Vai trò gây bệnh viêm màng não mủ cho trẻ dưới 5 tuổi của haemophilus influenzae typ b và các phương pháp chẩn đoán phòng xét nghiệm

ĐẶT VẤN ĐỀ
H. influenzae trước đây được gọi là trực khuẩn Pfeiffer hay trực khuẩn
cúm [8] và là thành viên của họ Pasteurellaceae. Tên của vi khuẩn này luôn
gắn liền với tính chất sinh học đặc trưng và yếu tố lịch sử nghiên cứu [35].
H. influenzae là loài vi khuẩn được nghiên cứu từ rất sớm và đánh giá
là nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ,
đặc biệt là viêm màng não. Trong đó, H. influenzae typ b (Hib) được biết
thường gây bệnh cho trẻ dưới 5 tuổi không được tiêm chủng vacxin. Bệnh do
Hib phần nhiều xảy ra ở trẻ từ 3 tháng đến 2 tuổi, còn với những trẻ lớn hơn
dường như ít xuất hiện và đặc biệt ít xảy ra với những đối tượng trên 5 tuổi
[19], [11], [16]. Theo một số nghiên cứu ở Mỹ và những nước phát triển, hơn
một nửa (>50%) số trường hợp mắc bệnh do Hib là viêm màng não (với triệu
chứng: sốt, đau đầu và cứng gáy). Phần còn lại xuất hiện với các bệnh khác
như: viờm mô tế bào, viêm khớp hoặc nhiễm khuẩn huyết… [24].
Tại Việt Nam theo Phan Lê Thanh Hương thì tỷ lệ gây ra các bệnh
nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ, đặc biệt là viêm màng nóo do Hib chiếm
50% trong tổng số nguyên nhân do vi khuẩn. Trong đó, lứa tuổi 6 tháng đầu
tiên chiếm tỷ lệ cao nhất là 43%; từ 7-12 tháng chiếm 30%; từ 13-18 tháng
chiếm 14%; từ 19-24 tháng tuổi chiếm tỷ lệ 7%; từ 25-30 tháng tuổi chiếm
3% và dưới 59 tháng tuổi chỉ chiếm 2% [1], [5], [7]. Ngoài ra, một nghiên
cứu tại Mỹ trước năm 1985 nhằm xác định tỷ lệ từng loại vi khuẩn thường
gây viêm màng não là: H. influenzae, N. meningitidis và S. pneumoniae theo
lứa tuổi đã cho thấy Hib vẫn là nguyên nhân hàng đầu ở trẻ em dưới 5 tuổi và
đặc biệt là ở trẻ dưới 2 tuổi [24].
Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi thực hiện chuyên đề: “Vai trò gây
bệnh viêm màng não mủ cho trẻ dưới 5 tuổi của Haemophilus influenzae
typ b và các phương pháp chẩn đoỏn phòng xét nghiệm” nhằm đưa ra
1
những thông tin cơ bản nhất về đặc điểm gây bệnh viêm màng não mủ của
Hib cho trẻ dưới 5 tuổi và các phương pháp phát hiện vi khuẩn này trong chẩn
đoán viêm màng não mủ tại phòng xét nghiệm được sử dụng hiện nay. Đõy là

những nội dung quan trọng góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán, điều trị
trên lâm sàng. Chuyên đề thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Tìm hiểu vai trò gây viêm màng não mủ cho trẻ dưới 5 tuổi của
Haemophilus influenzae typ b.
2. Tìm hiểu một số phương pháp phát hiện Haemophilus
influenzae typ b được sử dụng trong chẩn đoán viêm màng não
mủ tại phòng xét nghiệm hiện nay.
2
Chương I
VAI TRÒ GÂY VIÊM MÀNG NÃO MỦ
CHO TRẺ DƯỚI 5 TUỔI CỦA HAEMOPHILUS
INFLUENZAE TYP B
1.1. Đặc điểm sinh bệnh học của Hib trong bệnh viêm màng não mủ
H. influenzae typ b lây truyền qua tiếp xúc hoặc hít phải các chất bài
tiết bị nhiễm khuẩn của đường hô hấp. Sau khi định cư ở vùng mũi họng, vi
khuẩn có thể gõy nhiễm khuẩn đường hô hấp, lan ra tổ chức lân cận hoặc xâm
nhập vào dòng máu. Người ta cho rằng vi khuẩn từ mũi họng vào dòng máu
do kết quả của sự vận chuyển trong những thực bào từ niêm mạc vào các
mạch bạch huyết. Trong máu, những vi khuẩn H. influenzae typ b có vỏ PRP
kháng lại hiện tượng đại thực bào và hoạt tính bổ thể. Ở trạng thái nhiễm
khuẩn huyết, vi khuẩn có thể lan tràn và vượt qua hàng rào mỏu – não. Vị trí
mà vi khuẩn từ máu vào dịch não tủy là đám rối màng mạch, nơi có sự phân
bố mạch cao. Viờm màng não xảy ra thường có tương quan trực tiếp tới thời
gian và tính chất nghiêm trọng của nhiễm trùng huyết (> 10
3
đơn vị tạo khuẩn
lạc: CFU – Colony Formed Unit) [9].
1.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh viêm màng não mủ [9]
Trên lâm sàng, viờm màng não do H. influenzae typ b có thể tiến triển
âm ỉ trên vài ngày, thường phối hợp với nhiễm trùng đường hô hấp trên hoặc

