TỔNG QUAN VỀ ĐÔNG LẠNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA (Vitrification) pot

TỔNG QUAN VỀ ĐÔNG LẠNH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA
(Vitrification)


GIỚI THIỆU
Trứng và phôi có thể sống, tiếp tục phát triển sau khi được đông lạnh - rã đông hay
không; chúng ta có thể khống chế được những rủi ro xảy ra cho trứng và phôi
trong suốt quá trình thực hiện hay không là điều không dễ dàng. Ngoài việc thành
thạo về thao tác của người thực hiện, chọn lựa được chất lượng trứng và phôi tốt
để lưu trữ, việc chọn lựa một chương trình hạ nhiệt độ thích hợp có ảnh hưởng rất
lớn đến thành công của một quy trình đông lạnh trứng và phôi. Hiện nay, kỹ thuật
đông lạnh có thể được chia thành 2 nhóm chính: hạ nhiệt độ chậm (slow freezing)
và thủy tinh hóa (vitrification). Sự lựa chọn phác đồ đông lạnh ở từng trung tâm
phụ thuộc vào một số yêu cầu như (1) tính hiệu quả, (2) tính an toàn, (3) tính tiện
lợi và (4) khả năng ứng dụng trong thực tế để phù hợp với điều kiện hiện có của
từng trung tâm.
Trong thời điểm hiện tại, ở nhiều trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm, phương
pháp hạ nhiệt độ chậm với chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectant) là Propanediol
(PrOH) đang được ứng dụng khá phổ biến. Với phác đồ đông lạnh và rã đông hiện
đang được sử dụng như trên, nhiều báo cáo trên thế giới cho thấy tỷ lệ phôi sống
sau rã đông vào khoảng 70 – 80% và tỷ lệ thai lâm sàng trên một chu kỳ chuyển
phôi trữ lạnh thay đổi tùy trung tâm, chỉ trong khoảng 16 – 30%. Phương pháp hạ
nhiệt độ chậm có thể dẫn đến hình thành tinh thể nước đá bên trong tế bào khi
nhiệt độ hạ từ -50oC đến -150oC. Đây là nguyên nhân chính gây vỡ màng trong
suốt hoặc vỡ tế bào và dẫn đến thất bại.
Trong vài năm gần đây, phương pháp thủy tinh hóa với các cải tiến mới được
nhiều trung tâm áp dụng thành công trong trữ lạnh trứng và phôi người. Phương
pháp thủy tinh hóa rất được các nhà phôi học lâm sàng quan tâm và áp dụng ngày
càng phổ biến (chủ yếu trên trứng và phôi phát triển ngày 3 hoặc ở giai đoạn phôi
nang) nhờ tính chất đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả cao. Thành công của việc

ứng dụng này góp phần không nhỏ trong việc tiết kiệm được thời gian và nhân sự
trong một đơn vị thụ tinh trong ống nghiệm ở người, đồng thời giảm chi phí điều
trị và nâng cao tỉ lệ thành công cho người bệnh.
KỸ THUẬT THỦY TINH HÓA (Vitrification)
Trữ lạnh phôi và trứng người được thực hiện thành công đầu tiên bởi Trouson vào
năm 1986. Sau sự ra đời của em bé đầu tiên từ phôi trữ lạnh (năm 1983), trữ lạnh
phôi trở thành một hướng mở không thể thiếu trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản ở
người.
Phương pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa được Rall và Fahy thực hiện
thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985. Kỹ thuật này được thực hiện rộng
rãi trên gia súc vào nhiều năm sau đó. Tuy nhiên, quy trình này chỉ được
Kuleshova và Lopata ứng dụng đầu tiên trên trứng người vào năm 1999 và sau đó
vài tháng, được thực hiện đầu tiên trên phôi người đang phát triển ở giai đoạn phôi
nang bởi Lane. Vào ngày 20/6/1999, em bé đầu tiên trên thế giới từ phôi trữ lạnh
bằng kỹ thuật thủy tinh hóa ra đời.
Hiện nay, đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa đang là một kỹ thuật được
các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm lớn trong khu vực và thế giới đưa vào
ứng dụng trong thực tiễn điều trị và đang dần thay thế phương pháp hạ nhiệt độ
chậm trước đây. Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng không ngừng thực hiện
những kiểm chứng lâm sàng nhằm chứng minh kỹ thuật này thật sự an toàn đối
với con người.
Khái niệm về phương pháp thủy tinh hóa
Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh.
Trong suốt quá trình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế
bào chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt giống như thủy tinh (glass-like), đặc
biệt không có sự hình thành tinh thể đá bên trong mẫu tế bào, cũng như môi
trường bên ngoài trong quá trình làm lạnh.
Sau khi được cân bằng với môi trường có nồng độ chất bảo quản đông lạnh rất cao
(4 – 8M), mẫu trứng hoặc phôi được cho vào các dụng cụ chứa và nhúng trực tiếp
vào nitơ lỏng, không qua quá trình hạ nhiệt độ theo từng bước như trong đông lạnh

