BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN LOẠI CHI Ganoderma BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ RAPDPCR VÀ MỒI ĐẶC HIỆU LACCASE" doc

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN LOẠI CHI
Ganoderma BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ RAPD-
PCR VÀ MỒI ĐẶC HIỆU LACCASE

Nguyễn Hoài Giang
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
Nguyễn Xuân Hùng, Trịnh Tam Kiệt, Lê Đình Lương
Trung tâm Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà nội

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ lâu, nấm linh chi (Ganoderma) được biết tới như một
loại thuốc dân gian có tác dụng tăng cường sức khoẻ và
chữa trị nhiều loại bệnh (bệnh thận, gan, bệnh tiểu đường,
bệnh tim mạch, dị ứng ). Ganoderma có khả năng tăng
cường sự thải độc ở gan và kích thích hệ thống miễn dịch
hoạt động hiệu quả hơn. Ganoderma còn kìm hãm sự sinh
tổng hợp ADN mới của tế bào ung thư, kìm hãm sự phát
triển của các khối u và hạn chế sự di căn. Các nghiên cứu y
và dược học cũng cho thấy các loài Ganoderma khác nhau
cũng có thể sản sinh ra các loại hợp chất sinh học có hoạt
tính khác nhau (1). Việc phân loại Ganoderma dựa vào
hình thái và các isozym gặp nhiều khó khăn, nhiều khi
thiếu chính xác. Gần đây, việc sử dụng đoạn trình tự ITS
(Internal Transcribed Spacer) của ADN ribosom và kỹ
thuật nhân bản ngẫu nhiên ADN bằng mồi tuỳ ý (Random
Amplified Polymorphic DNA: RAPD) đã góp phần quan
trong trọng việc phân loại Ganoderma ở mức độ ADN (2).

Ngoài tác dụng làm thuốc, Ganoderma cũng là những loài
nấm gây bệnh và phá huỷ nhiều cây thân gỗ. Laccase,

lignin peroxidases (LIPs) và peroxidases phụ thuộc mangan
(MNPs) là ba nhóm enzym được cho là có vai trò quan
trọng trong việc phân huỷ gỗ của các loại nấm. Enzym
laccase, LIPs và MNPs có khả năng oxy hoá các phức
phenolic để tạo thành gốc phenoxy. Mỗi phân tử enzym
laccase liên kết với bốn nguyên tử đồng. Những nghiên cứu
về cấu trúc và chức năng của laccase cho thấy tại vị trí giữa
một axit amin cystein và mười axit amin histidin là điểm
bám cho bốn nguyên tử đồng và trình tự ở quanh vị trí này
thường rất ít thay đổi ở những loài nấm khác nhau (3, 4).

Nghiên cứu này giới thiệu một cách tiếp cận nhằm góp
phần phân loại và xếp nhóm ở Ganoderma: Sử dụng
RAPD-PCR với mồi ngẫu nhiên OPU1 và PCR với cặp
mồi đặc hiệu cho hai đoạn trong gen laccase.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP:

Vật liệu:

Các mẫu nấm Ganoderma lucidum với các nhóm dưới loài
khác nhau được ký hiệu là Gl 1 và Gl 2; Ganoderma
australe sensulato với các nhóm dưới loài khác nhau được
ký hiệu là Ga 1 và Ga 2; Ganoderma applanatum sensulato
với các nhóm dưới loài khác nhau được ký hiệu là Gb 1 và
Gb 2; Ganoderma tortnatum sensulato với các nhóm dưới
loài khác nhau được ký hiệu là Gc 1 và Gc 2; Ganoderma
australe được ký hiệu là Gau, do phòng thí nghiệm nấm -
Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội
cung cấp.

Phương pháp nghiên cứu:

- Tách chiết ADN từ các mẫu Ganoderma theo phương
pháp của Porebski và được thích ứng với điều kiện phòng
thí nghiệm của Việt Nam theo cải tiến của các tác giả
Nguyễn Thị Kim Dung và Lê Đình Lương (6).

- Kỹ thuật RAPD-PCR với mồi OPU 1, trình tự là 5'-
ACGGACGTCA -3' (6). - PCR với mồi đặc hiệu cho 2
đoạn gen laccase của G. lucidum 103561 (4).

- Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid 6% và
nhuộm bạc (7).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR để phân loại Ganoderma

Đoạn trình tự ITS của ADN ở ribosom được sử dụng rất
phổ biến trong nghiên cứu phân loại Ganoderma. Tuy
nhiên, thông tin về trình tự vùng ITS nhiều khi không thay
đổi ở một số taxon gần nhau. Do vậy nếu chỉ sử dụng kết
quả đoạn ITS sẽ không đảm bảo có sự chính xác cao trong
phân loại Ganoderma (2). Trong thời gian gần đây, kỹ
thuật RAPD-PCR được sử dụng rất phổ biến và là một
trong những phương pháp nhạy, có hiệu quả cao để phân
biệt những taxon không thể phân biệt được bằng ITS (2).

Để phân loại các loài Ganoderma mà chúng tôi hiện đang

có, kỹ thuật RAPD-PCR với mồi OPU 1 được sử dụng (6).
Điều kiện PCR sau khi được tối ưu hoá là 94
o
C 2 phút/ 35
chu kỳ với 94
o
C 1 phút, 46
o
C 30 giây, 72
o
C 2 phút/ 72
o
C
10 phút.

Kết quả điện di trên gel polyacrylamid 6% và nhuộm bạc
cho thấy: các mẫu Ganoderma lucidum có 5 băng ADN
giống nhau với kích thước khoảng 1636, 800, 690, 630 và
450 bp; các mẫu Ganoderma australe sensulato có 4 băng
ADN giống nhau với kích thước khoảng 1824, 407, 370 và
300 bp; các mẫu Ganoderma applanatum sensulato có 3
băng ADN giống nhau với kích thước khoảng 310, 240 và
140 bp; các mẫu Ganoderma tortnatum sensulato có 4 băng
ADN giống nhau với kích thước khoảng 702, 510, 412 và
350 bp. Mẫu Ganoderma australe có 1 băng ADN kích
thước khoảng 450 bp giống như các mẫu Ganoderma
lucidum.

Kết quả RAPD-PCR với mồi OPU 1 cho thấy các mẫu nấm
Ganoderma lucidum, Ganoderma australe sensulato,

Ganoderma applanatum sensulato, Ganoderma tortnatum
sensulato và Ganoderma australe có những băng ADN đặc
trưng riêng của từng loài. Hơn nữa, ở các mẫu dưới loài
ngoài những băng khác nhau, giữa chúng còn có những
băng đặc trưng riêng biệt.

Hình 1. Kỹ thuật RAPD-PCR với các mẫu Ganoderma
khác nhau
Giếng 1 và 2: Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2).
Giếng 3: Ganoderma australe (Gau).
Giếng 4 và 5: Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc
2).
Giếng 6 và 7: Ganoderma applanatum sensulato (Gb 1 và
Gb 2).
Giếng 8 và 9: Ganoderma australe sensulato (Ga 1 và Ga
2).
Mr: Thang ADN chuẩn 1kb


Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho 2 đoạn của gen laccase
trong phân loại Ganoderma

Những nghiên cứu về gen laccase cho thấy vùng I và II ở vị
trí bám của nguyên tử đồng thường có trình tự không thay
đổi (4). Vùng bảo thủ này tại đầu N của enzym laccase có
trình tự là HWHGFQ và TFWYHSH. Căn cứ vào các axit
amin này chúng tôi đã thiết một cặp mồi đặc hiệu cho gen
này ở Ganoderma lucidum 103561 là LA1: 5'- CAT TGG
CAC GGA TTC TTC -3’; LA2: 5'- ATG GCT GTG GTA
CCA GAA -3'. Điều kiện PCR sau khi tối ưu hoá là 94

o
C 3
phút/ 30 chu kỳ với 94
o
C 30 giây, 55
o
C 30 giây, 72
o
C 20
giây/ 72
o
C 3 phút.