đột ngột tiến triển trong vài giờ. Những dấu hiệu và triệu chứng của viêm
màng não do vi khuẩn này cũng giống hệt như triệu chứng và dấu hiệu gặp
trong viêm màng não mủ do các vi khuẩn gây bệnh khác.
Những dấu hiệu không đặc hiệu, bao gồm: sốt, ngủ gà, kích thích, chán
ăn, nôn, suy hô hấp và rối loạn tõm thần. Đối với trẻ lớn thường có nhức đầu,
cứng gáy, sợ ánh sáng. Các dấu hiệu Brudzinski, Kernig và cứng gáy đặc
3
trưng ít thấy ở trẻ dưới 15 tháng tuổi. Thêm vào đó, những dấu hiệu khu trú
có thể xuất hiện sớm, có đến 1/3 số bệnh nhõn bị co giật trước khi nhập viện.
Tỷ lệ tử vong bởi viêm màng não do H. influenzae typ b khoảng 5% và
tỷ lệ mắc bệnh kéo dài là 15 – 30%.
1.3. Tỷ lệ Hib gõy bệnh viêm màng não mủ ở trẻ dưới 5 tuổi từ các nghiên
cứu trong và ngoài nước
H. influenzae typ b được xác định là căn nguyên phổ biến nhất gây các
bệnh nhiễm khuẩn ở trẻ em. Viêm màng não chiếm hơn 50% các bệnh nhiễm
trùng xâm hại do H. influenzae typ b, tiếp theo là viêm phổi (12 – 17%), viờm
mụ tế bào (6 – 15%) và nhiễm trùng huyết riêng lẻ (2 – 11%). Viêm xương
tủy, viêm khớp, viêm màng ngoài tim xảy ra ít phổ biến. Người lớn khỏe
mạnh ít mắc bệnh xâm hại do Hib [9].
Hầu hết tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao do H. influenzae typ b trên
toàn thế giới xảy ra ở trẻ dưới 5 tuổi. Vai trò của Hib trong gây viêm màng
4
Hình 1.1: Phân bố các vị trí nhiễm trùng bởi Hib và Hi không có vỏ ở
một số cơ quan [35].

Viêm màng não (Hib)
Viêm tai giữa (Hi không có vỏ)
Viêm xoang (Hi không có vỏ)
Viêm nắp thanh quản (Hib)
Viêm khí quản (Hi không có vỏ)

Nhiễm trùng huyết (Hib)
Viêm phổi (Hib và Hi
không có vỏ)
H. influenzae
não cần được chứng minh có tầm quan trọng hơn so với những nhiễm trùng ở
cơ quan khác trên cơ thể. Vì vậy, tỷ lệ Hib gây viêm màng não cho trẻ dưới 5
tuổi được dùng như một tiêu chuẩn đánh giá so sánh gánh nặng bệnh tật do
Hib giữa các nước [56]. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), sau khi phân tích
kết quả của 229 nghiên cứu điều tra các thông tin về viêm màng não do Hib ở
trẻ dưới 5 tuổi tại nhiều nước trên thế giới với 30.000 trẻ mắc viêm màng não
và hơn 2.100 trường hợp tử vong. Kết quả nghiên cứu được xác định từ
những địa điểm Tổ chức y tế thế giới quan tâm (WHO regions), cụ thể là 43
(19%) từ châu Phi, 44 (19%) từ châu Mỹ, 23 (10%) từ phía Đông Địa Trung
Hải, 72 (31%) từ châu Âu, 12 (15%) từ Đông Nam châu Á và 35 (15%) từ
Đông Thái Bình Dương. Trong đó, 62% trong 229 nghiên cứu được thực hiện
ở các nước phát triển. [56]
1.3.1. Hib là căn nguyên hàng đầu gây viêm màng não cho trẻ dưới 5 tuổi
- Những nghiên cứu ở trong nước:
Viêm màng não mủ là một trong những bệnh nhiễm trùng hệ thần kinh
trung ương hay gặp ở trẻ em tại Việt Nam. Theo thống kê tại Viện Nhi Trung
Ương trong 10 năm (1983-1992) có 1.958 bệnh nhân viờm màng não mủ vào
viện, đứng hàng thứ sáu trong các bệnh nhiễm trùng phải nhập viện. Trên thế
giới, bệnh đang có xu hướng giảm dần ở các nước phát triển song hầu như
không thay đổi ở các nước đang phát triển, đặc biệt là các nước Châu Phi [1],
[2], [5].
Tại Việt Nam, viêm màng não do căn nguyên vi khuẩn Hib ít được
quan tâm vào những năm trước 2000. Vì vậy, những nghiên cứu về viêm
màng não do Hib tại Việt Nam cho đến nay vẫn chưa nhiều. Tuy nhiên,
nghiên cứu của Phạm Nhật An và cộng sự năm 2001 [2] với tất cả những
bệnh nhân từ 0 đến 15 tuổi được chẩn đoán là viờm màng não mủ vào điều trị

tại Viện Nhi Trung Ương từ tháng 12 năm 1998 đến tháng 12 năm 1999, cho
5
thấy kết quả về căn nguyên gây viêm màng não được xác định ở trẻ em nói
chung theo thứ tự hay gặp là: H. influenzae (50%), S. pneumoniae (22,06%),
N. meningitidis (11,76%), Streptococcus (5,88%), Klebsiella (4,22%), E.
coli, Staphylococcus, P. aeruginosa và Serratia spp (47%) cho dù chưa có
điều kiện xác định chi tiết về typ huyết thanh của mỗi loại vi khuẩn.
Như vậy, H. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis là căn nguyên
gây viờm màng não mủ hay gặp nhất ở trẻ em (83,82%). Trong đó, hàng đầu
là H. influenzae (50%).
Gần đõy, một số nghiên cứu khác của Phan Lê Thanh Hương, Đặng
Đức Anh cùng cộng sự về vai trò gây viêm màng não mủ của Hib ở trẻ dưới 5
tuổi tại Hà Nội và một số tỉnh phía Bắc từ 2000 - 2002 cũng đã cho thấy Hib
vẫn đứng đầu trong những căn nguyờn gõy viêm màng não mủ cho trẻ dưới 5
tuổi do vi khuẩn, chiếm 48,8%[1], [5].
- Những nghiên cứu ở nước ngoài:
Tại các nước châu Á, theo nghiên cứu ở nhiều nước của Peltola H năm
1999 cũng cho thấy được Hib là căn nguyên hàng đầu gây ra viờm màng não,
cụ thể, Hib chiếm 34%, S. pneumoniae chiếm 23%, N. meningitidis chiếm
14%, Salmonella chiếm 4% và 25% do các loại vi khuẩn khác. Ngoài ra,
nghiờn cứu của Yang Y tại Hefei - Trung Quốc cũng cho thấy được viờm
màng não do Hib chiếm 51,7%; N. meningitidis (Nm) là 38,3%, và S.
pneumoniae (Sp) là 8,3% [41], [57]; tại Đài Loan Hib cũng chiếm 42% tỷ lệ
căn nguyên gây viờm màng não [33], [37].
Những nước khỏc trên thế giới, hầu hếu các nghiên cứu đều cho thấy
Hib là căn nguyên chủ yếu gây viờm màng não. Điển hình như nghiên cứu ở
Mỹ năm 1990 cho thấy 3 vi khuẩn hàng đầu gây viêm màng não mủ cho trẻ
dưới 5 tuổi là: Hib, S. pneumoniae, N. meningitidis lần lượt chiếm tỷ lệ là
45%, 18% và 14% [39]; tại Oman năm 2008 vi khuẩn Hib, S. pneumoniae, N.
6