chậm. Tốc độ làm lạnh của phương pháp này rất lớn, khoảng 2000 – 2500oC /
phút.
Ưu điểm của kỹ thuật thủy tinh hóa
Trong hạ nhiệt độ chậm, quá trình mất nước cần được diễn ra từ từ để hạn chế sự
thành lập tinh thể nước đá. Do đó, thời gian cần thiết để hoàn tất một quy trình
đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm có thể kéo dài gấp 10 lần so với hạ
nhiệt độ cực nhanh. Để có thể đảm bảo được tốc độ hạ nhiệt trong phương pháp
đông lạnh chậm, người ta cần trang bị hệ thống hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng. Chi
phí đầu tư cho một hệ thống này rất cao, chưa kể đến chi phí bảo trì và sửa chữa
hằng năm. Trong khi đó, với phương pháp thủy tinh hóa, cơ sở thực hiện không
cần phải trang bị bất kỳ thiết bị nào.
Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp thủy tinh hóa
cao gấp 4 – 5 lần so với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong
phương pháp đông lạnh chậm trước đây. Ưu thế này giúp cho quá trình khử nước
bên trong tế bào xảy ra nhanh và hoàn toàn hơn. Kết quả là không có sự hình
thành thể đá bên trong tế bào, nhờ đó tế bào có thể tránh được những tổn thương
màng và các bào quan do tinh thể đá gây ra. Qua kết quả đánh giá thực nghiệm,
phương pháp thủy tinh hóa cho tỉ lệ sống sau rã đông của phôi và trứng cao hơn
rất nhiều so với phương pháp đông lạnh chậm trước đây.
Hiệu quả cao của đông lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ cực nhanh so với hạ
nhiệt độ chậm cũng được nhiều tác giả báo cáo. Các nghiên cứu thực nghiệm trên
phôi chuột cũng như phôi người ở các giai đoạn phát triển đều cho thấy tỷ lệ phôi
bào còn sống sau rã đông, tỷ lệ phôi tiếp tục phát triển sau rã đông cũng như số tế
bào trong khối tế bào bên trong (ICM – inner cell mass) của phôi nang ở nhóm
phôi đông lạnh bằng hạ nhiệt độ cực nhanh cao hơn so với nhóm phôi sử dụng
phương pháp hạ nhiệt độ chậm. Tuy chưa có một nghiên cứu nào đủ lớn được thực
hiện nhằm đánh giá hiệu quả của phương pháp này ở tất cả các giai đoạn phát triển
của phôi, nhưng kết quả bước đầu rất khả quan, đặc biệt ở những trường hợp trữ
lạnh trứng. Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phôi phân chia và tỷ lệ phôi phát triển đến
giai đoạn phôi nang từ những chu kỳ sử dụng trứng trữ lạnh bằng phương pháp

