BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA NẤM PHIẾN ĐỐM VÂN LƯỚI PANAEOLUS AFF. RETIRUGIS" docx

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ
ĐỘC TÍNH CỦA NẤM PHIẾN ĐỐM VÂN LƯỚI
PANAEOLUS AFF. RETIRUGIS

Hoàng Văn Vinh, Trịnh Tam Kiệt
Trung tâm Công nghệ Sinh học - ĐHQG Hà nội
Đỗ Ngọc Liên
Trường ĐHKHTN- ĐHQG Hà nội

I. MỞ ĐẦU

Nấm độc có thể gây hại cho con người và động vật có vú
nếu ăn phải chúng. Tuy nhiên, các “độc dược” thu nhận
được từ nấm nếu biết sử dụng đúng cách lại là một nguồn
dược liệu vô cùng quý, có ứng dụng rất lớn đối với việc
điều trị một số bệnh trong y học. Ví dụ như: từ một số loài
nấm độc thuộc chi: Psilocybe, Conocybe, Stropharia,
Panaeolus, Copeladia, Chlorophyllum…con người đã chiết
xuất được nhiều chất có hoạt tính sinh học, mà chủ yếu là
các alkaloid, ở nồng độ cao mang tính độc, có thể giết chết
người và động vật. Tuy vậy với nồng độ thấp, ở liều lượng
thích hợp nó lại là dược liệu quý có tác dụng hỗ trợ trong
khi sản phụ sinh nở, chống bệnh biếu cổ, chống nhức đầu,
cũng như các bệnh thần kinh và tim mạch khác. Đăc biệt
một số loài nấm có chứa độc tố alkaloid gây ra trạng thái ảo
giác gọi là hallucinogenic mushroom có ứng dụng điều trị
các bệnh tâm thần, mất trí nhớ…[3]

Chính vì nhữn lý do trên mà nấm độc ngày càng thu hút sự
quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới.
Và nghiên cứu này cũng nhằm góp phần nhỏ vào sự hiểu

biết chung về nấm độc đặc biệt là nấm độc Việt Nam.

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu:

- Nấm Panaeolus aff. retirugis được thu hái trên bãi cỏ
chăn thả trâu bò tại Hà Nội và Gia Bình- Bắc Ninh.
- Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, trọng lượng trung bình từ
23- 24g do Viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp.
- Máu người: nhóm máu A, B, O do Việt huyết học và
truyền máu- bệnh viện Bạch Mai cung cấp.
- Các chủng vi sinh vật do Bảo tàng giống chuẩn vi sinh
vật- TTCNSH- ĐHQG cung cấp.
- Các hoá chất được sử dụng dưới dạng tinh khiết.

Phương pháp

- Phân loại học theo phương pháp của Trịnh Tam Kiệt [5]
- Nghiên cứu sự mọc và sự hình thành quả thể theo các
phương pháp nghiên cứu của Trịnh Tam Kiệt và các tác giả
[4]
- Định tính và tách chiết alkaloid tổng số theo các phương
pháp cập nhật đã được mô tả [8, 10, 11]
- Thực hiện phản ứng gây ngưng kết hồng cầu theo nguyên
tắc của Gebauer [9]
- Thử khả năng kháng khuẩn của độc tố: Theo phương pháp
khuyếch tán trên đĩa thạch. Môi trường nuôi cấy là
Mueller- Hinton [9, 6]

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Nghiên cứu hình thái quả thể và bào tử

Panaeolus aff. retirugis (Fr.) Gill, Họ Strophariacea
Singer KA. H. Sm. 1946, thuộc chi Panaeolus (Fr.) Quel.,
1872. Đây là một chi tương đối lớn, ở Việt Nam đã có 10
loài được ghi nhận [5]. Mũ nấm khi non có hình cầu, khi
mở ra thành hình bán cầu, màu trắng xám. Bề mặt mũ nhẵn
bóng và khô, không nhày dính, đường kính khoảng 1-3cm.
Phiến màu xám nhạt khi non, sau màu xám đen, lốm đốm
(do bào tử chín không đều tạo nên những đốm đen trên nền
xám). Cuống cùng màu với mũ, mảnh, dễ gẫy. Thịt nấm
mỏng, màu trắng. Bào tử màu nâu, hình quả chanh, kích
thước: 12- 14vm x 6-8m. Chúng thường mọc trên phân
trâu bò mục, các bãi cỏ chăn thả gia súc, ven đường, đất
trồng có bón phân chuồng. Đây là loài nấm độc mọc quanh
năm.