meningitidis gây viờm màng não lần lượt chiếm tỷ lệ là 22%, 15% và 11%
[36]. Tuy nhiên, hiện nay tại những nước đã đưa vacxin phòng Hib vào
chương trình tiêm chủng quốc gia thì tỷ lệ viờm màng não do Hib ở trẻ dưới 5
tuổi giảm xuống rất thấp, có thể xuống tới gần 0% [21].
1.3.2. Tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi:
- Những nghiên cứu ở trong nước:
Theo một nghiên cứu dịch tễ học viêm màng não do vi khuẩn dựa trên
cộng đồng tại Hà Nội (Phan Lê Thanh Hương, Đặng Đức Anh), cho thấy
viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi là 10/100.000, trong đó lứa tuổi 1-23
tháng chiếm tỷ lệ 26/100.000 [1], [2], [7], [42].
- Những nghiên cứu ở nước ngoài:
Qua phân tích số liệu từ 229 nghiên cứu trên toàn thế giới về viêm
màng não do Hib, kết quả tỷ lệ viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi trung
bình là 22,8/ 100.000 (với trung vị là 18 và dao động trong khoảng 0,9 – 94,6)
[55]. Trong đó, tại một số nước phát triển trên thế giới ở thời kỳ trước khi sử
dụng vacxin, tỷ lệ mắc viêm màng não do Hib đã báo cáo chiếm khoảng 11 –
50/100.000 ở lứa tuổi 0 – 4 tuổi [33], [56].
Ở các nước châu Á, theo nghiên cứu tại nhiều nước của Peltola H năm
1999 cho thấy tỷ lệ mắc viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi vào khoảng
25/100.000. Cụ thể, các nước châu Á như Trung Quốc, Thái Lan cũng đã có
nhiều nghiên cứu cho kết quả tương tự lần lượt là: 19,2/100.000 (năm 1996)
[57], 26,6/100.000 (2004) [43]. Tuy nhiên, nghiên cứu năm 2000 tại Philippin
và Ấn Độ cho thấy tỷ lệ này khá cao, lần lượt là 95/100.000 (1994 - 1996)
[28], 86/100.000 (2008) [33].
Tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não do Hib hiện nay đã giảm một cách đáng
kể ở những nước đã đưa vacxin phòng Hib vào chương trình tiêm chủng quốc
gia. Minh chứng cho vấn đề này, một số nghiên cứu tại Isarel, Đài Loan cho
7
thấy tỷ lệ mắc VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi giảm xuống còn khoảng
5/100.000 sau khi sử dụng vacxin phòng Hib tại các nước này [37].

Biểu đồ 1.1: Tỷ lệ viêm màng não theo từng lứa tuổi do nguyên nhân
H. influenzae, N. meningitidis và S. pneumoniae trước năm 1985 tại Mỹ [35].
1.3.3. Phân bố tỷ lệ viêm màng não do Hib theo các nhóm tuổi:
- Những nghiên cứu ở trong nước:
Theo Phan Lê Thanh Hương, tất cả các trường hợp viêm màng não mủ
do Hib tập trung ở lứa tuổi từ 1 – 23 tháng (88%) [5], [7], [42].
- Những nghiên cứu ở nước ngoài:
Qua nghiên cứu tổng thể về tỷ lệ viêm màng não do Hib tại nhiều nước
trên thế giới, nhỡn chung viêm màng não do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi có sự phân
bố khác nhau trong từng nhóm tuổi, như sau: 1-5 tháng chiếm 22,6%; 6-11
tháng chiếm 35,6%; 12-23 tháng chiếm 23,8%. Tuy nhiên, qua thống kê từ
các nghiên cứu đều cho thấy ở lứa tuổi từ 0-11 tháng là có tỷ lệ viêm màng
não do Hib cao nhất [56]. Cụ thể, một điều tra tiến cứu được thực hiện từ năm
1997-1999 tại Ấn Độ để đánh giá tỷ lệ mắc viêm màng não do Hib, cho thấy:
ở lứa tuổi từ 0 – 4 là 15,9/100.000 (trong đó, ở lứa tuổi từ 24 – 59 tháng là
8
Tuổi (Tháng)
Số bệnh nhân trên 100.000 dân
7,1/100.000; ở lứa tuổi từ 0 – 11 tháng là 32/100.000 và ở lứa tuổi từ 12 – 23
tháng là 19/100.000) [34].
1.3.4. Tỷ lệ tử vong do viêm màng não bởi căn nguyên Hib ở trẻ dưới 5 tuổi:
Tại Việt Nam, tác giả Phan Lê Thanh Hương cho thấy tỷ lệ tử vong của
viêm màng não do Hib là 3% và các di chứng nặng do Hib (như: điếc-nghễnh
ngóng, mự-giảm thị lực, chậm phát triển tâm thần, động kinh, não úng thủy và
trạng thái thực vật) chiếm 13% [5]. Điều này cho thấy gánh nặng bệnh tật do
Hib gây ra rất lớn không những cho gia đình bệnh nhân mà còn cho toàn xã
hội.
Trên thế giới, một điều tra phân tích kết quả của 229 nghiên cứu về
VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi, cho thấy tỷ lệ tử vong trung bình là 13,8%
(với trung vị 10% và dao động trong khoảng 0,0 – 65%). Trong đó, tỷ lệ chết