thủy tinh hóa cao hơn so với nhóm trữ lạnh bằng phương pháp hạ nhiệt độ chậm…
Do đó, tại hầu hết các báo cáo về đông lạnh trứng người, phương pháp thủy tinh
hóa là kỹ thuật được ưu tiên lựa chọn đầu tiên.
Tính an toàn của phương pháp này cũng được chứng minh qua một số nghiên cứu.
trong một nghiên cứu vào năm 2005 tại Nhật trên 147 trẻ sinh ra từ phôi trữ lạnh
bằng phương pháp hạ nhiệt độ cực nhanh, các tác giả đã không tìm thấy sự khác
biệt nào về các yếu tố sản khoa cũng như tỷ lệ dị tật so với nhóm trẻ sinh ra từ
chuyển phơi tươi.
Qua bảng so sánh (bảng 1), chúng ta có thể nhận thấy rằng phương pháp thủy tinh
hóa tỏ ra có nhiều ưu thế hơn so với phương pháp đơng lạnh chậm: ngồi ưu điểm
tiết kiệm về thời gian, giảm bớt chi phí cho một trường hợp đơng lạnh trứng hoặc
phơi, khả năng sống sau rã đơng của trứng / phơi khi được đơng lạnh bằng kỹ thuật
thủy tinh hóa cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật đơng lạnh chậm.
Bảng 1: So sánh giữa hai phác đồ đơng lạnh

Hạ nhiệt
độ chậm

Thủy
tinh
hóa
Thời gian hoàn tất
khoảng
2 giờ
15-20
phút
Hệ thống hạ nhiệt độ bằng hơi nitơ lỏng cần
không
cần
Lượng nitơ lỏng sử dụng cho 1 lần thực hiện # 10 lít

# 0,5
lít
Moâi trường
Cần
nhiều
loại
moâi
trường
cho
caùc
giai
đoạn
phaùt
triển
khaùc
nhau
của
phoâi
Một
loại
moâi
trường
cho tất
cả
caùc
giai
đoạn
phaùt
triển
của

phoâi
Thời gian phoâi ở ngoaøi tủ cấy daøi ngắn
Tổn thương maøng trong suốt coù thể khoâng

Tỷ lệ phoâi sống sau raõ đoâng
# 70%-
80%
# 95-
100%
Chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectant)
Nhìn chung, các chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa
gần giống như trong kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây, nhưng nồng độ sử dụng
cao hơn. Trong một dung dịch dùng để thủy tinh hóa luôn bao gồm 1 hoặc 2 chất
bảo vệ đông lạnh có khả năng thấm qua màng tế bào (permeable cryoprotectant)
để khử nước bên trong tế bào và 1 chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm
qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) làm đối trọng, giúp quá trình khử
nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn.
- Chất bảo vệ đông lạnh có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào: ethylene glycol
(được sử dụng phổ biến nhất), propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose,
dimethylsulphoxide (DMSO) và 1,2-propanediol (PrOH).
- Chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua màng tế bào: sucrose,
trehalose, glucose và galactose.
Trong thành phần môi trường thủy tinh hóa hiện nay, người ta thường sử dụng
ethylene glycol và 1 chất bảo vệ đông lạnh khác cũng có khả năng thấm qua màng
tế bào (thường là DMSO hoặc PrOH) kết hợp với sucrose. Sự kết hợp này vừa bảo
đảm được khả năng thẩm thấu qua màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng
từng chất riêng lẻ, vừa giảm được độc tính của từng thành phần riêng lẻ tác động
lên tế bào khi sử dụng chúng ở nồng độ cao.
Dụng cụ

