Nghiên cứu nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ bệnh nhân azoospermia doc

Nghiên cứu ni cấy, biệt hóa tế bào gốc
sinh tinh từ bệnh nhân azoospermia

TĨM TẮT:
Các tế bào dịng tinh được phân lập bằng collagenase IV và được nuôi cấy trong
môi trường Gamete được bổ sung FSH với nồng độ 50 IU l -1 và testosterone với
nồng độ 1mmol l-1, ở nhiệt độ 320C, nồng độ CO2 5%, trong thời gian 24 giờ.
Kết quả nghiên cứu cho thấy:

-

Collagenase IV có tác dụng tốt đối với quá trình phân lập các tế bào dòng tinh.

-

Số lượng tinh tử đang kéo dài, tinh tử đã kéo dài và tinh trùng tăng, trong khi

đó số lượng tinh tử trịn giảm sau 24h ni cấy.

-

Tỷ lệ tinh trùng và tinh tử đã kéo dài di động tăng đáng kể sau ni cấy.

-

Có thể tạo được phôi với tinh trùng thu được sau nuôi cấy nhờ kỹ thuật vi tiêm.

SUMMARY:


STUDY ON IN-VITRO CULTURE OF SPERMATOGENIC CELLS WERE

ISOLATED BY COLLAGENASE IV FROM AZOOSPERMIC PATIENTS
Spermatogenic cells were isolated by collagenase IV and cultured in Gamete
medium supplemented with 50 IU l-1 of FSH plus 1mmol l-1. The medium were
maintained in the culture at 320C with 5% CO2 in air for 24 hours.
The results showed that: It is effective in the treatment of azoospermic men.

-

Collagenase IV is effective in the isolation of spermatogenic cells.

-

The number of elongating spermatids, elongated spermatids and spermatozoa

was increased. But the number of round spermatids reduced during the first day of
culture.

-

Significant improvement of the rate of motile spermatozoa and motile

elongated spermatids was observed after 24 hours.

-

An embryo was created after micromanipulation-assisted fertilization with in-

vitro-cultured testicular spermatozoa.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Azoospermia là tình trạng khơng có tinh trùng trong tinh dịch. Trong các bệnh
nhân azoospermia thì azoospermia không do tắc chiếm một tỷ lệ đáng kể, khoảng


50%. Các bệnh nhân này khơng thể có con của chính mình do khơng có tinh trùng,
tinh tử trưởng thành ở mào tinh hay ống sinh tinh.
Ngày nay, với sự tiến bộ của các lĩnh vực khoa học như nuôi cấy tế bào, các kỹ
thuật hỗ trợ sinh sản, thì việc nghiên cứu ni cấy các tế bào dịng tinh có ý nghĩa
vơ cùng quan trọng, mở ra hướng điều trị mới cho các bệnh nhân nhóm này.

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu:
1. Xây dựng được quy trình phân lập tế bào gốc sinh tinh từ mào tinh hoàn và
ống sinh tinh ở bệnh nhân nam giới vơ sinh do khơng có tinh trùng.

2. Xây dựng được quy trình ni cấy và biệt hoá tế bào gốc sinh tinh thành
tinh trùng.

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

* Phân lập các tế bào dòng tinh
- Các nghiên cứu phân lập các tế bào dòng tinh đã được nghiên cứu từ rất lâu. Các
nghiên cứu này được tiến hành ở trên cả người và trên động vật. Anna và cs, 1996
đã nghiên cứu và thành công quá trình phân lập các tế bào dịng tinh, đặc biệt là
tinh nguyên bào loại A. Quá trình được tiến hành như sau: Chuột Wistar 9 ngày
tuổi, trọng lượng cơ thể từ 18-20g được chọn để lấy tinh hoàn. Tinh hoàn được lấy
và đặt trong môi trường MEM (minimum essential medium), có bổ sung


glutamine (2nM), HEPES (15mM), một số amino acid, penicillin (100IU/ml),
streptomycin (100mg/ml), gentamycin (50mg/ml). Sau khi loại bỏ màng trắng của