Hình1: Quả thể và bào tử của nấm Panaeolus aff. retirugis


2. Nghiên cứu sự mọc của nấm

Giống gốc thuần khiết được phân lập từ mô rất mỏng
của quả thể nấm Panaeolus aff. retirugis. Giống gốc nấm
trên môi trường thạch nghiêng được cấy truyền sang môi
trường thạch trong bình tam giác để nghiên cứu tốc độ sinh
trưởng của hệ sợi, kết quả được chỉ ra trong bảng sau:

Bảng 1: Tốc độ mọc của sợi nấm

Qua kết quả nghiên cứu hệ sợi của nấm Paneolus aff.
retirugis trên môi trường thạch chúng tôi nhận thấy: Sau
khi tách phân lập được giống thuần khiết từ miền mô thể
quả non, hệ sợi phát triển tốt ở 25 ± 3
O
C trên môi trường
thạch. Tốc độ mọc của sợi nhìn chung là khá chậm (68-70
m/giờ). Sau khoảng 7-15 ngày hệ sợi mọc dày đặc trên bề
mặt thạch và sau khoảng 26 ngày bắt đầu xuất hiện sắc tố
vàng ở vùng tâm khuẩn lạc (miền sợi già) đó là dấu hiệu
xuất hiện mô sẹo.

Khi quan sát dưới kính hiển vi, sợi nấm Paneolus aff.
retirugis là sợi có vách ngăn, tồn tại dưới 2 dạng: dạng sợi
bình thường, đó là dạng sợi mảnh, có độ dày khoảng 2-3
m, không nhìn thấy các hạt nội chất bên trong. Dạng thứ 2
là dạng sợi căng phình, bên trong chứa nhiều hạt nội chất,
có độ dày khoảng 4-10 m.

3. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học
3.1. Định tính alkaloid

Để xác định nhanh sự có mặt của alkaloid trong nấm, ta
có thể tiến hành theo cách đơn giản sau: Lấy 1-2 g nguyên
liệu, ngâm vào 5 ml dung dịch CH
3
COOH 1%, đun sôi, lọc

qua giấy lọc, li tâm bỏ cặn. Dịch lọc đem thử với các thuốc
thử đặc hiệu với alkaloid [2, 7]
Bảng 2: Phát hiện các hợp chất alkaloid trong nấm.


Kết quả bảng 2 cho thấy:
Các phản ứng phát hiện alkaloid trong nấm Paneolus aff.
retirugis đều dương tính, chứng tỏ sự có mặt của nhóm chất
này ở trong nấm Panaeolus aff. retirugis. Điều này hoàn
toàn đúng so với kết quả đã công bố của các tác giả nghiên
cứu về những chất này[12]

3.2. Chiết xuất và định lượng alkaloid tổng số

Dựa vào tính chất của alkaloid, có thể tiến hành chiết rút
alkaloid ra khỏi nguyên liệu, trước hết cần kiềm hoá
nguyên liệu để đẩy alkaloid ra ở dạng tự do rồi rút alkaloid
bằng dung môi hữu cơ. Sau đó có thể cho bay hơi dung môi
và cân trực tiếp lượng alkaloid đã được tách ra, hoặc có thể
chuẩn độ alkaloid được tách ra bằng axít và dựa vào lượng
axít đã dùng để chuẩn độ tính ra lượng alkaloid [7].
Bảng 3: Hàm lượng alkaloid tổng số trong nấm Panaeolus
aff. retirugis.