- OPS (open-pulled straw): đây là một loại straw có đường kính trong nhỏ hơn rất
nhiều so với đường kính nguyên thủy của các loại straw 0,25ml thường dùng trong
đông lạnh chậm. Người ta tạo ra OPS bằng cách làm nóng chảy straw 0,25ml và
kéo dãn bằng tay, sau đó cắt bằng 1 lưỡi dao rất mỏng, sao cho đường kính và bề
dày của thành straw bằng khoảng ½ so với ban đầu, bảo đảm lượng môi trường
có chứa trứng/phôi khi được hút vào trong OPS chỉ khoảng 1µl, đầu OPS chứa
môi trường và trứng/phôi được bảo vệ bằng 1 straw 0,5ml; đầu còn lại được gắn
một nút nhựa nhằm tránh trường hợp OPS bị nổi lên bề mặt khi thả vào nitơ lỏng.
OPS là loại dụng cụ được sử dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật đông lạnh cực
nhanh hiện nay.
- Cryoloop: dụng cụ này bao gồm một vòng tròn rỗng bằng nhựa mềm, gắn với
một cán nhựa hoặc kim loại. Dung dịch thủy tinh hóa tạo thành mộp lớp màng
mỏng trong phần rỗng của vòng tròn và phôi/trứng được đặt ngay trên lớp màng
mỏng này, sau đó toàn bộ dụng cụ có chứa trứng và phôi được làm lạnh trong hơi
nitơ lỏng.
- Nilon mesh: một dạng kết hợp giữa lưới đồng và cryoloop, được làm bằng nhựa
dẻo. Và chỉ được sử dụng chủ yếu trong đông lạnh trứng/phôi của động vật nuôi
bằng kỹ thuật thủy tinh hóa.
- Cryotop: đây là loại dụng cụ chỉ mới được phát minh trong một vài năm gần đây
(2000) nhưng được xem là dễ sử dụng và có hiệu quả sau rã đông cao nhất. Dụng
cụ bao gồm một bản phim trong mỏng được bảo vệ bởi một nắp nhựa, gắn với 1
cán cầm bằng nhựa. Trứng/phôi được đặt trên bề mặt bản phim với một lượng môi
trường rất nhỏ và toàn bộ mẫu được nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng. Ngoài ưu điểm
dễ thao tác, tốc độ làm lạnh và rã đông khi sử dụng cryotop nhanh hơn rất nhiều
so với OPS, điều này giúp tăng tỉ lệ sống của trứng/phôi sau khi rã đông. Một
dụng cụ khác có hình thức tương tự cũng được nhóm chuyên gia ở Trường Đại
học McGill Canada phát triển được gọi tên là Cryo Leaf.
Thao tác
Thao tác đơn gian nhất trong kỹ thuật thủy tinh hóa là đầu tiên mẫu trứng/phôi
được cân bằng với môi trường có chứa chất bảo vệ đông lạnh có nồng độ rất cao