Kết quả điện di các sản phẩm PCR cho thấy: Ganoderma
lucidum (Gl 1 và Gl 2) tạo ra 2 băng ADN với kích thước
217 và 144 bp. Ganoderma australe (Gau) tạo ra 1 băng
kích thước 144 bp. Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1
và Gc 2) tạo ra 1 băng kích thước 144 bp. Ganoderma
australe sensulato và Ganoderma applanatum sensulato
(Ga và Gb) không cho sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu
cho các đoạn trong gen laccase của Ganoderma lucidum
103561 (Hình 2). Kết quả với mồi ngẫu nhiên OPU 1 (từ
giếng 6 đến 9, hình 1) đã khẳng định tất cả các mẫu
Ganoderma đã được tách chiết tốt. Việc không tạo ra PCR
sản phẩm của Ganoderma australe sensulato và
Ganoderma applanatum sensulato chỉ có thể là do trình tự
gen laccase (nếu có) của chúng khác với trình tự của
Ganoderma lucidum 103561 tại vị trí được chúng tôi thiết
kế cặp mồi.

Kết quả này phù hợp với kết quả tách dòng gen laccase từ
nhiều loài nấm khác nhau của D’souza và các cộng sự
(1996). Sử dụng cặp mồi thoái hoá (degenerate PCR
primers) được thiết kế tại vùng bảo thủ của gen laccase,
D’souza và các cộng sự quan sát được 2 băng sản phẩm
PCR kích thước 217 và 144 bp ở các loài nấm Ganoderma
lucidum 103561, Grifola frondosa, Lentinula edodes và
Lentinus tigrinus. Ở các loài nấm Ganoderma lucidum
58537, Phlebia brevispora, Phlebia tremellosa và Trametes
versicolor sản phẩm PCR với cặp mồi kể trên chỉ là một
băng với kích thước 217 bp. Trong thí nghiệm sử dụng cặp
mồi laccase do chúng tôi thiết kế cũng cho 1 băng duy nhất
kích thước 217 bp với Ganoderma lucidum của Hàn quốc
(kết quả chưa công bố). Ở loài Gloeophyllum trabeum sản
phẩm PCR của gen laccase lại chỉ là một băng duy nhất với
kích thước 144 bp. Ngược lại ở các loài nấm Fomes
fomentarius và Pleurotus ostreatus thì không quan sát được
sản phẩm PCR.

Kết quả nghiên cứu này cũng gợi ý chúng tôi việc sử dụng
cặp mồi đặc hiệu của gen laccase ở Ganoderma lucidum
103561 để thực hiện phân loại Ganoderma. Về cơ bản nếu
1 mẫu nấm cho 2 băng ADN sản phẩm PCR (217 và 144
bp) với cặp mồi đặc hiệu cho gen laccase của Ganoderma
lucidum 103561 thì chúng có nhiều khả năng sẽ thuộc
nhóm Ganoderma lucidum.

Nếu mẫu nấm cho 1 băng ADN sản phẩm PCR (144 bp) thì
mẫu này có nhiều khả năng thuộc nhóm Ganoderma
australe hoặc Ganoderma tortnatum sensulato. Ngược lại

nếu không tạo ra được sản phẩm PCR thì mẫu đó ít có khả
năng là Ganoderma lucidum, Ganoderma australe hoặc
Ganoderma tortnatum sensulato. Nhóm Ganoderma
australe sensulato và Ganoderma applanatum sensulato có
thể vẫn có gen mã hoá cho enzym laccase nhưng trình tự sẽ
khác với cặp mồi chúng tôi đã thiết kế, vì vậy không cho
sản phẩm PCR khi được nhân lên với cặp mồi đặc hiệu của
Ganoderma lucidum 103561.

Bước tiếp theo của nghiên cứu này sẽ là tiến hành giải trình
tự các đoạn gen laccase của các loài Ganoderma ở Việt
nam, để nghiên cứu sự giống và khác nhau của các loài
Ganoderma lucidum. Sau khi biết trình tự của các đoạn
trong gen laccase này chúng tôi có thể sẽ sử dụng kỹ thuật
RFLP để phân biệt các loài khác nhau cho cùng một kích
thước sản phẩm PCR với gen laccase.