Như vậy, hàm lượng alkaloid tổng số trong nấm Panaeolus
aff. retirugis khá cao, có thể đạt tới 49 ÷ 50 mg/g bột nấm
khô (chiếm tới gần 5% trọng lượng khô của nấm ). Do đó
cần phải quan tâm đến hợp chất này về mặt khai thác cũng
như thành phần và chức năng sinh dược học của chúng.

Chế phẩm alkaloid tổng số này được dùng để thử độc tính
của chúng.

4. Kết quả nghiên cứu độc tính
4.1. Thử độc tính trên đối tượng tế bào hồng cầu

Chế phẩm alkaloid tổng số được hoà vào PBS với tỷ lệ
chế phẩm/PBS =1g/20ml. Sau đó dùng dịch này tiến hành
thử hoạt tính trên hồng cầu của 3 nhóm máu: A, B, O. Kết
quả thu được như sau: Mặc dù chế phẩm của loài nấm này
không gây ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu nhưng chúng
có khả năng làm tan huyết (giống với hiện tượng làm tan
huyết của Saponin )
Bảng 4: Hoạt tính làm tan huyết của độc tố nấm


Qua bảng kết quả cho ta thấy: Khả năng làm tan huyết của
độc tố trong nấm Panaeolus aff. retirugis thể hiện trên cả 3
nhóm máu. Trong đó khả năng làm tan huyết mạnh nhất ở
nhóm máu A (90 HHA).

4.2. Thăm dò khả năng kháng khuẩn của chế phẩm thô

Chế phẩm chiết rút từ nấm Panaeolus aff. retirugis được
hoà với nước cất tạo thành dạng nhũ dịch với nồng độ là
0.025 g/ml. Thử nghiệm được tiến hành trên 3 chủng vi
khuẩn gram (-) và 2 chủng vi khuẩn gram (+). Kết quả thu
được như sau:
Bảng 5: Tính kháng của chế phẩm chiết từ nấm Panaeolus
aff. retirugis

Từ kết quả bảng trên cho thấy: Chế phẩm chiết rút từ nấm
Panaeolus aff. retirugis có khả năng kháng đối với chủng
gram (-) là S.typhy (không kháng đối với các chủng còn
lại). Do đó cần phải được nghiên cứu kỹ hơn để xác định
chính xác chất nào trong alkaloid tổng số thể hiện tính
kháng khuẩn trên.

4.3. Thử độc tính cấp của chế phẩm trên đối tượng chuột

Chế phẩm (độc tố) được hoà tan với nước tạo thành
dạng nhũ dịch với các nồng độ từ 5- 20% tương ứng với
từng lô, đưa vào cơ thể chuột theo đường uống, đảm bảo
thể tích nhũ: 0.4 ml/chuột. Chúng tôi đã tiến hành thí
nghiệm trên 25 chuột nhắt, được chia thành 5 lô, trong đó:

+ Thí nghiệm A: 1 lô đối chứng, uống nước cất
+ Thí nghiệm B: 4 lô, uống chế phẩm độc tố với các
nồng độ tương ứng: 5%, 10%, 15% và 20%.

Kết quả, ở thí nghiệm A- lô đối chứng: Trong thời gian thí
nghiệm chuột sống khoẻ mạnh, không có biểu hiện gì khác
thường.

Ở thí nghiệm B: Với nồng độ thấp 5% sau khi uống, chuột
có hiện tượng giảm hoạt động và khó thở nhẹ, hơi lờ đờ,
sau 5 giờ hồi phục dần và sống hoàn toàn qua 24 giờ. Với
nồng độ cao hơn sau khi uống 20 phút đã giảm hoạt động,
khó thở lảo đảo như say, đầu co giật, trương phềnh bụng,
có phản ứng ngứa ngáy, xù lông, tím tái, hiện tượng trên

tăng dần theo nồng độ. Nhiều chuột vật vã nhảy chồm lên
mất phản xạ lật, khi chết toàn thân mềm. Một số chuột qua
cơn vật vã chống cự được thì hồi phục dần sau 10 giờ. Tỷ
lệ chuột chết tăng theo nồng độ.
Bảng 6: Tỷ lệ chuột chết dưới tác động của độc tố alkaloid
trong nấm Panaeolus aff. retirugis.