(4 – 8M) để khử toàn bộ nước bên trong tế bào. Sau đó, trứng/phôi được cho vào
những dụng cụ chứa, toàn bộ mẫu được nhúng trực tiếp trong nitơ lỏng và chuyển
vào bình lưu trữ. Thời gian cho toàn bộ quy trình đông lạnh chỉ tốn 15 – 20 phút.
Hiện nay, ở một số trung tâm, người ta sử dụng nitơ ở dạng sệt (nitrogen slush)
thay thế cho nitơ lỏng trong kỹ thuật thủy tinh hóa. Ưu điểm của dạng nitơ này là
tránh sự bay hơi và thay đổi nhiệt độ ở vùng bề mặt khi nhúng trực tiếp dụng cụ
chứa mẫu vào trong nitơ lỏng.
Rủi ro thường gặp nhất trong kỹ thuật thủy tinh hóa
Trong kỹ thuật thủy tinh hóa, đòi hỏi người thực hiện phải thuần thục và chính xác
trong kỹ thuật cao. Sự thay đổi nhiệt độ do ngẫu nhiên hay “tai nạn” trong quá
trình lưu trữ và di chuyển mẫu đã đông lạnh là rủi ro thường gặp nhất. Do thể tích
môi trường xung quanh trứng/phôi rất nhỏ, chỉ một vài thay đổi nhiệt độ nhỏ cũng
làm ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng trứng/phôi sau rã đông.
Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng trong kỹ thuật thủy tinh hóa cao hơn rất
nhiều so với kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây. Điều này có thể gây ảnh hưởng
không nhỏ đến sức sống của trứng/phôi. Đặc biệt là ảnh hưởng lớn đến hệ thoi vô
sắc của trứng sau khi được rã đông. Nhiều ý kiến cho rằng, với nồng độ chất bảo
vệ đông lạnh cao, những tế bào nhạy cảm như trứng/phôi có thể bị tổn thương
chất liệu di truyền, nhưng cho đến nay, chưa có một bằng chứng nào cho thấy
những em bé được sinh ra từ kỹ thuật đông lạnh trứng/phôi bằng phương pháp
thủy tinh hóa có tỉ lệ dị tật bẩm sinh cao hơn phương pháp đông lạnh chậm trước
đây.
Trứng/phôi sau khi được cho vào những dụng cụ chứa, thường tiếp xúc trực tiếp
với nitơ lỏng mà không được bảo vệ. Do đó, dễ dẫn đến nguy cơ lây truyền các vi
sinh vật gây bệnh giữa các mẫu trứng / phôi với nhau qua trung gian nitơ lỏng.
Tuy nhiên, đây chỉ là một trong những nguy cơ có thể xảy ra đối với kỹ thuật này.
Cho đến thời điểm hiện tại, chưa có một báo cáo về trường hợp lây nhiễm liên
quan đến việc chuyển phôi trữ lạnh được công bố. Ngoài ra, phương pháp chứa
phôi trong cọng rạ (straw) cũng không loại trừ hoàn toàn việc tiếp xúc với nitơ
lỏng.

Hiện nay, kỹ thuật thủy tinh hóa đang phát triển nhanh chóng khắp nơi trên thế
giới và sẽ đóng vai trò quyết định tương lai của kỹ thuật đông lạnh nhờ tính đơn
giản, chi phí thấp và hiệu quả vượt trội. Ngày càng nhiều trung tâm sử dụng thủy
tinh hóa như một kỹ thuật đông lạnh thường quy cho phôi và trứng, thay thế hoàn
toàn phương pháp hạ nhiệt độ chậm. Ngoài ra, một số báo cáo đông lạnh tinh
trùng bằng kỹ thuật thủy tinh hóa thành công được công bố, mở ra một hướng
nghiên cứu mới trong lĩnh vực duy trì và bảo tồn khả năng sinh sản.
Tình hình ứng dụng kỹ thuật thủy tinh hóa tại Việt Nam

Hiện có 2 trung tâm IVF ở Việt Nam đã sử dụng thường quy kỹ thuật thủy tinh hóa
để thay thế kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây là bệnh viện Từ Dũ và bệnh viện
Phụ sản Quốc tế. Một số trung tâm khác cũng đang từng bước nghiên cứu triển
khai kỹ thuật này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đặng Quang Vinh, Vương Thị Ngọc Lan, Đỗ Quang Minh, Phùng Huy Tuân,
Hồ Mạnh Tường. Trường hợp thai lâm sàng đầu tiên từ phôi người đông lạnh. Vô
sinh các vấn đề mới. 137 – 142
2. Đỗ Quang Minh (2003). Nguyên tắc và kỹ thuật trong trữ lạnh phôi người. Vô
sinh các vấn đề mới.131 – 136
3. Bras G., Lens J. W., Piederiet M. H., Rijnders P. M., Verveld M., Zeilmaker G.
H. (1999). Cryopreservation embryo. IVF Laboratory aspects of invitro
fertilization, 13, 247 – 270
4. Dale B. and Elder K. (2000). Cryopreservation. In vitro fertilization. 132 - 149
5. J. Konc, Cseh S., Varga E., Kriston R., Kanyo K. (2005). Cryopreservation of
Oocytes and Embryos in Human Assisted Reproduction. J Reproduktionsmed
Endokrinol, vol. 2, no. 4, 251 - 258
6. J. Tan (2004). Vitrification of human oocytes and bovine oocytes and embryos.
Presented to the ISEF Judging Committee
7. Kasai M. (2004). Cryopreservation of animal and human embryos by
vitrification. Repro. BioMed. Online, vol. 9, no. 2, 164 - 170