tinh hồn, mơ tinh hồn được đưa vào dung dịch ni cấy có khoảng 0,05%
collagenase và dispase và 0,04mg/ml DNase, tồn bộ sản phẩm được đặt trong tủ
ấm, ở nhiệt độ 320C. Sau 10 phút các thành phần như mô liên kết được loại bỏ.
Sản phẩm lại tiếp tục được để trong tủ ấm trong 15 phút nhằm tách các tế bào khỏi
màng đáy. Sản phẩm lại tiếp tục cho vào mơi trường ni cấy trong 20 phút, có
0,5 U/ml heparinase III, 0,3 U/ml chondroitinase ABC, 0,5 mg/ml collagenase IV.
Sản phẩm thu được lại được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 70mm, sau đó là
50mm. Sau khi rửa 2 lần, ly tâm 800 vòng/phút trong 30 phút, sản phẩm thu được
là các tế bào dòng tinh. Tác giả đã nuôi cấy các tế bào ở 320C, nồng độ CO2 là 5%.
- Hamra và cs, 2008 tiến hành phân lập các tế bào dòng tinh dựa vào nguyên tắc:
các tế bào thân ở tinh hoàn sẽ gắn chặt với nền collagen trong mơi trường ni
cấy. Trong khi đó, các tế bào dịng tinh, trong mơi trường ni cấy lại khơng có
đặc tính đó.

* Ni cấy tế bào dịng tinh
- Các nghiên cứu ni cấy các tế bào dịng tinh đã có từ rất lâu, Steinberger,
1970; Matte, 1971; Ghatnekar, 1974; Curtis, 1981 là những tác giả đầu tiên tiến
hành nuôi cấy các tế bào dòng tinh.


- Tuy vậy, ni cấy các tế bào dịng tinh chỉ thực sự có ý nghĩa từ sau những năm
1990, khi kỹ thuật vi thao tác được áp dụng.
- Ngày nay ni cấy tế bào dịng tinh với 2 mục đích:



Biệt hóa các tế bào dịng tinh



Lựa chọn các tế bào khỏe mạnh

+ Đối với azoospermia không do tắc:
- Zhu, 1996; Liu, 1997; Balaban, 1999; Cremades, 1999 và Sousa, 2002, ni cấy
các tế bào dịng tinh thu được từ TESE và nhận thấy: sau 24h ni cấy trong mơi
trường có FSH thì tỷ lệ di động và khả năng thụ tinh của tinh trùng tăng lên.
- Aslam và Fishel, 1998; Tesarik, 1998; Cremades, 1999 đã nuôi cấy các tinh tử
của người có q trình sinh tinh bình thường. Kết quả các tinh tử phát triển nhanh
với các biểu hiện: nhân tụ đặc lại, đi hình thành và phát triển.

- Terarik, 1998 nhận thấy sự có mặt của FSH và testosterone trong môi trường
nuôi cấy sẽ làm tăng nhanh tốc độ biệt hóa.

- Các nghiên cứu của Tesarik vào năm 1999 và 2000 cũng thu được kết quả tương tự ở bệnh nhân azoospermia không do tắc.
- Năm 1999, đứa trẻ đầu tiên ra đời từ tinh tử nuôi cấy (Tesarik).


- Cho đến nay, có nhiều phương pháp ni cấy các tế bào dòng tinh khác nhau.
Tesarik, 2006 tiến hành ni cấy các tế bào dịng tinh cùng với các tế bào Sertoli,
trong điều kiện nhiệt độ từ 30-320C, cùng với các chất khác như FSH, LH. Sousa,
2006 tiến hành ni cấy các tế bào dịng tinh sau khi phân lập và chọn lựa dựa vào
kỹ thuật vi thao tác. Một số các tác giả khác nuôi cấy các tế bào dòng tinh cùng
với tế bào Vero.
- Huleihel và cs, 2007 đã tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào cùng với tế bào
Sertoli, dung dịch nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy ngồi các nội tiết tố cịn bổ sung
các chất như GDNF (glial cell line derived neurotrophic factor), SCF (stem cell
factor), LIF (leukemia inhibitory factor). Kết quả nghiên cứu cho thấy các tế bào
phân chia tốt.
- Perrard và cs, 2007 đã tiến tới ni cấy các tế bào dịng tinh. Kết quả nghiên
cứu cho thấy: betaNGF (beta nerve growth factor) có tác dụng trực tiếp đến lần

thứ 2 của phân bào giảm nhiễm để hình thành tinh tử trịn. Chính vì vậy các tác giả
nhận thấy số lượng tinh tử trịn tăng nhanh trong q trình ni cấy.