trung bình là 17,3% ở các nước đang phát triển, so sánh với 3,2% ở các nước
công nghiệp. Ngoài ra, tỷ lệ chết thấp ở châu Âu là 4,1% và cao ở châu Phi là
27,6% [56].
1.4. Vai trò của yếu tố miễn dịch ảnh hưởng đến tỷ lệ viêm màng não mủ
do Hib ở các lứa tuổi dưới 5
1.4.1. Yếu tố miễn dịch: [10]
Sự cảm thụ với những nhiễm khuẩn do Hib gia tăng ở trẻ sơ sinh và trẻ
nhỏ, nguyên nhân trực tiếp bởi cơ thể không có đầy đủ kháng thể kháng PRP.
Nồng độ kháng thể kháng PRP trong huyết thanh liên quan đến lứa tuổi, do đó
mức độ cảm thụ đối với Hib cũng tương quan trực tiếp với lứa tuổi. Trẻ sơ
sinh có kháng thể thu được tạm thời IgG kháng PRP do mẹ truyền qua rau
thai, rồi giảm dần sau tháng thứ nhất. Miễn dịch tự nhiên thu được thường
không xảy ra trước lứa tuổi từ 2 đến 4 tuổi. Vì vậy, trẻ em ở lứa tuổi giữa 2
tháng đến 2 tuổi có nguy cơ cao nhất dễ mắc bệnh xâm nhập do Hib. Cho nên,
9
trên thực tế, tỷ lệ viêm màng não do Hib không đồng đều ở các nhóm tuổi mà
gặp nhiều nhất ở lứa tuổi dưới 23 tháng [5], [7], [38].
Kháng thể kháng PRP thu được không phải là kết quả duy nhất do sự
định cư của Hib trên bề mặt niêm mạc. Nhiều trẻ em phát triển tự nhiên kháng
thể kháng PRP mặc dù không nhiễm các chủng typ b. Điều này có thể do kết
quả định cư của những vi khuẩn cú cỏc kháng nguyên vỏ gây phản ứng chéo,
như nhiễm vi khuẩn đường ruột Escherichia coli K100. Trẻ em dưới 2 tuổi có
nồng độ kháng thể kháng PRP thấp hoặc không phát hiện thấy đáp ứng với
nhiễm khuẩn do Hib hoặc vacxin vỏ PRP. Những kháng thể kháng lại kháng
nguyên thân (antisomatic) hay loại kháng nguyên protein được đáp ứng do lây
nhiễm các chủng Hi không có vỏ cũng có thể bị phản ứng chéo được với các
chủng Hi có vỏ. Miễn dịch thụ động do kháng thể có tác dụng lên trên phần
oligosaccharide của Haemophilus có tác dụng bảo vệ trong gây bệnh thực
nghiệm, nhưng sự hiện diện của chúng trong huyết thanh ở giai đoạn cấp của
một số trẻ sơ sinh bị nhiễm khuẩn do H. influenzae typ b cũng khêu gợi rằng

chúng không có tác dụng bảo vệ trong bệnh cảnh lâm sàng [10].
1.4.2. Vai trò của vacxin phòng Hib trong phòng bệnh viêm màng não mủ
cho trẻ dưới 5 tuổi do Hib
Vacxin phòng Hib được triển khai lần đầu tiên vào cuối năm 1985
nhằm để giải quyết 3 mối quan tâm chính, đó là: tỷ lệ tử vong cao bởi các
bệnh nhiễm trùng do Hib gây ra, di chứng nặng nề ở những trẻ viêm màng
não mủ do Hib xảy ra với tỷ lệ cao và sự gia tăng đề kháng của vi khuẩn này
với các kháng sinh thông dụng. Kháng thể kháng PRP trong huyết thanh được
biết là yếu tố căn bản để bảo vệ cơ thể trước nguy cơ tấn công của Hib. Vì
vậy, các nỗ lực đã được thực hiện để tăng nồng độ kháng thể trong máu bằng
cách sử dụng vacxin sản xuất từ vỏ polysaccharide tinh chế. Trong khi vacxin
PRP có hiệu quả trong bảo vệ trẻ từ 18 tháng tuổi trở lên chống lại các bệnh
10
nhiễm trùng xâm hại do Hib (hiệu quả ước tính đạt 90%), nhưng không có tác
dụng bảo vệ với lứa tuổi bé hơn, đõy là lứa tuổi có tỷ lệ mắc bệnh do Hib cao
nhất [38].
Biểu đồ 1.2: Tỷ lệ viêm màng não (VMN) giảm dần tại một số nước
Chõu Âu, sau khi sử dụng vacxin phòng Hib (theo: European Union-IBIS)
Chú thích: - Phần Lan (Finland)
- Hà Lan (Netherlands)
- Anh (UK)
- Ai Len (Ireland)
- It – xa - en (Israel)
Hiện tượng vacxin PRP không có khả năng bảo vệ cho trẻ ở lứa tuổi
nhỏ hơn đối với Hib được giải thích do cấu trúc hóa học vỏ polysaccharide
của Hib. PRP, một dạng trùng hợp của các đường pentose, không kích thích
11
Mức độ giảm tỷ lệ VMN do Hib
Giai
đoạn