8. K. Hiraoka, Hiraoka K., Kimutani M. va# Kimutani K. (2004). Case report:
successful pregnancy after vitrification of a human blastocyst that had completely
escaped from the zona pellucida on day 6. Hum. Repro. Vol. 19, no. 4, 998 – 990
9. Kuleshova L., Gianaroli L., Magli C., Ferraretti va# Trounson A. (1999). Birth
following vitrification of a small number of human oocytes. Hum. Repro., vol. 14,
no. 12, 3077 – 3079
10. Kuleshova L., Lopata A. (2002). Vitrifiaction can be more favorable than slow
cooling. Fertil. Steril., no. 44, 645 - 651
11. Mukaida T. and Kasai M. (2004). Vitrification of human embryos. Textbook of
Assisted Reproductive Technoiques. 281 – 289
12. Porcu R., Patrizia M. C., Fabbri R., Damiano G., Scarano A. and Venturoli S.
(2001). Technology for the cryopreservation of human embryos and gametes.
Biotechnology of human reproduction. 211 – 217
13. Shaw J., Oranratnachai A. and Trouson A. O. (1999). Cryopreservation of
oocytes and embryos. Handbook of in vitro fertilization. 373 – 412
14. Vajta G. (2006). Are programmable freezers still needed in the embryo
laboratory? Review on vitrification. Repro. Biomed. Online, vol. 12, no. 6, 779 -
796
15. Vajta G., Booth PJ., Holm P., Greve T., Callessen H. (1997). Successful
vitrification of early stage bovine in vitro produced embryos with the open pulled
straw (OPS) method. Cryo-Lett, no. 18, 191 – 195
16. S Al-Hasani . Vitrification – The slow revolution of a rapid freezing. Focus on
Reproduction. May 2007. 22-25
Tại Việt Nam: kỹ thuật thủy tinh hóa được ứng dụng thành công từ tháng 5/2006.
Trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm bệnh viện Từ Dũ là nơi ứng dụng thành công
đầu tiên kỹ thuật này. Trường hợp có thai lâm sàng đầu tiên từ phôi trữ lạnh bằng
kỹ thuật thủy tinh hóa được công bố vào tháng 6/2006 và đã cho ra đời em bé đầu
tiên vào đầu năm 2007. Đến nay, đã có hàng trăm trường hợp có thai và trên 20
em bé ra đời từ phôi đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa ở Việt Nam Lưới
đồng (copper grid): kỹ thuật thủy tinh hóa sử dụng lưới đồng trong đông lạnh phôi

được thực hiện đầu tiên. Kích thước giọt môi trường chứa phôi rất nhỏ và phần lớn
lượng môi trường này đều đi qua các lỗ nhỏ trên bề mặt lưới, chỉ còn tế bào trứng
hoặc phôi được giữ lại bên trên mặt lưới một cách an toàn. Các lưới đồng chứa
trứng/phôi được bảo quản trong những tube nhỏ chứa đầy nitrơ lỏng trước khi đưa
vào thùng lưu trữ.Lịch sử phát triểnTừ thành công đầu tiên trong đông lạnh và rã
đông phôi động vật có vú được báo cáo vào năm 1972 đến nay, công nghệ đông
lạnh đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong ngành chăn nuôi và y học sinh sản.
Trường hợp mang thai đầu tiên từ phôi trữ lạnh ở người được Trouson và Morh
báo cáo vào năm 1983. Đến nay, đông lạnh phôi đã trở thành một kỹ thuật không
thể thiếu trong công nghệ hỗ trợ sinh sản trên người và trên động vật nuôi.