- Zhang, 2008 đã tiến hành nuôi cấy các tinh nguyên bào của chuột trên nền các
tế bào Sertoli. Sau 4 đến 5 ngày nuôi cấy, môi trường nuôi cấy được thay. Kết quả
thí nghiệm cho thấy, sau 24 giờ ni cấy đã phát hiện sự phân chia tế bào. Q
trình ni cấy được kéo dài trên 50 ngày.


- Mito Kanatsu và cs, 2008 đã tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào của chuột
Hamster trong thời gian kéo dài. Các tinh nguyên bào sau khi được phân lập và
ni cấy trong mơi trường có NGF, kết quả của nghiên cứu thu được tinh tử tròn.

- Gần đây một số tác giả đã tiến hành nghiên cứu biệt hoá các tế bào mầm gốc
phơi thành nỗn và tinh trùng như Lacham-Kaplan, 2008. Các tác giả này đã thu
được một số thành cơng, tuy nhiên vẫn cịn nhiều tồn tại cần nghiên cứu.

+ Đối với azoospermia do tắc:
- Các bệnh nhân nhóm này có q trình sinh tinh xảy ra bình thường. Thơng
thường, các bệnh nhân này có kích thước tinh hồn, nồng độ FSH, LH và
testosterone trong máu bình thường, mào tinh căng, xác định rõ. Đặc biệt, chúng ta
có thể thu được tinh trùng và tinh tử trưởng thành tại mào tinh qua các kỹ thuật
PESA, MESA (Silber, 1994).

- Tuy vậy, các tế bào dòng tinh thu được tại đây thường chưa trưởng thành hoàn
toàn, hơn nữa lại khó xác định được tế bào sống để lựa chọn. Một số tác giả đã
tiến hành nuôi cấy các tế bào này và đạt được kết quả tốt đẹp như: tế bào biệt hóa,
trưởng thành hơn, khả năng xác định tế bào sống cao và tỷ lệ thụ tinh sau ICSI
tăng đáng kể (Balaban, 1999).

* Đặc điểm của các tế bào thu từ tinh hoàn bệnh nhân azoospermia:


- Tinh trùng thường chưa biệt hóa hồn tồn và khơng di động nên rất khó xác
định tinh trùng sống trong việc chọn tinh trùng để làm ICSI.
- Theo Tesarik, 1998; Jurisicova, 1999; Gandini, 2000; Muratori, 2000, tỷ lệ đứt
gãy ADN trong các tinh tử thu từ tinh hoàn, đặc biệt là tinh tử tròn (round
spermatid) là rất cao, đây là nguyên nhân làm giảm tỷ lệ thành công.

- Nguyên nhân tỷ lệ thụ tinh của tinh tử rất thấp (Tesarik):



Sự chưa hoàn thiện của trung thể



Sự chuyển tiếp các protein nhân (từ histone thành protamine) chưa hoàn
toàn: thiếu hụt protamine sẽ cản trở sự hình thành các tiền nhân.



Sự thiếu hụt các chất kích hoạt nỗn.

Khơng có tinh trùng trong tinh dịch (azoospermia) chiếm một tỷ lệ đáng kể trong
các nguyên nhân vô sinh nam và đây là nguyên nhân đáng quan tâm nhất. Nhóm
azoospermia do tắc, các bệnh nhân này sẽ được điều trị bằng phương pháp PESAICSI hay MESA-ICSI. Nhóm thứ 2 là nhóm azoospermia khơng do tắc, các bệnh
nhân này cho đến nay khó có khả năng điều trị. TESE-ICSI hoặc xin tinh trùng là
hướng giải quyết cho các bệnh nhân nhóm này.
Đối với các bệnh nhân azoospermia không do tắc, hướng giải quyết hiện nay vẫn

là xin tinh trùng, đây vẫn là một giải pháp tình thế.


- Chính vì vậy ni cấy tinh trùng, tinh tử và các tế bào gốc sinh tinh có ý nghĩa
quan trọng trong việc nâng cao tỷ lệ thụ tinh và mang lại cơ hội làm cha cho
những bệnh nhân azoospermia.

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

3.1. Đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Cỡ mẫu: bao gồm 30 bệnh nhân được chẩn đốn azoospermia tại Trung tâm
Cơng nghệ phơi - Học viện Quân y

3.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân:

- Bệnh nhân có xét nghiệm nhiễm sắc thể bình thường
- Sau khi tiến hành phương pháp PESA hoặc MESA, các bệnh nhân được xác
định khơng có tinh trùng tại mào tinh.
- Khơng tiến hành ni cấy các trường hợp chỉ có tế bào Sertoli trong ống sinh
tinh (hội chứng chỉ có tế bào Sertoli).

