sensulato, tuy tên khoa học trong phân loại không khác xa
nhau nhiều, nhưng trình tự gen có sự khác biệt rõ rệt.



Hình 3. Khuyếch đại PCR đoạn gen Mn SOD bằng cặp mồi
đặc hiệu của Ganoderma australe và Ganoderma lucidum
(FGau 1 và RGau 2)


Giếng 1 và 2: Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2).

Giếng 3: Ganoderma australe (Gau).

Giếng 4 và 5: Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc
2).

Giếng 6 và 7: Ganoderma applanatum sensulato (Gb 1 và
Gb 2).

Giếng 8 và 9: Ganoderma australe sensulato (Ga 1 và Ga
2).

Mr: Thang ADN chuẩn (25/100 ladder - Bioneer)

Kết hợp kết quả nghiên cứu bằng mồi OPU1, mồi cho gen
laccase và các mồi cho gen Mn SOD, chúng ta có thể thấy
việc phân loại Ganoderma được hệ thống theo bảng sau:


Bảng 1. Kết quả phân loại Ganoderma ở mức độ ADN



Bảng trên cho thấy, nếu một mẫu Ganoderma chạy PCR
với cặp mồi LA 1 và LA 2 tạo ra một hoặc hai băng có kích
thước 217 hoặc 144 bp, không cho sản phẩm PCR với cặp
mồi FGau 1 và RGau 1, tạo ra sản phẩm PCR có kích thước
693 bp với cặp mồi FGau 1 và RGau 2, thì mẫu này sẽ
thuộc Ganoderma lucidum. Nếu một mẫu Ganoderma chạy
PCR với cặp mồi LA 1 và LA 2 tạo ra một băng có kích
thước 144 bp, tạo ra sản phẩm PCR có kích thước 461 với
cặp mồi FGau 1 và RGau 1, tạo ra sản phẩm PCR có kích
thước 755 bp với cặp mồi FGau 1 và RGau 2, thì mẫu này

sẽ thuộc Ganoderma australe. Nếu một mẫu Ganoderma
chạy PCR với cặp mồi LA 1 và LA 2 tạo ra một băng có
kích thước 144 bp, không tạo ra sản phẩm PCR với cặp mồi
FGau 1 và RGau 1, cũng không tạo ra sản phẩm PCR với
cặp mồi FGau 1 và RGau 2, thì có nhiều khả năng mẫu này
sẽ thuộc Ganoderma tortnatum sensulato. Việc phân loại
Ganoderma applanatum sensulato và Ganoderma australe
sensulato sẽ dựa trên các băng đặc hiệu của mồi OPU1 và
sẽ được chúng tôi thực hiện trong các nghiên cứu tiếp theo.



KẾT LUẬN

Đã khuyếch đại được gen Mn SOD của Ganoderma
australe và Ganoderma lucidum bằng các cặp mồi đặc
hiệu.

Gen Mn SOD cũng là một chỉ thị phân tử có triển vọng để
ứng dụng trong việc phân loại và định nhóm Ganoderma ở
Việt nam.


LỜI CẢM ƠN

Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ của Chương
trình Nghiên cứu Cơ bản trong lĩnh vực Khoa học Tự
nhiên, hướng 8.2

This work was supported by the National Basis Research

Program for Natural Sciences, direction 8.2


TÀI LIỆU THAM KHẢO


1. Jong, S. C., and Birmingham, M. J. (1992). Medical
benefits of the mushroom Ganoderma. Advance and
Applied Microbiology. 37, pp. 101-134.

2. Hseu R., Wang H. H., Wang F. H., and Moncalvo M.
J. (1996). Differentiation and grouping of isolates of the
Ganoderma lucidum complex by random amplified
polymorphic DNA- PCR compared with grouping on the
basis of internal transcribed spacer sequences. Applied and
Environmental Microbiology. 62(4), pp. 1354-1363.

3. D’souza, M. T., Boominathan, K., and Reddy A.C.
(1996). Isolation of Laccase Gene-Specific Sequences from
White Rot and Brown Rot Fungi by PCR. Applied and
Environmental Microbiology. 62(10), pp. 1354-1363.

4. Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn Xuân Hùng, Trịnh Tam
Kiệt, Lê Đình Lương. (2005). Nghiên cứu khả năng phân
loại chi Ganoderma bằng kỹ thuật phân tử RAPD-PCR và
mồi đặc hiệu laccase. Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng.
Số 1, trang 5-9.

5. Alscher, R. G., Erturk, N., and Heath, L. S. (2002).
Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling

oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany.
53(372), pp. 1331-1341.

6. Noor, R., Mittal, S., and Iqbal, J. (2002). Superoxide
dismutase - applications and relevance to human diseases.
Med Sci Monit. 8(9), pp. 210-215.

7. Nguyễn Thị Kim Dung, Lê Đình Lương. (2004).
Nghiên cứu khắc phục khó khăn trong tách chiết ADN và
bất hoạt ức chế PCR ở Ganoderma. Tạp chí Di truyền học
và Ứng dụng. Số 4, trang 1-7.

8. Sambrook, J., Frisch, E. F., and Maniatis, T. (1989).
Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
USA.



SUMMARY

Classification of the Ganoderma complex by PCRing
with the specific primers for superoxide dismutase gene

Ganoderma species are known as the valuable herbs.
RAPD-PCR and PCR with the specific primers of laccase
gene or the internal transcribed spacers (ITS) of the
ribosomal gene are the most sensitive and efficient methods
currently available for distinguishing between different
strains of Ganoderma species.

Superoxide dismutases (SODs) are essential enzymes in the
cellular defense mechanism, which catalyse the
disproportion of superoxide radicals to dioxygen and
hydrogen peroxide. SODs are found abundantly in many
organisms, from microorganisms to plants and animals,
since superoxide radicals are toxic to living cells, oxidizing
and degrading biologically important molecules, such as
lipids and proteins. Four different types of SODs are
known, each containing a different metal ion at the active
site: manganese-containing superoxide dismutase (Mn
SOD); iron-containing superoxide dismutase (Fe SOD);
copper-and zinc-containing superoxide dismutase (Cu, Zn
SOD); nickel-containing superoxide dismutase (Ni SOD).
Plant Mn SOD have approximately 65% sequence
similarity to one another, and these enzymes also have high
similarities to bacterial Mn SODs. Mn SODs occur in
mitochondria and peroxisomes. Mn SODs carry one metal
atom per subunit. These enzymes can not function without
the Mn atom present at the active site. Comparison of
deduced amino acid sequences from these SODs suggest
that Mn and Fe SODs are more ancient types of SODs, and
these enzymes most probably have arisen from the same
ancestral enzyme, whereas Cu-Zn SODs have no sequence
similarity to Mn and Fe SODs and probably have evolved
separately in eukaryotes.

RAPD-PCR, PCR for the laccase gene (our previous study)
and PCR with the specific primers of Mn SOD gene
demonstrated that they could be used for classification of
Ganoderma complex in Vietnam.

Người thầm định nội dung khoa học: TS. Dương Văn Hợp