Ngay sau khi chuột chết, chúng tôi tiến hành mổ để quan
sát phủ tạng. Kết quả cho thấy

- Phổi xung huyết, một số phế nang chảy máu.
- Não không thấy tổn thương.
- Dạ dày, ruột trương phềnh , trong chứa đầy khí.

Hình 2: Chuột chết do uống chất độc trong nấm Panaeolus
aff. retirugis


IV. KẾT LUẬN

1. Nấm Paneolus aff. retirugis có khả năng phân lập thuần
khiết và nuôi cấy trên môi trường thạch khoai tây với tốc
độ mọc của sợi nấm là 68-70 m/giờ. Sợi nấm có các tế
bào phình chứa nội chất, đạt kích thước tới 10 m đường
kính.

2. Hàm lượng alkaloid tổng số được chiết rút từ nấm
Paneolus aff. retirugis là: (49,5 ± 0.3) mg/g.

3. Độc tố trong nấm Paneolus aff. retirugis có khả năng
gây tan huyết trên cả 3 nhóm máu: A, B, O ở người và ức
chế đối với chủng vi khuẩn Salmonella typhy. Độc tố này
tác dụng nhanh, mạnh lên cơ thể chuột (với liều uống 3330
mg/kg số chuột chết chiếm tới 80%).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lê Huy Chính (2001), Vi Sinh vật y học, Nxb Y học, Hà
Nội.
2. Trần Công Khánh, Phạm Hải (1992), Cây độc ở Việt
Nam - nhiễm độc, giải độc và cách điều trị, NxbY học, Hà
Nội.
3. Trịnh Tam Kiệt (1981), Nấm lớn ở Việt Nam, Nxb khoa
học, Hà nội.
4. Trịnh Tam Kiệt và cộng sự (1996), Sinh học và kỹ thuật
nuôi trồng nấm ăn, Nxb Nông nghiệp, Hà nội.
5. Trịnh Tam Kiệt và các cộng sự (2001), Danh lục thực vật
Việt nam- phần nấm, tr. 296.
6. Hoàng Thuỷ Long (1991), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh
vật y học, tr.328.
7. Nguyễn Quang Vinh, Bùi phương Thuận, Phan Tuấn
Nghĩa (1997), Thực tập hoá sinh học, tr.75-76.
8. Goodwin & Mercer (1989), “introduction to plant
biochemistry”, The Alkaloid, pp.480-527. 9. Fleish M. and
Maider L., 1985: A one step procedure proisolation and
resolution of the Phaseolus vulgaris isolectin by affinity
chrromatography. Biol. Chem. Hoppe- Seyler, 266, pp.
1029- 1032.
10. Richard B (1995), "The organic chemistry of drug

design and drug action", Acdemic Press, Inc Lon Don,
pp.289.
11. Vander Gergher D.A and Vlietink A.J (1994),
"Menthod in plant biochemistry".
12. http:// Panaeolus/ DaoDas1. htm.


SUMMARY

RESEACHING BIOLOGICAL CHARACTERISTIC
AND TOXIN OF
PANAEOLUS AFF. RETIRUGIS

Hoang Van Vinh, Trinh Tam Kiet
Center of biotechnology - Vietnam national
University, Hanoi
Do Ngoc Lien
Vietnam national university, Hanoi

The fungi Panaeolus aff. retirugis is isolated and
growing in pure culture of potato- agar with increasing
speed 70 m/h. Total alkaloid's content was extrated in this
fungi about 49.5 ± 0.3 mg/g. Toxin in panaoelus aff.
retirugis able to dissolve red blood cells of the three of
human blood A, B, O and to restrain bacterria: Samonella
typhy. Specialy, whitle mouse was died about 80% by this
toxin with dose: 3330 mg/g.