3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu:

+

Kính hiển vi đảo ngược vi thao tác Olympus IX 70 có gắn kính Hoffman của

Nhật.

+

Tủ nuôi cấy CO2 Forma, Mỹ.

+

Giếng nuôi cấy Nunc, loại 4 giếng.

+

Các dụng cụ thuỷ tinh: bao gồm lam kính đồng hồ, lam kính thường, lamen.

+

Các hố chất: bao gồm dung dịch Gamete 100, Puregon, testosterone và

collagenase IV

3.2.2. Phương pháp nghiên cứu:
3.2.2.1. Phương pháp xét nghiệm tinh dịch đồ (theo WHO, 1999) [8].

3.2.2.2. Phương pháp sinh thiết tinh hoàn mở (theo Thomas Wheeler, 1995) [7].

3.2.2.3. Phương pháp TESE (Testicular Sperm Extraction) (theo Tesarik, 2001 có
cải tiến) [6]:

-

Mẫu tinh hồn được thu từ sinh thiết mở tinh hoàn và được nghiền bởi 2 lam

kính vơ trùng.

-

Sản phẩm thu được cho vào dung dịch collagenase IV (1000IU/ml) ở 370C,

trong 30 phút.

-

Cặn lắng thu được sau ly tâm được rửa và cho vào môi trường Gamete 100.

3.2.2.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào (theo Tesarik, 1998) [5]:


-

Ni cấy trong mơi trường Gamete, có bổ sung FSH (50IU/l), testosterone

(1mmol/l).

-

Q trình ni cấy được tiến hành trong bóng tối, ở nhiệt độ 320C, trong thời

gian là 24h.
3.2.2.5. Phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn – ICSI (theo Palermo,
1992) [3].
3.2.2.6. Đánh giá số lượng các tế bào dịng tinh trong điều kiện ni cấy:

-

Xác định các tế bào dòng tinh (theo Sousa, 2002) [4].

-

Xác định số lượng các loại tế bào: tại mỗi thời điểm nuôi cấy, mỗi giếng nuôi

cấy được đếm 20 vi trường, mỗi vi trường đếm từng loại tế bào, sau đó tính số
lượng trung bình từng loại tế bào.

4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4.1. Đặc điểm bệnh nhân:
Tuổi và thời gian vô sinh trung bình của các bệnh nhân nghiên cứu được thể hiện
ở bảng 4.1.

Bảng 4.1.


Tuổi

Thời gian vô sinh (năm)

X ± SD

X ± SD

34,30 ± 6,52

6,21 ± 3,54

4.2. Kích thước tinh hồn của bệnh nhân.
Bảng 3.2.

Nhóm

Bệnh nhân

Người bình thường

P

X ± SD

6,03 X k ± 0.05 12 X k

<0,001

(K là hệ số thể tích)
Qua bảng 4.2. chúng ta có thể thấy kích thước tinh hồn của bệnh nhân nhỏ hơn
kích thước tinh hồn của người bình thường.

4.3. Biến đổi số lượng các tế bào dòng tinh sau 24h nuôi cấy.
Bảng 4.3.


Thời gian

0h

24h

P

Số lượng tế bào Sertoli

13,83 ± 8,26

8,56 ± 6,74

<0.05

Số lượng tinh nguyên bào

6,04 ± 4,83

6,06 ± 2,31

>0.05

Số lượng tinh bào I

6,21 ± 2,69

6,13 ± 3,35

>0,05

Số lượng tinh bào II

9,05 ± 4,55

8,76 ± 5,21

>0,05

Số lượng tinh tử tròn

6,39 ± 5,68

3,28 ± 3,01

<0.05

Số lượng tinh tử đang kéo dài

6,90 ± 6,04

10,20 ± 7,30

<0.05

Số lượng tinh tử đã kéo dài

8,38 ± 6,72

12,35 ± 9,44

<0.05

Số lượng tinh trùng

7,41 ± 6,21

12,33 ± 10,21

<0.05

Qua bảng 4.3. chúng ta có thể nhận thấy: sau 24h ni cấy số lượng tế bào Sertoli,
tinh nguyên bào, tinh bào I, tinh bào II và tinh tử tròn giảm. Trong khi đó số lượng
các tinh tử đang kéo dài và tinh tử đã kéo dài và tinh trùng tăng. Kết quả này cũng


phù hợp với các tác giả khác như: Balaban và cs, (1999) (1); Movahedin và cs,
(2004) (2).