chưa có
vacxin
Năm
đã có
vacxin
Những năm sau khi tiêm chủng vacxin
được đáp ứng miễn dịch độc lập của tế bào lympho T và không phải là một
kháng nguyên mạnh, đặc biệt là ở trẻ nhỏ. Ngoài ra, kháng nguyên
carbohydrate, chẳng hạn như kháng nguyên polysaccharide của vỏ tế bào một
số vi khuẩn được mô tả là kháng nguyên typ 2 không phụ thuộc lympho T
(TI-2 antigen: T cell independent type 2 antigen). Tuy nhiên, đối với nhiều
kháng nguyên được xếp vào loại phụ thuộc hay không phụ thuộc lympho T
dựa nhiều vào kiểu đáp ứng miễn dịch hơn là sự liên quan của lympho T trong
kích thích đáp ứng miễn dịch đó. Ở trẻ nhỏ, kháng thể đáp ứng với kháng
nguyên không phụ thuộc lympho T thấp, chủ yếu đáp ứng với tỷ lệ cao kháng
thể loại IgM và không có hỗ trợ đáp ứng miễn dịch khi lặp lại các liều kháng
nguyên [10], [46].
Biến đổi kháng nguyên polysaccharide thành kháng nguyên phụ thuộc
lympho T để trẻ nhỏ có thể đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ hơn, đòi hỏi kháng
nguyên này phải được liên kết đồng hóa trị với một số phân tử protein, do đó
vacxin cộng hợp (conjugated vaccine) ra đời. Hầu hết những kết quả nghiên
cứu về sự khác biệt của vacxin cộng hợp, cho thấy kháng nguyên khi được
liên kết với phân tử protein sẽ có khả năng kích thích được đáp ứng miễn dịch
phụ thuộc lympho T. Cho dù kháng nguyên polysaccharide được gắn với một
phân tử protein, cấu trúc bị thay đổi nhưng kháng nguyên này vẫn mang tính
đặc hiệu cao và có khả năng kích thích miễn dịch mạnh hơn so với kháng
nguyên tinh chất ban đầu. Vacxin cộng hợp có khả năng đem đến miễn dịch
chống lại Hib cho trẻ dưới 6 tháng [12]. Cụ thể, tại một số nước Châu Âu, qua
nghiên cứu cho thấy tỷ lệ viêm màng nóo giảm đi đáng kể từ khi vacxin được
bắt đầu đưa vào sử dụng và đặc biệt giảm sau khi tại những nước này đã tiến

hành tiêm chủng mở rộng vacxin phòng Hib (biểu đồ 1.2).
Có 4 loại vacxin phòng Hib đã trải qua đỏnh giỏ trờn lâm sàng: PRP-D
(Connaught Laboratories), PRP-T (Pasteur – Meriéux), PRP-OMPC (Merck
12
Sharp and Dohme) và HbOC (Praxis Biologicals). Mỗi loại vacxin này có sự
khác nhau về một hay vài đặc điểm như: loại phân tử protein cộng hợp với
kháng nguyên polysaccharide, kích thước của bán kháng nguyên
polysaccharide, loại liên kết giữa kháng nguyên với protein cộng hợp và tỷ lệ
của polysaccharide với protein. Những khác biệt về hóa lý như vậy đều có
ảnh hưởng đến khả năng kích thích miễn dịch của từng loại vacxin. Thêm vào
đó, sự khác nhau về liều vacxin và khoảng cách giữa các liều cũng ảnh hưởng
đến đáp ứng miễn dịch hay khả năng bảo vệ của cơ thể.
Nồng độ kháng thể trong huyết thanh được sinh ra do vacxin cần thiết
để chống lại Hib chưa được biết chính xác. Đõy là vấn đề đưa ra rất phức tạp
khi với một nồng độ kháng thể tương đương vẫn có thể có hoạt động chức
năng khác nhau [20]. Sự duy trì nồng độ ngưỡng của kháng thể kháng PRP
trong huyết thanh có thể không cần thiết nếu những đứa trẻ được gây miễn
dịch đáp ứng có hiệu quả khi phơi nhiễm với Hib.
Những nghiên cứu về hiệu lực của vacxin cho thấy PRP-D, PRP-T,
PRP-OMPC và HbOC có thể ngăn chặn được hơn 90% các bệnh nhiễm trùng
do Hib [12], [13], [48]. Tuy nhiên, PRP-D được chứng minh là không có hiệu
quả trong thử nghiệm về hiệu lực ở trẻ em vùng Alaska [52]. Vì vậy, sự lựa
chọn giữa vacxin không phù hợp có thể bị chỉ trích ở những vựng dõn cư, ở
đú có áp lực về bệnh nhiễm trùng rất cao và tỷ lệ mắc bệnh nhiều nhất gặp ở
lứa tuổi thấp. Tại những quần thể này, vacxin cộng hợp có khả năng kích
thích miễn dịch mạnh ngay liều đầu tiên là lựa chọn tốt nhất [10]. Cho nên,
những đứa trẻ nhỏ nhất với nguy cơ mắc Hib cao nhất sẽ có cơ hội sớm nhất
đạt được miễn dịch đủ khả năng bảo vệ cơ thể. Ngoài ra, trong hầu hết các
quần thể dân cư, sự lựa chọn vacxin còn phải dựa trên các yếu tố khác, đặc
biệt quan trọng nhất là giá cả.