Hình 2. Nhân các đoạn gen laccase từ các mẫu Ganoderma
khác nhau bằng PCR
Giếng 1 và 2: Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2).
Giếng 3: Ganoderma australe (Gau).
Giếng 4 và 5: Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc
2).
Giếng 6 và 7: Ganoderma applanatum sensulato (Gb 1 và
Gb 2).
Giếng 8 và 9: Ganoderma australe sensulato (Ga 1 và Ga
2).
Mr: Thang ADN chuẩn 1kb

KẾT LUẬN

Kỹ thuật RAPD-PCR có thể sử dụng để xác định mối quan
hệ về nguồn gốc các loài Ganoderma đang có ở Việt nam.

Gen laccase là một chỉ thị phân tử có triển vọng để ứng
dụng trong việc phân loại và định nhóm Ganoderma ở Việt
nam.

LỜI CẢM ƠN

Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ của Chương
trình Nghiên cứu Cơ bản trong lĩnh vực Khoa học Tự
nhiên, hướng 8.2

This work was supported by the National Basis Research
Program for Natural Sciences, direction 8.2

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Jong, S. C., and Birmingham, M. J. (1992). Medical
benefits of the mushroom Ganoderma. Advance and
Applied Microbiology. 37, pp. 101-134.
2. Hseu R., Wang H. H., Wang F. H., and Moncalvo M. J.
(1996). Differentiation and grouping of isolates of the
Ganoderma lucidum complex by random amplified
polymorphic DNA- PCR compared with grouping on the
basis of internal transcribed spacer sequences. Applied and
Environmental Microbiology. 62(4), pp. 1354-1363.
3. Thurston, C. F. (1994). The structure and function of

fungal laccases. Microbiology. 140, pp. 19-26.
4. D’souza, M. T., Boominathan, K., and Reddy A.C.
(1996). Isolation of Laccase Gene- Specific Sequences
from White Rot and Brown Rot Fungi by PCR. Applied
and Environmental Microbiology. 62(10), pp. 1354-1363.
5. Poreski, S., Bailey, G. L., and Baum, R. B. (1997).
Modification of a CTAB Extraction Protocol for Plant
containing High
Polysaccharide and Polyphenol Components. Plant
Molecular Biology. 15(1), pp. 8-15.
6. Nguyễn Thị Kim Dung, Lê Đình Lương. (2004). Nghiên
cứu khắc phục khó khăn trong tách chiết ADN và bất hoạt
ức chế PCR ở Ganoderma. Tạp chí Di truyền học và ng
dụng. Số 4, trang 1-7.
7. Sambrook, J., Frisch, E. F., and Maniatis, T. (1989).
Molecular Cloning.

SUMMARY

Classification of the Ganoderma complex by RAPD- PCR
and specific primers of laccase gene

Ganoderma species are known as the herb of longevity.
These fungi have been used in folk medicine for hundreds
of years. The use of traditional taxonomic methods has
been inconclusive for establishing a stable classification of
the group, and these methods are useless for
characterization of individual strains. Parsimony analysis of
nucleotide sequences from the internal transcribed spacers
(ITS) of the ribosomal gene can be used to distinguish

some monophyletic groups of the Ganoderma species.
However, some other Ganoderma species have identical
ITS sequences. RAPD-PCR is one of the most sensitive and
efficient methods currently available for distinguishing
between different strains of a species. RAPD-PCR is
helpful for systematics at the lower taxonomic levels that
are unsolved by ITS sequence data. Laccase are copper-
containing oxidases which catalyze the four-electron
oxidatin of a variety of phenolic compound and
simultaneous four-electron reduction of oxygen to water.
Structure-function studies of laccase have shown that one
cysteine and ten histidine residues are involved in binding
the four copper atoms and that the sequences around these
residues are highly conserved in different laccases.

Our data demonstrated that RAPD-PCR with OPU1 primer
(5'- ACGGACGTCA -3') and PCR with the specific pair of
PCR primers for laccase gene from Ganoderma lucidum
103561 (LA1: 5'- CAT TGG CAC GGA TTC TTC -3’ and
LA2: 5'- ATG GCT GTG GTA CCA GAA -3') can be used
for classification of Ganoderma complex in Vietnam.

Người thẩm định nội dung khoa học: GS.VS. Vũ Tuyên
Hoàng