4.4. Sự biến đổi chất lượng của tinh trùng và tinh tử đã kéo dài thu được từ
TESE sau 24h nuôi cấy.
Bảng 4.4.

Tế bào

0h

Tỷ lệ tinh trùng và tinh tử đã 8,23 ± 6,12

24h

P

26,26 ± 9,67

<0,001

kéo dài di động

Qua bảng 4.4. chúng ta có thể nhận thấy tỷ lệ di động của tinh trùng, tinh tử đã kéo
dài tăng đáng kể sau 24h nuôi cấy.

4.5. Đánh giá khả năng thụ tinh của tinh trùng thu được sau nuôi cấy.
Chúng tôi đã tiến hành tiêm tinh trùng thu được sau 24h nuôi cấy vào bào tương
của noãn.
Bảng 4.5.


Số nỗn

Số phơi tạo thành

Tỷ lệ thụ tinh

87

58

66,67%

Từ kết quả trên chúng ta có thể nhận thấy: tinh trùng thu được sau 24h ni cấy có

khả năng thụ tinh và tạo thành phôi.
Ngày nay, các bệnh nhân azoospermia do tắc nghẽn, tinh trùng có thể được lấy từ
mào tinh để thực hiện IVF hoặc ICSI. Đối với các bệnh nhân azoospermia khơng
do tắc nghẽn, thì việc ni cấy các tế bào dịng tinh có ý nghĩa hết sức quan trọng,
mở ra cơ hội mới cho các bệnh nhân nhóm này. Tuy nhiên, cần phải tiếp tục
nghiên cứu với số lượng lớn hơn. Hiện nay, đã có một số tác giả đã thành công
trong việc tạo tinh trùng từ tế bào gốc phôi, tuy vậy, chất lượng tinh trùng và phôi
tạo được thường khơng bình thường.

5. KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu, bước đầu chúng tơi có thể kết luận như sau:

-

Collagenase IV có khả năng phân lập các tế bào dịng tinh hiệu quả

-

Tỷ lệ di động của tinh trùng và tinh tử đã kéo dài tăng cao ở thời điểm 24h sau

nuôi cấy.


-

Các tinh tử có khả năng biệt hố trong mơi trường Gamete, ở 320C, trong bóng

tối.

-

Tinh trùng thu được sau 24h ni cấy có khả năng thụ tinh để tạo thành phôi.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Balaban, B., Urman, B., Sertac, A. et al.

In-vitro culture of spermatozoa induces motility and increases implantation and
pregnancy rate after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm
injection, Human Reproduction, Vol 14, no 11, 1999, pp 2808-2811.

2. Movahedin, M., Ajeen, A., Ghorbanzadeh, N. et al.

In vitro maturation of fresh and frozen-thawed mouse round spermatids,
Andrologia, 36, 2004, pp 269-276.

3. Palermo, G., Joris, H., Devroey, P. et al.

Pregnancy after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into oocyte,
Lancet, 1992, pp17-18.

4. Sousa, M., Cremades, N., Silva, J., Oliveira, C. et al.


Predictive value of testicular histology in secretory azoospermic subgroups and
clinical outcome after microinjection of fresh and frozen-thawed sperm and
spermatids, Hu. Prod, Vol 17, no 7, 2002, pp 1800-1810.

5. Tesarik, J., Greco, E., Cohen-Bacrie, P., Mendoza, C.

Germ cell apoptosis in men with complete and incomplete spermatogenesis

failure. Mol Hum Reprod, 4, 1998, pp 757-762.

6. Tesarik, J., Greco, E., Memdoza, C.

Assisted reproduction with in-vitro-cultured testicular spermatozoa in case of
severe germ cell apoptosis: a pilot study, Human Reproduction, Vol 116, No 12,
2001, pp 2640-2645.

7. Thomas, M. Wheeler., Michael Coburn,

Testicular biopsy in male infertility evaluation. Infertility in the male, second
edition, Mosby year book, 1996; 223-253.

8. WHO.

Who laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical
mucus interaction, Fourth edition, United Kingdom, 1999.