13
1.5. Mức độ nhạy cảm và khả năng đề kháng với một số kháng sinh thông
dụng của Haemophilus influenzae typ b
Những kháng sinh thường được dùng trong điều trị Hib trên lâm sàng
đó là: nhóm β – lactam (ampicilin, sulbactam/ampicilin, ceftriaxon, cefaclor,
cefotaxim, cefpodoxim), nhóm macrolide (azithromycin, clarithromycin) và
cỏc nhúm khỏc (chloramphenicol, levofloxacin, rifampicin…). Từ những năm
1970, tỷ lệ kháng ampicillin do sản xuất enzym β-lactamase của Hi đã tăng
lên trên toàn thế giới, lên tới 20 – 30% đã được một số nghiên cứu báo cáo
[17], [23]. Ngoài ra, sự đề kháng với các kháng sinh khác như co-trimoxazole,
tetracycline và chloramphenicol cũng đã được đưa ra. Tỷ lệ lớn nhất của các
chủng Hib đa kháng đã được mô tả ở Tây Ban Nha và Bỉ [48]. Hiện nay, tỡnh
hình đề kháng của Hib đối với kháng sinh ngày càng ra tăng mạnh mẽ, phức
tạp và có sự khác nhau ở từng nước riêng biệt thể hiện qua một số nghiên cứu.
Đặc điểm về khả năng đề kháng đa dạng của Hib phụ thuộc vào nhiều yếu tố,
trong đó phải kể đến thói quen và sự lạm dụng thuốc trong điều trị [22]. Tuy
nhiên, những loại kháng sinh như: ceftriaxon, cefaclor, cefotaxim,
cefpodoxim, meropenem, levofloxacin, rifampicin dùng trong điều trị vẫn có
hiệu quả với mức độ nhạy cảm khá cao.
1.5.1. Mức độ nhạy cảm và khả năng đề kháng với một số kháng sinh
thông dụng của Haemophilus influenzae typ b tại Việt Nam
Hib đề kháng chủ yếu với các kháng sinh ampicillin (khoảng trên
40%), chloramphenicol (khoảng trên 8 - 40%) và co-trimoxazole (khoảng trên
54%). Đối với những kháng sinh ceftriaxon, cefaclor, cefotaxim, cefpodoxim,
meropenem, levofloxacin, rifampicin điều trị vẫn có hiệu quả với mức độ
nhạy cảm gần 100% [3], [4], [7], [43]. Kết quả này được chứng minh từ các
nghiên cứu được thực hiện trong những năm gầy đây, thể hiện qua nghiờn
cứu và đánh giá diễn biến tình hình kháng thuốc của Haemophilus influenzae
14
gây bệnh trong 10 năm (1991-2000) tại Việt Nam, tác giả Phạm Văn Ca và

Cao Văn Viên [3] với 1.134 chủng Hi phân lập được cho thấy vi khuẩn này đề
kháng cao nhất với co-trimoxazole (54,2%), tiếp đó với ampicillin (44,9%),
gentamicin (11,6%) và chloramphenicol (8,1%), trong đó ceftriaxone bị đề
kháng thấp nhất (1,4%). Tỷ lệ các chủng Hi có khả năng sản xuất enzym
Chloramphenicol-Acetyl-Transferase tăng lên theo thời gian, đây là khuynh
hướng có liên quan đến khả năng đề kháng kháng sinh chloramphenicol
(p<0,01) [3]. Một nghiên cứu khác của Lê Huy Chính, Nguyễn Văn Trọng và
cộng sự năm 2007 [4] về tỷ lệ mang Haemophilus influenzae, Streptococcus
pneumoniae ở trẻ em dưới 60 tháng tuổi trong cộng đồng một số tỉnh Miền
Bắc Việt Nam và mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập
được, cũng cho thấy vi khuẩn này đề kháng cao nhất với co-trimoxazole
(69,6%), tiếp đó với chloramphenicol (16,4%), amoxillin (5,6%); những
kháng sinh còn nhạy cảm cao (trên 98,5%) là ceftriaxone/ co-amoxiclav/
levofloxacin bị đề kháng thấp nhất (khoảng 1,0%). Ngoài ra, có 13,3% các
chủng đa kháng với co-trimoxazole và chloramphenicol; 1% các chủng đa
kháng với co-trimoxazole, chloramphenicol và amoxillin. Tuy nhiên, những
nghiên cứu trước đây đều chỉ thực hiện với các chủng Hi. Vì vậy, một nghiên
cứu về đặc điểm kiểu gen, kiểu hình của các chủng Hib phân lập từ trẻ viêm
màng não mủ và các thành viên trong gia đình năm 2006 của Phan Lê Thanh
Hương và cộng sự [7][43], đã cho thấy những kháng sinh ceftriaxon, cefaclor,
cefotaxim, cefpodoxim, meropenem, levofloxacin, rifampicin vẫn có hiệu quả
trong điều trị Hib với mức độ nhạy cảm gần 100%; thêm vào đó những chủng
Hib phân lập được cũng đề kháng với nhiều loại kháng sinh, cụ thể: tỷ lệ Hib
có khả năng sản xuất enzym β-lactamase chiếm 59,7%; khả năng đề kháng
với ampicillin (40,3%); với chloramphenicol 46,5%; ngoài ra, nghiên cứu này
cũng cho thấy khả năng đề kháng với kháng sinh ampicillin, chloramphenicol
15
và sulbactam/ampicillin của Hib có liên quan đến khả năng sinh enzym β-
lactamase. Vì vậy, gen đề kháng kháng sinh chloramphenicol có thể nằm trên
cùng một đoạn gen có chứa gen quy định tổng hợp enzym β-lactamase [7].

1.5.2. Mức độ nhạy cảm và khả năng đề kháng với một số kháng sinh
thông dụng của Haemophilus influenzae typ b trên thế giới
Hầu hết các nghiên cứu cho thấy Hi nói chung và Hib nói riêng đề
kháng chủ yếu với các loại kháng sinh như co-trimoxazole, ampicillin,
chloramphenicol [45], [49], [50]. Tương tự như các nghiên cứu ở Hàn Quốc,
Đài Loan, Trung Quốc, nghiờn cứu của Haghiashteiani MT và cộng sự tại
Iran năm 2008 về khả năng đề kháng kháng sinh của các chủng Hib gây viêm
màng não ở trẻ dưới 5 tuổi cũng cho thấy vi khuẩn này đề kháng 42,1% đối
với ampicillin; 36,8% đối với chloramphenicol; 52,6% đối với co-
trimoxazole. [22], [27], [44]. Tại Banglades châu Á, Samir K. Saha và cộng
sự nghiên cứu sự gia tăng kháng thuốc của các chủng Hib gây bệnh xâm hại
(viêm màng não và viêm phổi), cho thấy: tỷ lệ Hib đề kháng kháng sinh
ampicillin, chloramphenicol và cotrimoxazole lần lượt là 32,5%, 21,5%, và
49,2%. Nghiên cứu của Tarmago và cộng sự năm 2003 về khả năng đề kháng
kháng sinh của 938 chủng Hib gây viêm màng não ở trẻ dưới 5 tuổi tại Cu Ba
cũng cho thấy vi khuẩn này đề kháng với ampicillin, co-trimoxazole,
tetracycline và chloramphenicol lần lượt là: 46,3% (tất cả các chủng đều có
khả năng sinh enzym β-lactamase); 51,3%; 33,2% và 44,0% [49]. Trên thực
tế, nhiều nghiên cứu đều cho thấy Hib ngày càng gia tăng đề kháng đối với 3
loại kháng sinh này [45], theo kết quả giám sát từ năm 1990 – 2000 tại Cu Ba,
sự gia tăng mức độ đề kháng tương ứng 40,7% - 54,8% đối với ampicillin;
40,1% - 51,6% đối với chloramphenicol; 45,4% - 58,1% đối với co-
trimoxazole. Tại các nước phát triển như Mỹ, Canada hay các nước châu Âu
những kết quả nghiên cứu đều cho thấy kháng sinh ampicillin, co-trimoxazole
16
và chloramphenicol là loại kháng sinh bị Hib đề kháng nhiều nhất. Tuy nhiên,
mức độ đề kháng của Hib đối với những loại kháng sinh này không cao như
một số nước châu Á. Cụ thể, tại Canada, Michell L. Sill và cộng sự nghiên
cứu mức độ nhạy cảm với kháng sinh của Hi gây nhiễm trùng xâm hại ở nước
này, cho thấy 44% các chủng Hib đề kháng với ampicillin và 5,56% đa kháng

với ampicillin, chloramphenicol và cotrimoxazole [32]. Thêm vào đó, nghiờn
cứu của Marina Cerquetti và cộng sự tại Ý về mức độ nhạy cảm với kháng
sinh của các chủng Hi phân lập được từ bệnh nhiễm trùng xõm hại cũng đưa
ra được tỷ lệ Hi đề kháng với ampicillin là 10,2%; chloramphenicol là 1,7%
[14].
Một số nghiên cứu gần đây tại châu Á, châu Âu, Mỹ, Canada cho thấy,
sulbactam/ampicilin, ceftriaxon, cefaclor, cefotaxim, cefpodoxim,
meropenem, levofloxacin, rifampicin, azithromycin, clarithromycin vẫn được
xem là những kháng sinh có độ nhạy cao (xấp xỉ 100%) đối với Hib [14],
[32], [47], [49]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Haghiashteiani MT và cộng sự tại
Iran cho thấy 19 chủng Hib phân lập được từ bệnh nhi viêm màng não mủ có
khả năng đề kháng cao với những loại kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin,
cụ thể 47% với cephalotin và 42% với ceftriaxon, ceftazidim, cefixim,
ceftizoxim, nhưng số chủng Hib đưa ra nghiên cứu cũn quỏ thấp (19 chủng)
nên tỷ lệ đưa ra có thể chưa chính xác.
17
Chương II
MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÁT HIỆN HAEMOPHILUS
INFLUENZAE TYP B TRONG CHẨN ĐOÁN
VIÊM MÀNG NÃO MỦ TẠI PHềNG XÉT NGHIỆM
Hi là loại vi khuẩn khó nuôi cấy. Hi chỉ mọc trên môi trường giàu chất
dinh dưỡng có chứa đầy đủ hai yếu tố phát triển X (hemin), V (NAD hoặc
NADP) và không có khả năng mọc trờn cỏc môi trường thông thường. Vì
vậy, việc chẩn đoán viêm màng não do Hib chủ yếu được thực hiện ở bệnh
viện lớn và phương pháp nuôi cấy phân lập thường được áp dụng nhất ở Việt
Nam nên khả năng phát hiện căn nguyên vi khuẩn Hib rất thấp (khoảng 10%)
[6].
Hiện nay, ngoài phương pháp nuôi cấy phân lập truyền thống, những
phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao được áp dụng để phát
hiện Hib trong chẩn đoán viêm màng nóo. Tuy nhiờn, các phương pháp hiện

đại có thể giúp chẩn đoán nhanh Hib gây bệnh, nhưng lại gặp những hạn chế
là không xác định được mức độ nhạy cảm với kháng sinh nên phương pháp
truyền thống vẫn song hành cùng những phương pháp chẩn đoán hiện đại.
2.1. Phương pháp nuôi cấy phân lập và xác định vi khuẩn Hib
2.1.1. Phương pháp nuôi cấy phân lập và xác định vi khuẩn Hib từ bệnh
phẩm dịch não tủy [15]
2.1.1.1. Bệnh phẩm
Lấy bệnh phẩm dịch não tủy (DNT) phải được thực hiện bởi bác sĩ
chuyên khoa có kinh nghiệm trong điều kiện và thủ thuật vô trùng. Trong
trường hợp nghi ngờ bệnh nhân viêm màng não, DNT là bệnh phẩm tốt nhất
được sử dụng cho phân lập hoặc phát hiện căn nguyên gây bệnh. Lấy dịch não
18
tủy nên chỉ sử dụng cho việc chẩn đoán và được cấy trực tiếp vào cả hai đĩa
thạch nuôi cấy (01 đĩa thạch máu và 01 đĩa thạch chocolate).
Phương pháp chọc dò tủy sống:
- Dụng cụ:
+ Gạc vô trùng, băng dính, cồn Iod sát khuẩn và găng tay vô trùng,
khẩu trang. Bút viết kính.
+ Kẹp kocher, 01 bơm kim tiêm 10ml (kim cỡ 22 gauge/3,5” đối với
người lớn và 23 gauge/2,5” đối với trẻ em.
+ Ống nghiệm sạch vô trùng có nắp đậy (hoặc ống môi trường Trans-
Isolate nếu DNT không được xét nghiệm ngay)
- Quy trình lấy bệnh phẩm:
/ Đánh dấu ống nghiệm sẽ đựng dịch não tủy hoặc ống môi trường vận
chuyển.
/ Bệnh nhân nên được bất động, hoặc ngồi dậy hoặc nằm nghiêng về
một bên, với lưng của bệnh nhân cong về phía trước sao cho đầu gần như
chạm đầu gối trong suốt quá trình lấy bệnh phẩm.
Hình 2.1: Tư thế bệnh nhân nằm để lấy bệnh phẩm DNT
/ Sát trùng dọc cột sống cho đến giữa 2 mào chậu bằng cồn 70

o
để làm
sạch bề mặt da và loại bỏ chất bã nhờn. Sau đó sát khuẩn tiếp bằng cồn Iod
hoặc povidone-iodine. Để khô.
19
/ Đeo găng tay vô trùng.
/ Xác định vùng giữa đốt sống thắt lưng L3–L4.
Hình 2.2: Vị trí chọc hút bệnh phẩm DNT
/ Chọc kim hướng vào giữa hai mỏm gai xuyên qua dây chằng vào
khoảng (kênh) chứa DNT, lấy ít nhất 1ml và nhiều nhất là 3- 4ml (nếu có thể)
và cho vào ống nghiệm sạch vô trùng có nắp đạy.
Hình 2.3: Cách chọc kim tiêm để lấy bệnh phẩm DNT
- Vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm
Ngay sau khi được lấy, bệnh phẩm nên được đưa ngay đến phòng xét
nghiệm vi sinh để tiến hành các kỹ thuật chẩn đoán càng sớm càng tốt (trong
vòng 1 giờ sau khi lấy bệnh phẩm). Không được để DNT bị ánh sáng trực tiếp
chiếu vào hoặc để nhiệt độ quỏ núng hay quá lạnh. Nếu bệnh phẩm không thể
vận chuyển sớm về phòng xét nghiệm thì có thể bơm bệnh phẩm DNT vào
môi trường T-I (Trans-Isolate medium) và để qua đêm ở nhiệt độ 35
o
C. T-I là
môi trường hai pha, rất thuận tiện cho nuôi cấy nguyên thủy N. meningitidis
20
và các loại vi khuẩn gây bệnh khác có trong bệnh phẩm DNT hay bệnh phẩm
máu.
Hình 2.4: Môi trường vận chuyển T-I (Trans-Isolate medium) [15]
2.1.1.2. Nhuộm gram bệnh phẩm DNT
Một phương pháp chẩn đoán sơ bộ Hib cũng như các vi khuẩn khỏc
gõy VMN có thể thực hiện bởi kỹ thuật nhuộm gram từ cặn dịch não tủy hoặc
bằng cách phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong DNT bởi kỹ thuật

ngưng kết hạt latex (sẽ đề cập ở phần sau). Kết quả dương tính khi một trong
hai kỹ thuật này cho thấy bằng chứng nhiễm trùng, thậm chí nuôi cấy có thể
thất bại.
- Tiến hành ly tâm dịch não tủy 20 phút với tốc độ 2000 vũng/ phỳt.
- Dùng pippett nhỏ giọt sạch vô trùng hút nước nổi chuyển sang một
ống nghiệm sạch vô trùng có nắp đạy.
- Tiến hành nhuộm gram một tiêu bản từ cặn bệnh phẩm DNT vừa ly
tâm. Để khô tiêu bản.
- Soi tiêu bản ở vật kớnh ì 100 để tìm vi khuẩn gây bệnh. Nếu trên tiêu
bản xuất hiện các trực khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình thái (có thể ở dạng cầu
21
trực khuẩn, trực khuẩn hoặc mảnh dài như sợi chỉ) thì đõy là dấu hiệu gợi ý
quan trọng định hướng chẩn đoán VMN do Hib.
22
Dịch não tủy
Thời gian vận chuyển
về phòng thí nghiệm
≤ 1 h
Thời gian vận chuyển
về phòng thí nghiệm
> 1 h
≤ 1 h
> 1 h
Ly tâm dịch não
tủy 2000 vòng/
phút × 20 phút
Cấy vào
môi trường T-I
Ủ ở 35
o

C
5- 10% CO
2
Nước nổi
Cặn
Ngưng kết
hạt latex
Nhuộm
Gram
Cấy lên thạch
chocolate
Cấy lên thạch
chocolate
Sơ đồ 2.1: Quy trình xét nghiệm chẩn đoán bệnh phẩm dịch nóo tủy
[15]
Hình 2.5: Hình thể của H. influenzae typ b trên tiêu bản nhuộm gram
dịch não tuỷ dưới kính hiển vi quang học.
2.1.1.3. Nuôi cấy
Hình 2.6: Hình ảnh khuẩn lạc Streptococcus pneumoniae (1) và
Haemophilus influenzae typ b (2)
23
(1)
(2)
Lấy đầy một ăng cặn bệnh phẩm nuôi cấy vào môi trường thạch
chocolate có bổ sung IsoVitalex. Ủ ở 37
o
C với khí trường 5% CO
2
khoảng 18-
24 giờ.

Nếu có khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch chocolate sau khi ủ, quan sát hình
thái, khuẩn lạc của Hib thường có đặc điểm: khuẩn lạc có kích thước 1,0-1,5
mm sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu vào và khụng gõy tan
máu. Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng
đặc biệt (hăng indole).
2.1.1.4. Xác định
- Nhuộm gram: khuẩn lạc vi khuẩn nuôi cấy được trên đĩa thạch
chocolate từ dịch não tủy, nhận thấy trên tiêu bản có các trực khuẩn gram (-)
nhỏ, đa hình thái (có thể ở dạng cầu trực khuẩn, trực khuẩn hoặc mảnh dài
như sợi chỉ)
- Tiến hành thử nghiệm xác định nhu cầu đòi hỏi 2 yếu tố phát triển X
và V:
+ Thử nghiệm X, V dương tính.
+ Hoặc thử nghiệm “Vệ tinh” với chủng S. aureus ATCC cho kết quả
dương tính.
24
Hình 2.7: Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV, cho thấy vi
khuẩn đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X và V cho sự phát triển.
Hình 2.8: Thử nghiệm "vệ tinh" dương tớnh
- Tiến hành định typ huyết thanh để xác định Hib bằng kháng huyết
thanh mẫu [14].
25
(+)
(-)